大腸菌群的檢驗(yàn)方法及標(biāo)準(zhǔn)的理解

李朝國(guó) 張麗娜

大腸菌并不是一個(gè)細(xì)菌學(xué)分類(lèi)的名字，并不代表某一個(gè)或某一屬的細(xì)菌，而是指具有一部分特征的一組與糞便污染相關(guān)的細(xì)菌，包含的細(xì)菌種類(lèi)較多，有檸檬酸桿菌、大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣克雷伯氏菌以及陰溝長(zhǎng)桿菌等，但這一些細(xì)菌在生化或血清學(xué)方面并不完全一致。

這些細(xì)菌的出現(xiàn)表示某一物品受到污染，例如在食品中檢驗(yàn)出大腸菌群則表示該食品已經(jīng)受到人或溫血?jiǎng)游锏募S便污染，其中最常見(jiàn)的是大腸桿菌，這一細(xì)菌屬于近期污染，而其他的菌屬則歸為陳舊污染。為保證群眾食品等的安全則需要加強(qiáng)對(duì)大腸菌群的檢驗(yàn)，那么大腸菌群如何檢驗(yàn)?zāi)?？檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)是什么呢？下面對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行敘述。

大腸菌群檢測(cè)的意義是什么

糞便是動(dòng)物的腸道排泄物，其中可帶有致病菌，常會(huì)出現(xiàn)腸道致病菌，因此食物中出現(xiàn)糞便污染時(shí)則提示該食品存在腸道致病菌污染的可能性，潛伏食物中毒及流行病的威脅。

大腸菌群是一種革蘭氏染色陰性，無(wú)芽孢桿菌，能夠在EMB瓊脂上出現(xiàn)典型的菌落，呈深紫黑色或中心深紫色，表面光滑且有金屬光澤。大腸菌群是一群需氧或兼性厭氧，能夠在常溫37℃的環(huán)境下分解出乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的革蘭氏染色陰性無(wú)芽孢桿菌，能夠在生活飲用水、食品等的物質(zhì)中檢出。

大腸菌群中主要以埃希氏菌屬為主，埃希氏菌屬為典型的大腸桿菌，大腸桿菌都是直接或間接來(lái)自人或溫血?jiǎng)游锏募S便，部分大腸菌群來(lái)自典型大腸桿菌排出體外7～30 d后在環(huán)境中變異。大腸菌群的分布范圍較廣，除溫血?jiǎng)游锛S便外，在自然界環(huán)境中也廣泛存在，多項(xiàng)研究調(diào)查表明，大腸菌群也可存在于人類(lèi)、溫血?jiǎng)游锝?jīng)?；顒?dòng)的場(chǎng)所中，是導(dǎo)致社會(huì)腸道傳染性疾病流行的主要原因之一，分辨中以大腸桿菌為主，而外界環(huán)境中則主要以大腸菌群及其他類(lèi)別為主。

對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)主要是為了判斷食品是否受到糞便的污染，同時(shí)加強(qiáng)食品在生產(chǎn)加工、運(yùn)輸及保存過(guò)程中的衛(wèi)生狀態(tài)。通過(guò)控制食品安全質(zhì)量從而降低社會(huì)中的腸道傳染性疾病發(fā)生率。最初大腸菌群是作為腸道致病菌因此常使用于水質(zhì)的檢驗(yàn)中，隨著多年研究的不斷深入，目前大腸菌群已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外多個(gè)國(guó)家廣泛使用的作為食品衛(wèi)生質(zhì)量檢驗(yàn)的指示菌。檢驗(yàn)大腸菌群的意義在于作為食品被糞便污染的指示菌，制藥食品中糞便含量在10～30 mg/kg即可檢出大腸菌群。

大腸菌群的檢驗(yàn)方式

目前，我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)最常見(jiàn)的大腸菌群檢驗(yàn)方式包括三步法檢驗(yàn)，即乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、分離培養(yǎng)及證實(shí)試驗(yàn)。

①乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：檢驗(yàn)方式為將所需檢驗(yàn)的樣品稀釋完成后選擇不同的三個(gè)稀釋度，每一個(gè)稀釋度連接三管乳糖膽鹽發(fā)酵管，并將其放置在37℃的溫度下保存兩天，觀察是否產(chǎn)氣以判斷是否受到大腸菌群污染。

②分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種與伊紅美藍(lán)瓊脂平板上在37℃的溫度下保存一天，隨后觀察菌落的形態(tài)，根據(jù)形態(tài)的變化判斷是否存在大腸菌群污染。

③證實(shí)試驗(yàn)：該種方式主要是挑選平板中可疑的菌落用革蘭氏染色觀察，并接種乳糖發(fā)酵管在37℃的溫度下保存一天，觀察產(chǎn)氣情況。

原國(guó)家商檢局制定的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)主要是采取美國(guó)的FDA檢驗(yàn)方式，用兩步法，包括推測(cè)試驗(yàn)及證實(shí)試驗(yàn)。

①推測(cè)試驗(yàn)：將所需檢驗(yàn)的樣品稀釋后選擇3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度需接種三觀的LST肉湯，并在37℃的溫度下保存兩天，觀察是否出現(xiàn)產(chǎn)氣的現(xiàn)象。

②證實(shí)試驗(yàn)：將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽肉湯管，在37℃的溫度下保存兩天，觀察是否產(chǎn)氣，以煌綠乳糖膽鹽產(chǎn)氣作為陽(yáng)性。

ATP熒光檢測(cè)儀

ATP熒光檢測(cè)儀是一種在螢火蟲(chóng)發(fā)光原理的基礎(chǔ)上快速檢驗(yàn)的技術(shù)，能夠清晰的表明檢驗(yàn)樣本中微生物及其他生物的殘余量，從而判斷該食品的衛(wèi)生質(zhì)量。螢火蟲(chóng)會(huì)發(fā)光是由于螢火蟲(chóng)本身能夠?qū)⒒瘜W(xué)物質(zhì)的化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽艿纳锎呋瘎?，這種催化劑稱(chēng)之為螢火蟲(chóng)熒光素酶，同時(shí)還能夠產(chǎn)生蟲(chóng)熒光素以及三磷酸腺苷，在有氧的條件下蟲(chóng)光素酶催化蟲(chóng)熒光素能夠與ATP產(chǎn)生氧化反應(yīng)，因此能夠形成氧化熒光素發(fā)出熒光，協(xié)助臨床檢驗(yàn)。

可見(jiàn)，只需要具備適當(dāng)?shù)臈l件，當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中蟲(chóng)光素酶和蟲(chóng)熒光素過(guò)量時(shí)，熒光的強(qiáng)弱直接取決于ATP的數(shù)量，而在大腸菌群的檢驗(yàn)中，以檢驗(yàn)的細(xì)菌樣品為例，當(dāng)檢驗(yàn)樣本中的細(xì)菌細(xì)胞越多時(shí)，ATP的量越高，同時(shí)發(fā)出的熒光也就更強(qiáng)。這主要是由于蟲(chóng)光素酶對(duì)ATP的反應(yīng)較靈敏，熒光強(qiáng)弱能夠通過(guò)熒光劑在10～15s的時(shí)間內(nèi)計(jì)算。因此，在排除樣品中非細(xì)菌ATP干擾的狀態(tài)下，通過(guò)熒光值就能夠確定樣品中細(xì)菌ATP的含量，以確定大腸菌群的數(shù)量。

但在檢驗(yàn)過(guò)程中需要注意的是，在檢驗(yàn)完成后需將微量熒光檢測(cè)儀做適當(dāng)?shù)那鍧嵰员苊庀麓问褂脵z驗(yàn)時(shí)污染。同時(shí)，在使用檢驗(yàn)前應(yīng)套上無(wú)菌移液管尖，使用移液器吸取或轉(zhuǎn)移試劑、樣品時(shí)務(wù)求準(zhǔn)確，避免移液器與樣品或試劑出現(xiàn)交叉污染現(xiàn)象。另外，在完成檢驗(yàn)后應(yīng)立即取下過(guò)濾比色杯，在未取下前應(yīng)避免晃動(dòng)或倒置，避免微量熒光檢驗(yàn)儀內(nèi)試劑濺出后污染光學(xué)部件。

結(jié)論

大腸菌群并不作為單個(gè)細(xì)菌存在，而是衛(wèi)生細(xì)菌一組的分類(lèi)用語(yǔ)，也是作為糞便污染指標(biāo)菌提出的，因此大腸菌群主要是用于檢驗(yàn)食品中是否出現(xiàn)糞便污染。同時(shí)，大腸菌群數(shù)量的高低也直接表明了食品被污染的嚴(yán)重程度，反應(yīng)出了對(duì)人體健康危害性的大小，因此必須加強(qiáng)對(duì)大腸菌群的檢驗(yàn)。而ATP熒光檢測(cè)儀在大腸菌群的檢驗(yàn)中具有較高的檢出率，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)檢出，檢驗(yàn)過(guò)程中可能受到外界的影響因素較少，更有利于相關(guān)機(jī)構(gòu)對(duì)腸道傳染性疾病的控制。