鑲嵌蒙脫石微球處方前研究及其制備

張初梅，劉　莉，侯冬枝*，胡　晟，桂茹藝，黃　燚，平其能

(1.廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣州　510006；2.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室，南京210009)

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鑲嵌蒙脫石微球處方前研究及其制備

張初梅1，劉莉1，侯冬枝1*，胡晟1，桂茹藝1，黃燚1，平其能2

(1.廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣州510006；2.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室，南京210009)

摘要：目的對鹽酸倍他洛爾(betaxolol hydrochloride，BH)進(jìn)行處方前研究，并以丙烯酸樹脂為膜材制備載藥蒙脫石/丙烯酸樹脂微球。方法采用UV和HPLC法考察藥物BH的穩(wěn)定性、表觀溶解度、pKa值、親水親油平衡值以及pH值對BH 離體角膜透過性的影響；以丙烯酸樹脂RS和RL為骨架材料，O1/O2乳化-溶劑揮發(fā)法制備蒙脫石載藥緩釋微球，掃描電鏡觀察其形態(tài)表征，為處方優(yōu)化提供依據(jù)。結(jié)果 BH穩(wěn)定性良好，在各種溶液中的溶解度為16.30～42.27 mg·mL-1。BH為弱堿性藥物，pKa值為7.75，角膜透過性受pH值影響，堿性條件下有利于BH的角膜透過。O1/O2乳化-溶劑揮發(fā)法制備的微球外形圓整，無粘連情況，表面略有粗糙感。結(jié)論處方前研究建立的UV-VIS分析方法準(zhǔn)確可靠。O1/O2乳化-溶劑揮發(fā)法可用于制備鑲嵌蒙脫石離子交換給藥系統(tǒng)。

關(guān)鍵詞：鹽酸倍他洛爾；角膜透過性；蒙脫石；微球

鹽酸倍他洛爾(betaxolol hydrochloride，BH)是一種選擇性β1受體阻滯劑，具有鈣離子拮抗作用，可通過減少房水的生成起到降眼壓的作用。BH眼用劑型貝特舒，臨床主要用于治療開角型青光眼和高眼壓癥。蒙脫石是天然硅酸鹽礦石膨潤土的主要成分，具有良好的膨脹性、吸附性、陽離子交換性及較大的內(nèi)、外比表面積。通過離子交換和吸附作用可以包載許多藥物分子，產(chǎn)生緩釋作用[1-4]。以丙烯酸樹脂為膜材[5-6]制備載有藥物的蒙脫石緩控釋微球，增加其緩釋效果，減小毒性和不良反應(yīng)，適應(yīng)眼用制劑要求。本實驗對BH做處方前的研究，同時考察藥物離體角膜透過性，為制劑的處方設(shè)計和工藝優(yōu)化提供基礎(chǔ)依據(jù)；并采用O1/O2溶劑揮發(fā)法制備蒙脫石載藥微球[7-8]。

1儀器與試藥

1.1儀器UV754N紫外分光光度計，pHS-25型pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；RCT安全型磁力攪拌器(德國IKA公司)；XW-80A渦旋機(jī)(上海瀘西分析儀器廠有限公司)；SHA-B恒溫震蕩器(常州博遠(yuǎn)實驗分析儀器廠)；BL-220H電子天平(日本島津公司)；LD4-2A低速離心機(jī)(金壇市宏華儀器廠)；E103G光學(xué)顯微鏡(德國Classica公司)；S-3400N電子掃描顯微鏡(日本HITACHI公司)。

1.2試藥鹽酸倍他洛爾原料藥(濟(jì)南浩化實業(yè)有限公司)；丙烯酸樹脂(eudragitRS，RL，德國Degussa公司)；醫(yī)用蒙脫石(浙江三鼎科技有限公司)；其他試劑均為色譜純或分析純。

1.3實驗動物新西蘭兔，體質(zhì)量2 300～2 800 g，雌雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證編號：4407207133，在潔凈環(huán)境下代為飼養(yǎng)。

2方法與結(jié)果

2.1測定BH特征吸收峰分別用水、1 mol·L-1的氯化鈉溶液、鹽酸溶液和磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)溶液配制成一定質(zhì)量濃度的BH溶液，過濾后，在200～500 nm處掃描，得到鹽酸倍他洛爾的特征吸收波長為274.5 nm。

2.2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線分別精密稱取10 mg BH原料藥8份，置于10 mL量瓶中，分別用水、人工淚液、0.5 mol·L-1的氯化鈉溶液、1.0 mol·L-1的氯化鈉溶液、2.0 mol·L-1的氯化鈉溶液、0.5 mol·L-1的氯化鉀溶液、0.5 mol·L-1的鹽酸溶液、磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)定容至刻度，得到1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)母液。

精密吸取0.2，0.4，0.8，1.2和1.6 mL的標(biāo)準(zhǔn)母液，置于10 mL量瓶中，用相應(yīng)溶劑稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.02，0.04，0.08，0.12和0.16 mg·mL-1的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。用溶劑作為空白溶液，在274.5 nm波長處用紫外分光光度計測定吸光度，建立不同溶劑中BH的標(biāo)準(zhǔn)曲線。見表1。

表1不同溶劑中BH的線性關(guān)系

Tab.1 The linear relationship of BH in different solvents

溶劑擬合方程r值水A=5.0418C-0.02170.9993人工淚液A=4.8732C-0.00480.99980.5mol·L-1氯化鈉溶液A=4.8154C+0.01060.99931.0mol·L-1氯化鈉溶液A=4.7673C-0.00160.99962.0mol·L-1氯化鈉溶液A=4.8173C+0.00980.99980.5mol·L-1氯化鉀溶液A=4.7173C+0.00840.99960.5mol·L-1鹽酸溶液A=4.8115C+0.00310.9998磷酸鹽緩沖液(pH7.4)A=4.8124C+0.01270.9995

2.3精密度分別在1 d內(nèi)的不同時間測定0.04，0.10和0.16 mg·mL-1BH水溶液的吸光度5次，考察日內(nèi)精密度。連續(xù)5 d測定上述樣品的吸光度，每天1次，考察日間精密度。測得日內(nèi)吸光度RSD值分別為0.69%，0.34%和0.21%；平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.38%，日間吸光度RSD值分別為0.49%，0.47%和0.21%。平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.58%，兩者RSD值均小于1%，說明紫外法測量BH的精密度符合要求。

2.4穩(wěn)定性按照2.2項下方法制備質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的BH標(biāo)準(zhǔn)母液，精密吸取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)母液，置于10 mL量瓶中，用相應(yīng)溶劑稀釋至刻度，得到0.10 mg·mL-1的BH標(biāo)準(zhǔn)溶液，在34 ℃恒溫中振蕩，每1 h取樣1次，測定BH含量，連續(xù)測定12 h，按照2.2項下標(biāo)準(zhǔn)曲線計算質(zhì)量濃度，考察BH在各類溶劑中的穩(wěn)定性。

測定結(jié)果顯示，BH在水、人工淚液、0.5 mol·L-1的氯化鈉溶液、1.0 mol·L-1的氯化鈉溶液、2.0 mol·L-1的氯化鈉溶液0.5 mol·L-1的氯化鉀溶液、0.5 mol·L-1的鹽酸溶液、磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)溶液中的質(zhì)量濃度RSD值分別為0.41%，0.93%，0.78%,0.54%，0.73%,0.65%，0.85%和1.21%，說明在不同離子溶劑中12 h內(nèi)BH穩(wěn)定性良好。

2.5BH表觀溶解度的測定在一定體積溶劑中加入過量的BH，渦旋5～10 min，置于34±1 ℃恒溫水浴中振蕩，每隔0.5 h取樣，過濾，取澄清液20 μL稀釋，測定吸光度，按照2.2項下標(biāo)準(zhǔn)曲線計算質(zhì)量濃度，當(dāng)相鄰2次時間點樣品質(zhì)量濃度相等時(或<5 %)，可判斷溶解達(dá)到平衡，此時質(zhì)量濃度視為平衡溶解度，平行3次，計算平均值，即為BH的表觀溶解度。見表2。

表2BH溶液的表觀溶解度

Tab.2 The solubility of BH in different solutions

(34±1 ℃)

2.6表觀油水分配系數(shù)配制1 mg·mL-1的BH，水/ 磷酸鹽緩沖液/林格溶液(GBR)為水相，蒸餾水/磷酸鹽緩沖液/ GBR飽和24 h的正辛醇為油相，在50 mL的具塞三角瓶中，加入水相5 mL、油相5 mL。油水相混合后在34±1 ℃恒溫水浴中以150 r·min-1攪拌72 h,以 3 000 r·min-1離心10 min，取水層過濾并稀釋數(shù)倍，在274.5 nm處測定吸光度，按照2.2項下方法帶入相應(yīng)溶劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算含量，記為C1。

(1-1)

其中C0為混合前水相BH質(zhì)量濃度。

表3BH在不同溶劑中的表觀油水分配系數(shù)

Tab.3ThelgPofBHindifferentsolutions

(34±1 ℃)

2.7BH角膜透過性研究

2.7.1實驗裝置本實驗使用改良的Franz擴(kuò)散池研究角膜透過性，它由供給池和接收池組成，供給池容量0.5 mL，接收池容量為5 mL，擴(kuò)散表面為模擬眼球的曲面設(shè)計，有效擴(kuò)散面積為0.7 cm2。見圖1。

圖1立體角膜透過裝置

Fig.1The diagram of corneal permeation

2.7.2擴(kuò)散介質(zhì)GBR溶液即谷胱甘肽-碳酸氫鈉林格溶液，可作為角膜的營養(yǎng)液，角膜上皮細(xì)胞在其中具有良好的活性[9]，本實驗選擇GBR溶液作為擴(kuò)散介質(zhì)。GBR溶液由兩部分組成：

A液：稱取12.4 g氯化鈉、0.716 g氯化鉀、0.206 g磷酸二氫鈉、4.908 g碳酸氫鈉溶于1 000 mL水中；

B液：稱取0.23 g 氯化鈣、0.318 g氯化鎂、1.80 g葡萄糖 、0.148 g谷胱甘肽(氧化型)溶于1 000 mL水中；

A液和B液分開，低溫保存，使用前將兩者等量混合。

2.7.3離體角膜的制備用耳緣靜脈注射空氣法處死兔子，在死后20 min內(nèi)取出眼球，除去眼球表面的血漬和筋膜，用眼科剪和鑷子小心分離角膜，除去虹膜、晶狀體和玻璃體等角膜下組織，從眼球上剪下帶2～4 mm鞏膜環(huán)的角膜片，用生理鹽水清洗后將角膜放入新鮮配制的GBR溶液中備用(注意：整個過程中避免弄傷角膜)。

2.7.4離體角膜透過性實驗將角膜在GBR溶液中潤洗后，固定在Franz擴(kuò)散池的供給池和接收池之間，角膜的上皮細(xì)胞與供給池接觸，接收池(含攪拌子)注入5 mL的GBR溶液作為擴(kuò)散介質(zhì)，溫度為34±1 ℃[10]，攪拌速度為200 r·min-1。供給池加入0.5 mL 的樣品溶液，在30，60，90，120，180，240 和360 min從接收池取樣0.5 mL，并補(bǔ)充等體積的擴(kuò)散介質(zhì)。

空白角膜透過液的制備：按照上述方法，在供給池中放入0.5 mL的GBR溶液，其他處理方法不變，在360 min時取透過液，過濾，進(jìn)樣測定，即為空白角膜透過液。

2.7.5數(shù)據(jù)處理

2.7.5.1角膜透過性

(1-2)

其中Cn為t時間藥物的測量質(zhì)量濃度，Ci為t時間前藥物的測量質(zhì)量濃度，V0為接受池中擴(kuò)散介質(zhì)的體積，V為取樣體積。

(1-3)

以單位面積的累計透過量Q-時間t做線性擬合，結(jié)果見表4。由表4可知，在pH值為6.34～8.24的透過環(huán)境中，藥物累積透過量與時間呈良好的線性關(guān)系(r的原子量依次為0.999 2，0.998 7，0.998 3和0.999 1)。

2.7.5.2角膜水化值(HL%)

角膜水化值是體外評價眼用制劑對角膜刺激性的重要指標(biāo)，通常角膜水化值為76%～80%，超過83%的水化值即判定角膜受到一定程度的損傷[11]。將新取角膜或體外實驗暴露于擴(kuò)散介質(zhì)的角膜區(qū)域(透過實驗后，將角膜邊緣用于固定的鞏膜環(huán)剪掉)稱質(zhì)量，記為Wb，90 ℃干燥12 h后，再次稱質(zhì)量，記為Wa。

(1-4)

由表4可知，角膜水化值HL%均小于83%，說明角膜均未受損傷，角膜透過的數(shù)值是可信的。但角膜水化值隨著pH值的增大也略有升高，這說明pH值過高(大于8.24)會對離體角膜造成一定損傷，這對于調(diào)整制劑的pH值具有參考意義。

表4不同pH條件下BH在兔離體角膜的透過性

Tab.4 Permeation of BH through isolated cornea of rabbits at different pH

pH擬合方程rHL/%6.34Q=0.0023t-0.05780.999278.9%±0.6%7.04Q=0.0028t-0.01950.998780.7%±1.2%7.74Q=0.0034t-0.00890.998381.3%±0.8%8.24Q=0.0043t+0.03980.999182.1%±0.9%

2.8載藥蒙脫石微球的制備本實驗采用O1/O2溶劑乳液-溶劑揮發(fā)法制備微球[7-8]。實驗步驟：精密稱取MMT-BH 50 mg、BH 30 mg、EURS和EURL共400 mg，加入增塑劑TEC 20%，50 mg 吐溫-80，再加入5 mL乙腈進(jìn)行溶解，作為內(nèi)相O1；精密量取20 mL的輕質(zhì)液體石蠟和200 mg的Span-80作為外相O2，用磁力攪拌器攪拌均勻。將O1逐滴滴加到O2中，攪拌速度為800 r·min-1，超聲使其乳化均勻，乳化10 min后，將轉(zhuǎn)速調(diào)為300 r·min-1，揮發(fā)溶劑3 h，當(dāng)溶液呈澄清狀態(tài)時離心，最后用正己烷洗滌微球，除去微球表面的液體石蠟，得到具有一定外觀形態(tài)和流動性的微球，晾干。微球在電子掃描顯微鏡下的結(jié)果見圖2。由圖2可見，微球外形圓整，無粘連情況，表面略有粗糙感。該工藝制備的微球的平均載藥量為14.31%，平均包封率為94.35%，且實驗結(jié)果穩(wěn)定，RSD值小于1%，具有可重復(fù)性。

圖2SEM MMT-BH微球圖片

Fig.2 Scanning electron micrographs of MMT-BH microspheres

3討論

鹽酸倍他洛爾用于治療高眼壓或青光眼，可通過減少房水的生成起到降眼壓的作用，并可增加眼血流量，且無明顯心血管及肺的不良反應(yīng)。作者對鹽酸倍他洛爾進(jìn)行了一系列分析，首先采用紫外分光光度法掃描了鹽酸倍他洛爾的特征吸收波長,為274.5 nm，建立了鹽酸倍他洛爾在不同離子溶劑中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對BH的穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，在不同離子溶劑中，12 h內(nèi)BH穩(wěn)定性良好。BH在各類擴(kuò)散介質(zhì)包括水、GBR溶液、人工淚液、磷酸鹽緩沖液中的溶解性較好(16.30～42.27 mg·mL-1)，測定結(jié)果表明，BH易溶于水和鹽溶液，為水溶性藥物。其中擴(kuò)散介質(zhì)堿性越大，BH的溶解性越小。在水、GBR溶液、人工淚液和磷酸鹽緩沖液中的表觀油水分配系數(shù)的測定顯示，BH為親水性化合物(lgP< 0)，且pH值越小，親水性越大。計算BH的pKa值為7.74，為弱堿性藥物，解釋了pH值對BH理化性質(zhì)的影響。離體角膜透過性實驗的結(jié)果表明，BH的角膜透過性受pH值的影響，藥物在堿性條件下更易透過角膜，但pH值過高(大于8.24)會對離體角膜造成一定損傷，因此對調(diào)整制劑的pH值具有參考意義。制備的微球在掃描電鏡下可見微球外形圓整，無粘連情況，表面略有粗糙感，表明采用油包油溶劑揮發(fā)法制備微球是可行的。

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The preformulation study and preparation of montmorillonite-intercalate microspheres

ZHANG Chumei1，LIU Li1，HOU Dongzhi1*，HU Sheng1，GUI Ruyi1，HUANG Yi1， PING Qineng2

(1. College of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2. College of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

Abstract:ObjectiveTo research the physical and chemical properties of betaxolol hydrochloride (BH) preformulation. The Eudragit RS/RL 100 was applied as membrane materials in the preparation of drug-loaded montmorillonite microspheres. MethodsThe model drug BH was determined by UV and HPLC, investigating the stability, apparent solubility, pKa value, hydrophilic lipophilic balance (HLB) of BH and the effect of pH on the in vitro corneal permeability . The drug-loaded montmorillonite microspheres were prepared by O1/O2 emulsion-solvent evaporation technology, and the morphology of microspheres was characterized by scanning electron micrographs for the prescription optimization. ResultsThe BH had excellent stability. The solubility of BH in various solution was among 16.30-42.27 mg·mL-1. The BH was a weak alkaline molecule with a pKa of 7.75. The pH had a significant influence in the drug corneal permeability, an alkaline conditions would be beneficial to the BH through cornea. The MMT-BH microspheres were prepared by O1/O2 emulsion-solvent evaporation technology, and the SEM results showed a spherical and slightly rough surface. Conclusion The UV method to determine the content of betaxolol hydrochloride was accurate and reliable.The O1/O2 emulsification-solvent evaporation method could be used for the preparation of montmorillonite exchange microspheres.

Key words:betaxolol hydrochloride；corneal permeability；montmorillonite；microspheres

(收稿日期：2015-11-30)

中圖分類號：R944

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)03-0281-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.018

*通信作者：侯冬枝，女，副教授，碩士研究生導(dǎo)師

第一作者簡介：共同張初梅，女，在讀本科生；

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目 (編號：51102052);2015年省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目

劉莉，女，碩士研究生