壯藥大火草抑制非細菌性前列腺炎模型大鼠炎癥反應

王文杰，史宏，張靜，韋玉娜，陸良喜，陸杰，葉斌，汪磊

(1. 廣西中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院，南寧 530001；2. 廣西中醫(yī)藥大學 賽恩斯新醫(yī)藥學院，南寧 530222)

前列腺炎是一種常見的尿路綜合征，是繼前列腺癌和良性前列腺增生之后男性的第3大常見泌尿系統(tǒng)疾病[1]。流行病學數(shù)據(jù)顯示，前列腺炎占泌尿外科門診數(shù)量的29%，而且由于其病因復雜，發(fā)病機制不明，導致臨床上對前列腺炎的治療效果欠佳[2]。大火草[Anemonetomentosa(Maxim.)Pei]屬于毛茛科銀蓮花屬，是云南民間常用草藥之一，發(fā)現(xiàn)于廣西壯族自治區(qū)，具有解熱鎮(zhèn)痛、抑炎抗菌、抗腫瘤等生物學活性，是臨床上壯醫(yī)常用的特色藥之一[3-5]。相關基礎實驗及臨床數(shù)據(jù)顯示，大火草能較好地抑制前列腺炎，是臨床上治療前列腺炎的中藥——前列飲中的主要成分之一[6-8]。為初步探討壯藥大火草對前列腺炎的治療機制，本研究采用λ-角叉膠誘導SD大鼠非細菌性前列腺炎模型[9]，采用不同劑量大火草治療模型大鼠，觀察其腺體組織的炎癥反應程度及細胞因子水平，以期為大火草的臨床應用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大火草煎劑的制備大火草由南寧市景昌中藥飲片有限公司生產(chǎn)，于中醫(yī)藥壯瑤醫(yī)藥實驗教學中心傳統(tǒng)炮制實驗室B901制備大火草煎劑。制備過程如下：將大火草置于煎煮容器中，先加入冷水沒過藥材浸泡30 min，再加入相當于藥材量5～8倍的冷水煮沸30 min，過濾。于藥渣中再加入5倍的冷水，煮沸30 min，過濾。收集2次過濾所得藥液，2 775×g離心10 min，取上清液。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上清液濃縮至每毫升含生藥量4.39 g，再將其配制成濃度為2.92 g/mL和1.46 g/mL的大火草煎劑。

1.2 模型的構建適應性飼養(yǎng)12只雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，SPF級。1周后，禁食8 h，期間自由飲水。模型組大鼠按照30 mg/kg劑量的戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉；腹部剃毛并用醫(yī)用酒精消毒，于腹部正中切開2～3 cm的切口，打開腹腔。用手術鑷輕輕提起膀胱，暴露出附著于膀胱頸部的前列腺體；用1 mL注射器將0.1 mL 1% λ-角叉膠(購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)注射于大鼠前列腺背側(cè)葉，輕柔歸位前列腺體和膀胱，縫合肌肉組織及皮膚，待大鼠蘇醒后繼續(xù)飼養(yǎng)。對照組大鼠在相同部位注射等量生理鹽水。分別于造模后24、48和72 h取大鼠前列腺組織切片，H-E染色觀察組織病理學情況，評估模型構建是否成功。

1.3 實驗的分組與處理將SD大鼠隨機分成4組——對照組、模型組、大火草高濃度組和大火草低濃度組，每組3只。除對照組外，其他3組均按照上述模型構建方法操作，造模當天即開始各組大鼠的灌胃處理。對照組和模型組大鼠均進行4 mL/(kg·d)的生理鹽水灌胃，大火草高濃度組和低濃度組分別用含生藥2.92 g/mL和1.46 g/mL的大火草煎劑灌胃，4 mL/(kg·d)，連續(xù)灌胃4周。藥物干預結束后，戊巴比妥麻醉，腹主動脈采血，處死后收集大鼠前列腺體，稱取質(zhì)量并拍照，保存于4%多聚甲醛固定液中，用于后續(xù)實驗。

1.4 H-E染色觀察大鼠前列腺組織病理學情況將分離的大鼠前列腺組織保存于4%多聚甲醛固定液中，1～2 d后取出組織，將其切成大小為1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm的組織塊，放于包埋盒中浸蠟包埋。將包埋好的組織樣本切成厚度為4～5 μm的切片，脫蠟后蘇木精染色5 min，PBS漂洗后促藍液返藍，伊紅染色3 min，PBS漂洗。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察攝片。

1.5 ELISA檢測大鼠血清中細胞因子的水平從采集的腹動脈血中分離得到血清，再根據(jù)ELISA試劑盒(購自武漢貝茵萊生物科技有限公司)說明書操作：將標準品按照規(guī)定的濃度梯度稀釋，取50 μL不同濃度的標準品滴加于酶標板的標準品孔中。在酶標板上的待測樣品孔中先加40 μL待測樣本，再加入10 μL相應的抗體，混勻后每孔加入50 μL的酶標試劑，室溫孵育30 min。洗滌液漂洗5次后，加入顯色劑，混勻室溫避光顯色10 min，再加入50 μL終止液終止反應。酶標儀調(diào)零后，檢測各孔光密度[D(450 nm)]值，根據(jù)標準品濃度及其D值繪制標準曲線，得到回歸方程式，再根據(jù)待測樣本的D值計算樣本濃度。

2 結果

2.1 大鼠模型的鑒定λ-角叉膠注射后24、48和72 h，可觀察到大鼠前列腺腺體發(fā)生腫大，且隨著時間的延長，腫大越明顯，腺體質(zhì)地堅硬，與周圍組織粘連。通過病理切片觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組大鼠腺體中的炎癥細胞浸潤現(xiàn)象嚴重，且呈一定的時間依賴性(圖1)。以上觀察提示，λ-角叉膠成功誘導了大鼠非細菌性前列腺炎模型。

注：A. 對照組；B. 模型組(24 h)；C. 模型組(48 h)；D. 模型組(72 h)。圖1 H-E染色觀察大鼠前列腺組織病理學狀況(×200)

2.2 大火草對前列腺炎大鼠腺體表觀特征的影響收集各組大鼠前列腺腺體，稱取質(zhì)量后，計算其與體質(zhì)量的比值得到前列腺指數(shù)，并比較各組腺體大小，結果顯示，各組間差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05，圖2、表1)。

注：A. 對照組；B. 模型組；C. 大火草高濃度組；D. 大火草低濃度組。圖2 各組大鼠前列腺腺體大小比較

表1 各組大鼠體質(zhì)量、腺體質(zhì)量及前列腺指數(shù)比較

2.3 大火草對前列腺炎大鼠腺體組織病理學特征的影響與對照組比較，模型組和大火草低濃度組的前列腺組織切片中出現(xiàn)大量嗜酸性顆粒，炎性細胞浸潤嚴重，而經(jīng)高濃度的大火草煎劑治療后大鼠的前列腺組織中炎性細胞數(shù)量明顯減少(圖3)。

注：A. 對照組；B. 模型組；C. 大火草高濃度組；D. 大火草低濃度組。圖3 H-E染色觀察大火草對前列腺炎大鼠腺體組織病理學特征的影響(×200)

2.4 大火草對前列腺炎大鼠血清中細胞因子水平的影響與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-8、TNF-α和IFN-γ水平均顯著升高(均P<0.05)，而IL-10水平顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，大火草高濃度組和低濃度組血清中IL-2、IL-4、IL-8、TNF-α和IFN-γ水平顯著降低(均P<0.05)，IL-10水平顯著升高(P<0.05)。而且，高濃度組比低濃度組效果更顯著(均P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠血清中細胞因子水平比較

3 討論

前列腺炎是泌尿男科常見疾病之一，其發(fā)病率為4%～25%，而慢性非細菌性前列腺炎為臨床分型中最常見類型，占前列腺病例的90%～95%，患者有長期、反復的骨盆區(qū)不適、疼痛等臨床特征，甚至伴隨著排尿和性功能障礙等癥狀，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[10]。慢性非細菌性前列腺炎致病因素不明確，目前治療該病的主要方法包括行為治療、針灸、物理熱療、按摩、中西藥物等[11]。中醫(yī)藥在治療慢性前列腺炎方面積累了豐富的經(jīng)驗，而且療效肯定，方法多樣，具有獨特的優(yōu)勢[12]。大火草具備清熱祛濕、益氣補腎、利尿通淋等功效，對其藥理作用分析發(fā)現(xiàn)該藥可發(fā)揮抗氧化、抑炎、抗腫瘤等作用，對前列腺炎治療效果較好[13-14]。

本次研究采用λ-角叉膠誘導SD大鼠非細菌性前列腺炎模型，并用大火草煎劑灌胃治療模型大鼠，治療周期結束后，各組大鼠的前列腺指數(shù)無顯著差異(均P>0.05)。相關文獻報道，在大鼠前列腺左右側(cè)葉各注射50 μL λ-角叉膠，術后7 d觀察大鼠前列腺腺體，其解剖學觀察及腺體指數(shù)均與假手術組存在明顯差異[15]。因此，推測導致本研究結果的原因可能是4周的治療周期里，模型組大鼠經(jīng)過自我免疫修復，從而與其他組腺體的基本特征之間的差異減少。但對前列腺進行組織病理學觀察，發(fā)現(xiàn)其腺體切片中炎性細胞浸潤嚴重，而經(jīng)過大火草治療后(尤其是高濃度的大火草)，組織浸潤的炎性細胞數(shù)明顯減少。

細胞因子在免疫炎癥反應中發(fā)揮著重要的生物學作用，為前列腺炎的臨床治療提供了新思路，已發(fā)展為臨床研究的熱點，其中包括IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、INF-γ及TNF-α等[16]。檢測慢性前列腺炎患者血清中細胞因子水平，結果顯示IL-2、IL-4、IL-6、IL-8和TNF-α水平顯著高于健康對照組[17]。IFN-γ也是一種促炎性細胞因子，與TNF-α一樣，在前列腺炎的中西醫(yī)分型中存在顯著差異[18]。IL-10是一類抑制性細胞因子，可抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生，降低促炎因子TNF-α水平，提高IL-10水平，調(diào)節(jié)機體免疫反應，可影響前列腺病理形態(tài)變化，發(fā)揮治療作用[19]。本研究結果顯示，經(jīng)大火草治療后的慢性前列腺炎大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-8、TNF-α和IFN-γ水平顯著降低，IL-10水平顯著升高，且使用高濃度大火草比低濃度效果更顯著(均P<0.05)。

綜合本研究結果，提示大火草治療非細菌性前列腺炎效果顯著，可顯著減少促炎性細胞因子水平，抑制前列腺組織中的炎癥反應，結合其在前列腺炎方面的臨床療效，用其治療前列腺炎值得推廣應用。