基于羧基化石墨烯-海藻酸鈉復(fù)合材料的脫落酸電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建及應(yīng)用

董宏圖 周思蒙 王清濤 王成 羅斌 李愛學(xué)

摘要：脫落酸（Abscisic Acid ，ABA ）是一種重要的植物激素，在種子和芽休眠、器官大小控制、植物衰老和死亡等發(fā)育過程中發(fā)揮作用，同時調(diào)控植物的生物與非生物脅迫。為快速、準確地測定植物體內(nèi) ABA 的含量，本研究開發(fā)了一種新型的 ABA 免疫傳感器。通過在電極表面修飾羧基化石墨烯（ GR-COOH ）及海藻酸鈉（Sodium Alginate ， SA ）來增加抗體的固定量，從而提高傳感器的檢測性能。對 GR-COOH 、SA、 ABA 抗體的濃度進行了優(yōu)化，根據(jù) ABA 抗體和抗原的結(jié)合導(dǎo)致電極阻抗發(fā)生變化的原理，實現(xiàn)了 ABA 的檢測。傳感器在10 pmol/L～1μmol/L 范圍內(nèi)與 ABA 濃度呈線性關(guān)系，實測的檢測下限為10 pmol/L ，具有較好的穩(wěn)定性和選擇性。進一步以感染柑橘黃龍病的臍橙為研究對象，通過制備的基于 GR-COOH-SA 復(fù)合材料的 ABA 免疫傳感器檢測了黃龍病菌侵染下臍橙葉片中 ABA 的含量變化。結(jié)果表明，臍橙感染黃龍病后，葉片中 ABA 的含量增加，從而表明 ABA 在植物的抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。進一步研究了 ABA 合成途徑中關(guān)鍵酶的基因CitZEP表達量的變化，植株感病后基因表達量升高，傳感器測得的 ABA 含量升高與傳感器的檢測結(jié)果相符，表明基于 GR-COOH-SA 復(fù)合材料的 ABA 免疫傳感器具有較好的實用性。

關(guān)鍵詞：脫落酸;免疫傳感器;電化學(xué);黃龍病;羧基化石墨烯;抗體

中圖分類號：TP212;TN702;TP216????? 文獻標志碼：A? ??????????????文章編號：SA202202007

引用格式：董宏圖， 周思蒙， 王清濤， 王成， 羅斌， 李愛學(xué).基于羧基化石墨烯-海藻酸鈉復(fù)合材料的脫落酸電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建及應(yīng)用[J].智慧農(nóng)業(yè)（中英文）， 2022， 4（1）：110-120.

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1 引言

脫落酸（ Abscisic Acid ，ABA ）作為一種重要的植物激素，主要負責(zé)調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育[1]，調(diào)控植物果實發(fā)育成熟[2]，抑制整株植物或單個器官的生長[3]。在受到不利環(huán)境因素影響后，ABA 可對下游基因進行有效地控制，進而對環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)性。ABA 在植物抗病反應(yīng)過程中也具有重要作用，可作為直接或間接信號參與到植物的抗性反應(yīng)中[4]。研究表明 ABA 可通過促進植物氣孔關(guān)閉，阻斷許多病原體的侵入[5]。因此，研究植物感病后體內(nèi) ABA 的含量變化對于研究植物的抗病反應(yīng)非常重要。傳統(tǒng)植物激素測定方法有生物鑒定法[6] 、免疫法[7]、光譜法[8，9]等。當(dāng)前常用的檢測方法有超高效液相色譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography， UPLC ）、高效液相色譜（High Performance Liq‐ uid Chromatography ， HPLC ）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid Chromatograph Mass Spectrome‐ ter/ Mass Spectrometer ，LC-MS/MS ）等，但是這些檢測方法操作比較復(fù)雜，并且需要大型的儀器，因此需要建立一種簡單、靈敏、快速的植物體內(nèi) ABA含量的檢測方法。

電化學(xué)傳感器具有靈敏度高、操作方便、檢測快速等優(yōu)點，受到了廣泛青睞[10， 11]。Li 等[12]提出了基于納米金修飾膜構(gòu)建的 ABA 阻抗型免疫傳感器，檢測范圍1.89～1.89×104 nmol/L ，檢測下限達到0.378 nmol/L 。李巍等[13]研制出一種基于納米金/硫堇修飾金電極的 ABA安培免疫傳感器，該傳感器基于 H2O2-HRP-硫堇催化波體系構(gòu)建，檢測范圍1.89～3.78×103 nmol/L ，檢測下限達到0.756 nmol/L 。而植物體內(nèi) ABA 含量甚微，一般在10～50 ng/g. FW ，且在逆境下含量會迅速增多[14]。因此，為了能夠更準確地檢測植物體內(nèi) ABA 含量變化，需要進一步研發(fā)檢測下限更低、檢測范圍更寬的 ABA傳感器。

石墨烯（Graphene ， GR ）是一種優(yōu)良的二維納米材料，具有獨特的片層結(jié)構(gòu)，從而具有較大的比表面積，廣泛應(yīng)用于傳感器領(lǐng)域。羧基化的石墨烯（ GR-COOH ）具有較多的羧基，因而更有利于下一步對 ABA 抗體的修飾。海藻酸鈉（Sodium Alginate ，SA ）是一種天然的線性多糖，具有較好的生物相容性、穩(wěn)定性及一定的粘附性，并且其上帶有大量的羧基可用于交聯(lián)抗體[15]。為了增加抗體的固定量，本研究通過 GR- COOH 和 SA 的復(fù)合材料來修飾電極，并通過碳二亞胺（ Carbodiimide ，EDC ）/羥基丁二酰亞胺（ N-Hydroxy Succinimide ，NHS ）交聯(lián) ABA 的單克隆抗體，進而制備 ABA 免疫傳感器[16-19]。利用電化學(xué)阻抗法進行 ABA 的檢測。然后利用研制的傳感器對感染柑橘黃龍病的臍橙葉片中的 ABA 含量進行了檢測，為快速、準確獲取植物體內(nèi) ABA含量提供了檢測方法。

2 材料與方法

2.1化學(xué)品和材料

GR-COOH 購自納米材料科技有限公司（南京）; SA 、Nafion （全氟磺酸）、 ABA 、ABA-Antibody （脫落酸抗體）、 EDC 、NHS 、水楊酸、生長素、赤霉素、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸購自Sigma-Aldrich 公司（ 上海）;絲網(wǎng)印刷電極（Screen Printing Electrode ， SPE ）購自Xenslet生物科技有限公司;瓊脂糖、10， 000×GeneGreen核酸染料購自北京天根生化;2×Taq PCR Star‐Mix 、 DNA Marker D2000、StarSpin快速植物DNA 提取試劑盒購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司; RNA 提取試劑盒、PrimeScriptm? RT re‐agent Kit? （ Perfect Real Time ）、 TB Green? Pre‐mix Ex Taqm? II （ Tli RNaseH Plus ）購自 Takara 公司。試驗所用水均為超純水。

2.2電鏡表征

采用清華大學(xué)高分辨場發(fā)射掃描電子顯微鏡（ ZEISS ，SEM 500，德國），加速電壓15 kV ，獲得掃描電鏡 （Scanning? Electron? Microscope，SEM ）圖像。

2.3 ABA 免疫傳感器制作方法

ABA免疫傳感器使用絲網(wǎng)印刷電極（ SPE是傳統(tǒng)的三電極體系，由碳基工作電極和對電極，以及銀/氯化銀參比電極組成）制備，將不同濃度的 GR-COOH溶解在1 mL不同濃度 SA水溶液中，超聲波處理30 min ，之后添加0.5% Nafion溶液、20 mmol/L EDC 、50 mmol/L NHS 進行超聲處理，制得 GR-COOH-SA 復(fù)合材料。后將復(fù)合材料滴加到電極表面，室溫干燥。接著將ABA 抗體滴加到電極表面，自然干燥，然后將牛血清白蛋白（ Bovine Albumin ，BSA ）滴加在電極表面，封閉非特異性吸附位點。制作過程如圖1所示。

2.4電化學(xué)測量

試驗在 CHI760E 電化學(xué)工作站（上海，中國）進行。循環(huán)伏安法采用電壓為-0.2～0.6 V，掃描速率為0.05 V/s 。將制備好的傳感器在一定濃度的 ABA 溶液中孵育1 h ，用超純水仔細沖洗。然后將其浸入2 mmol/L 鐵氰化鉀溶液中，使用電化學(xué)阻抗方法 （Electrochemical Imped‐ance? Spectroscopy ， EIS ） 進行檢測，并通過Zview軟件擬合阻抗數(shù)據(jù)。

2.5柑橘培養(yǎng)及樣品制備

利用研制的傳感器對感染柑橘黃龍病的臍橙葉片中的 ABA 含量進行檢測。在2020年1月，選取感染柑橘黃龍病臍橙病芽條，利用貼接法對5株健康臍橙進行接菌處理。接菌6個月后進行癥狀分析。利用傳感器檢測臍橙葉片 ABA 步驟如下。

（1） DNA提取與檢測。選擇疑似帶菌臍橙，每株取1片中上部葉片，用剪刀取葉中脈，剪成1 mm 左右小段，放入2 mL 離心管中（加5 mm 鋼珠），液氮預(yù)冷之后，震蕩研磨2min ，利用十六烷基三甲基溴化銨法（Cetyltrimethylammoni‐ um Bromide ，CTAB ）[20]進行 DNA提取。根據(jù)文獻報道[21]，選取引物 A2/J5對疑似帶菌植株 DNA 進行聚合酶鏈式反應(yīng) （Polymerase Chain Reaction ，PCR ）檢測（表1），通過對退火溫度進行55～60℃階梯式擴增，最終選擇條帶特異性最好的58.5℃作為退火溫度，對 PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

（2） ABA 萃取。采集經(jīng) PCR 鑒定帶菌的臍橙葉片和健康臍橙葉片各取6片，其中健康葉片為對照，向研缽中加入液氮進行研磨，待葉片磨碎呈綠色粉末后，稱取1 g 粉末放入10 mL 離心管中，加入預(yù)冷的80%甲醇2 mL 充分攪拌，在4℃環(huán)境下萃取浸提6h ，進行脫落酸提取。完成后，向浸提液中加入1 mL 氯仿，旋渦震蕩10 s ，4℃、12，000 r/m離心5 min ，棄上清，溫室下氮氣吹干，用 5 mL 磷酸緩沖鹽溶液（ Phos‐phate Buffered Saline ，PBS ）（pH7.4）溶解樣品。

2.6臍橙總 RNA 提取與cDNA 合成

總 RNA的提取參考柱式法植物 RNA小量提取試劑盒（ TaKaRaMiniBEST Plant RNA Extrac‐tion Kit ）說明書。

cDNA 合成參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT Master Mix （ Perfect Real Time ）說明書，在RNase-free PCR 管中加入200 ng RNA ，2μL 5×PrimeScript RT Master Mix ，用 RNase-free ddH2O補至10μL 。反應(yīng)程序為： 37℃延伸15 min，85℃失活5 s 。加入90μL ddH2O 混勻，-20℃保存。

2.7實時熒光定量 PCR

選擇 ABA 合成過程關(guān)鍵基因玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因（ CitZEP ）進行熒光定量分析[22]，肌動蛋白（ Actin ）作為內(nèi)參基因。引物序列見表2（生工生物工程（上海）股份有限公司）。20?L反應(yīng)體系：? cDNA 模板2μ L ，2×Mix 10?L ，10?mol/L 上下游引物各1?L ， ddH2O 6?L 。反? 60℃退火1 min ，40個循環(huán)擴增，得到 Ct值。應(yīng)程序：95℃預(yù)變性15 min;94℃變性15 s;

3 試驗結(jié)果與討論

3.1修飾過程的形貌分析

利用 SEM 對 SPE 電極、GR-COOH-SA/SPE 電極、ABA-Ab/GR-COOH-SA/SPE 電極、BSA/ ABA-Ab / GR-COOH-SA /SPE電極形貌進行表征（圖1）。裸的 SPE電極（圖2（a）） 表面光滑干凈，無其它雜質(zhì)沉積。當(dāng)電極修飾上 GR-COOH-SA復(fù)合材料后（圖2（b）），在電極表面形成了一層致密的膜結(jié)構(gòu)。對傳感器進行抗體修飾后（圖2（c）），電極表面出現(xiàn)了大量均勻分布的顆粒，表明 ABA單克隆抗體已經(jīng)修飾在電極表面。進一步修飾了 BSA后（圖2（d）），電極表面出現(xiàn)一些類似島狀的結(jié)構(gòu)，可能是蛋白分子的增加導(dǎo)致發(fā)生了一定的聚集，從而表明 BSA 蛋白分子修飾在了電極表面。

3.2傳感器檢測ABA 的可行性分析

圖3是研究 ABA 免疫傳感器檢測實際場景，利用 GR-COOH/SPE 及 GR-COOH-SA/SPE 傳感器檢測 ABA可行性。

將 GR-COOH （1.25 mg/mL）及 GR-COOH-SA （ GR-COOH 1.25 mg/mL ， SA 1.25 mg/mL）修飾后的電極分別浸入10 nmol/L ABA 中，孵育1 h 后，檢測阻抗值的變化。結(jié)果表明，在10 nmol/L ABA孵育后，GR-COOH-SA/SPE電極檢測的Rct變化值△Z：

△Z=Z1-Z0??????????????????????????????????????????????? （1）

其中，Z1為電極與一定濃度 ABA 反應(yīng)后的阻抗值，Ω;Z0為電極修飾 BSA后的阻抗值，Ω。GR-COOH-SA/SPE 的△Z 約為 GR-COOH/SPE 電極的2.5倍，表明 GR-COOH與 SA兩種材料的組合使傳感器具有更強的檢測信號，可以提高傳感器的檢測性能，因此在后續(xù)試驗中選擇 GR-COOH-SA復(fù)合材料修飾電極（圖4（a））。

為檢測免疫傳感器是否制備成功，對傳感器制備過程中的每個修飾環(huán)節(jié)分別用循環(huán)伏安（Cyclic Voltammetry ， CV ）和 EIS 進行了表征。 CV 結(jié)果如圖4（b）所示，在 [ Fe（CN）6]3?/4?溶液中，與裸 SPE 電極相比（圖4（b）曲線 a），當(dāng)電極表面修飾上 GR-COOH-SA 復(fù)合材料后（圖4（b）曲線 b），氧化還原峰電流出現(xiàn)了下降，這可能是由于 GR-COOH-SA 復(fù)合材料導(dǎo)電性較差，抑制了探針分子的電子轉(zhuǎn)移。在孵育上 ABA 抗體后（圖4（b）曲線 c），氧化還原峰電流下降，這主要是由于抗體分子的絕緣性導(dǎo)致的，該結(jié)果表明抗體分子成功修飾在了電極表面。當(dāng) BSA （圖4（b）曲線 d）依次修飾在電極表面后，峰電流繼續(xù)減小。這主要是由于 BSA 蛋白分子的絕緣性導(dǎo)致的，從而表明了 BSA 分子的成功修飾。修飾過程的阻抗圖譜如圖4 （c）所示，其結(jié)果可以通過擬合電路進行擬合圖4（c）。在電極表面修飾 GR-COOH-SA 復(fù)合材料后（圖4（c）曲線 b），與裸電極相比（圖4 （c） 曲線 a ， 317.3Ω），阻抗值增加到352.7Ω，這主要是由于 GR-COOH-SA 復(fù)合材料導(dǎo)電性較差所致;添加 ABA 單克隆抗體后（圖4（c）曲線 c），由于抗體分子不導(dǎo)電，電極的阻抗顯著增加，為526Ω;進一步加入 BSA蛋白后 （圖4 （c） 曲線 d），阻抗進一步增加到607.1Ω。EIS 的結(jié)果與 CV 一致，都證明了傳感器的成功構(gòu)建。

3.3制備優(yōu)化

為使免疫傳感器具有更好的檢測性能，對 GR-COOH 濃度、SA 濃度、ABA 抗體濃度等進行了優(yōu)化。復(fù)合材料中選擇濃度范圍為0.75～1.75 mg/mL 的 GR-COOH 進行了優(yōu)化，利用10 nmol/L ABA 檢測優(yōu)化的效果。如圖5（a）所示，? SPE 工作電極在 GR-COOH 濃度范圍為0.75～1.5 mg/mL時，△Z持續(xù)增加，到1.5 mg/mL 時△Z達到最大。1.5 mg/mL后 GR-COOH濃度進一步增加，△Z 變化趨于穩(wěn)定。因此1.5 mg/mL為 GR-COOH最佳濃度。

為研究 SA 的最佳濃度，試驗中分別測試了免疫傳感器在含有不同濃度 SA 的混合物修飾后的阻抗變化。選擇 SA 的濃度范圍為0.75～1.75 mg/mL 。將5種不同濃度 SA 分別添加在混合修飾物中充分混勻。 SA 濃度范圍在0.75～1 mg/mL 時（圖5（b）），隨著濃度升高△Z呈明顯增加趨勢，到1 mg/mL時△Z達最大。1 mg/mL后， SA濃度進一步增加，△Z明顯下降。因此，選擇1 mg/mL為 SA的使用濃度。

ABA 抗體濃度的大小會對響應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生影響。試驗中對 ABA 抗體濃度進行了優(yōu)化。選擇ABA抗體濃度范圍為0.2～0.6 mg/mL ，分別將不同濃度的抗體滴加在工作電極表面。如圖5（c）所示，△ Z 隨著 ABA 抗體濃度增加而增大。0.5 mg/mL 時△Z 達到最大。進一步增加抗體濃度，△Z減小?？赡苁请姌O表面抗體達到了平衡或飽和狀態(tài)，不能容納更多的抗體。據(jù)此認為0.5 mg/mL 為制備 ABA 免疫傳感器的最佳抗體濃度。

3.4檢測性能測試

依次用不同濃度的 ABA 與修飾后的電極反應(yīng)，然后進行阻抗測試。圖6（a）顯示免疫傳感器的△Z隨著 ABA 孵育濃度的增加而不斷升高。圖6（a）插圖為取其中一段的放大圖。當(dāng) ABA孵育濃度范圍在10 pmol/L～1μmol/L 時，該傳感器的阻抗值變化與 ABA 的濃度呈線性相關(guān)（圖6（b）），線性方程為：

y =103.46x+480.73????????????????? （2）

其中，R2=0.99927。檢測下限的實測結(jié)果為10 pmol/L。

比較文獻報道中的多種方法與本研究制備的傳感器的結(jié)果（表3），發(fā)現(xiàn)本研究制備的 ABA免疫傳感器檢測限較低，線性范圍較寬，其檢測性能獲得了進一步提高。

ABA檢測中，可能會存在其它物質(zhì)的干擾。因此，對該傳感器的選擇性進行了測試。選擇水楊酸、生長素、赤霉素、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸和 ABA 分別用于與本研究制備的 ABA免疫傳感器反應(yīng)。如圖7所示，相同濃度下（10 nmol/L）， ABA 產(chǎn)生的阻抗響應(yīng)顯著高于其他干擾物質(zhì)。表明該免疫傳感器具有較高的選擇性。

在同等條件下應(yīng)用等濃度的 ABA 溶液對該傳感器進行多次實驗，以檢測該傳感器的重現(xiàn)性。 5根 ABA 免疫傳感器的相對標準偏差（ Relative? Standard? Deviation ， RSD ） 為4.87%（圖8（a））。在4℃條件下儲存兩周后，該傳感傳感器非常穩(wěn)定。

3.5感染柑橘黃龍病臍橙植株葉片中 ABA 的含量檢測

3.5.1 臍橙植株接菌情況檢測

進行接菌的5株臍橙中，3 株臍橙葉片具有典型的沿葉脈間隙斑駁黃化，新生葉片較小的感染柑橘黃龍病特征，初步判定為疑似帶菌植株（圖9）。通過對疑似感病植株 DNA 進行 PCR 擴增、瓊脂糖凝膠電泳，在電泳圖700bp左右出現(xiàn)條帶，即確定該植株接菌成功，如圖10所示。植株1、2成功感染黃龍病菌，因此選定植株1、2作為后續(xù)試驗樣本。

用制備的 ABA 傳感器對經(jīng)過預(yù)處理的感染柑橘黃龍病的臍橙植株及健康植株葉片的勻漿液進行阻抗試驗，每組三個重復(fù)，結(jié)果如圖11所示。健康葉片的△Z 為72 ohm ，染病葉片的△Z為823 ohm 。將兩次△Z 值代入標準曲線可得感病葉片中 ABA 的含量為10 nmol/L ，而健康葉片中△Z 太小，超出檢測范圍，不能計算出其含量。表明臍橙葉片受到病害侵染后，體內(nèi)脫落酸水平呈上升趨勢，此結(jié)果與之前的報道一致[27]。

本研究是第一次使用電化學(xué)傳感器對柑橘黃龍病害中 ABA 的含量水平進行檢測，表明 ABA 免疫傳感器具有較大實際應(yīng)用潛力。

3.5.2 可靠性試驗

為驗證試驗結(jié)果的可靠性，從分子角度研究植物感病后對體內(nèi) ABA 合成的影響，本試驗分別對健康及感病臍橙葉片進行取樣、RNA提取、 cDNA 合成，通過熒光定量 PCR 檢測 ABA 合成途徑中重要酶基因CitZEP在正常及感病狀態(tài)下的表達量，如圖12所示。結(jié)果表明，健康臍橙基因CitZEP的表達量為1.003，受到柑橘黃龍病的影響，感病臍橙葉片內(nèi) ABA 的CitZEP基因在病菌脅迫下表達量提高，基因CitZEP的表達量達到1.332，表明病菌脅迫提高了 ABA合成關(guān)鍵酶基因CitZEP的表達?？赡苡纱艘鹆?ABA含量的增加。表明 ABA 參與了臍橙感染黃龍病的過程，但具體的作用機制有待進一步研究。

此結(jié)果與通過構(gòu)建測的傳感器測得柑橘感染黃龍病后 ABA含量增加的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究研制的 ABA 電化學(xué)免疫傳感器，利用 GR-COOH-SA 復(fù)合材料修飾增強了傳感器檢測信號強度，通過對 GR-COOH濃度、SA濃度、 ABA 抗體濃度進行了優(yōu)化，提高了免疫傳感器的檢測性能。

該傳感器的線性范圍較寬 （10 pmol/L～1μmol/L），檢測限較低（10 pmol/L），具有較高的選擇性及穩(wěn)定性。

利用制備的該傳感器對感染柑橘黃龍病臍橙樣本葉片 ABA 含量進行了檢測，為快速獲取病害侵染后植物體內(nèi) ABA含量提供了新手段。

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Construction and Application of A Novel Abscisic Acid Electrochemical Immunosensor Based on CarboxylatedGraphene-Sodium Alginate Nanocomposite

DONG Hongtu1 ， ZHOU Simeng1，2 ， WANG Qingtao2 ， WANG Cheng1 ， LUO Bin1 ， LI Aixue1*

（1. Research Center of Information Technology， Beijing Academy of Agriculture and Foreatry Sciences， Beijing100097， China;2. College of Landscape and Ecological Engineering， Hebei University of Engineering， Handan056038， China ）

Abstract： Abscisic acid （ABA） is an important plant hormone， which can control seed and bud dormancy， organ size control， se‐nescence and death， and participate in both biological and abiotic stress， inhibit plant growth， and participate in plant disease re‐sistance. In order to determine the content of ABA in plants quickly and accurately， a new type of ABA immunosensor was de‐veloped. To improve the detection performance of the sensor， the detection performance of the sensor was increased by modify‐ing GR-COOH and SA on the electrode surface. The concentration of GR-COOH ， SA， and ABA-Antibody were optimized， the optimal conditions for the three materials were 1.5 mg/ml， 1.25 mg/ml and 0.5 mg/ml. The immunosensor was constructed based on the electrode impedance changes （△Z ）due to the binding reaction of ABA antibody and antigen . It was found that the sensor showed linear relationship with ABA in the response range of 10 pmol/L～1μmol/L， R2 was 0.99927， and the detec‐tion limit was about 10 pmol/L. The sensor also had good selectivity and stability. Using the electrochemical immunosensor， the content of ABA in navel orange leaf that have been successfully inoculated with citrus Huanglongbing by PCR was determined， and healthy plants were used as control. The test results showed that the impedance changes（△ Z ） of healthy leaves and dis‐ eased leaves were 72 and 823， respectively， which indicated that the level of ABA in the infected plants increased significantly. The sensor provides a tool for the detection of plant hormone levels under disease stress. The results showed that the content of ABA increased in the leaves of navel orange infected by citrus Huanglongbing， which indicated that ABA played an important role in plant disease resistance. Furthermore， the changes of gene expression of key enzymes CitZEP in ABA synthesis pathway were studied， The results showed that the expression of CitZEP increased in plants infected with Huanglongbing disease， and the results were consistent with the detection results of the sensor， which indicated that the sensor had good practicability.????? Key words： abscisic acid; immunesensor; electrochemical; Huanglongbing; GR-COOH; antibody