糯米甜酒曲根霉的篩選及強化曲的研究

魏浩林，周金虎，劉鳳春，管 健，鄧其錦，陳茂彬，方尚玲*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068；2.湖北楚園春酒業(yè)有限公司，湖北 宜昌 444200；3.工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068；4.工業(yè)微生物湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430068）

糯米甜酒曲根霉的篩選及強化曲的研究

魏浩林1，3，4，周金虎1，3，4，劉鳳春2，管 健1，3，4，鄧其錦1，3，4，陳茂彬1，3，4，方尚玲1，3，4*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068；2.湖北楚園春酒業(yè)有限公司，湖北 宜昌 444200；3.工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068；4.工業(yè)微生物湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430068）

選取5種不同地域、較為暢銷的市售糯米甜酒曲，以酒曲酶活力為評價指標，篩選出優(yōu)良糯米甜酒曲。將優(yōu)良酒曲中霉菌進行分離純化，制作純種根霉曲，與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）不同比例混合復(fù)配制作強化曲。通過強化曲與市售酒曲的酒曲酶活力對比，并結(jié)合試制糯米甜酒的總糖、總酸、總酯、酒精度對比驗證。結(jié)果表明，強化曲的最佳復(fù)配比例為：接種量為1%（其中根霉M9曲添加量0.90%，釀酒酵母添加量0.10%）。與市售甜酒曲相比，強化曲糖化力達796.5 U/g，提高14.8%；液化力達694.2 U/g，提高20.7%；試制糯米甜酒的總酯達0.78 g/L，提高168.9%；酒精度達12.1%vol，提高92.1%。經(jīng)感官評價，強化曲釀制糯米甜酒口感醇甜、風(fēng)味突出，感官評分為96分。

糯米甜酒曲；篩選；霉菌；強化曲

甜酒是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵類食品之一，因其酸甜可口、香味舒適，具備一定保健功效而深受大眾喜愛[1]。市場上有很多甜酒曲釀制的甜酒，但是其發(fā)酵菌株多為純種根霉，酒精產(chǎn)率及混合酸、酯類化合物生成量較低，因此甜酒生產(chǎn)往往面臨著風(fēng)味不足、酒味寡淡等一系列問題[2-3]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對微生物發(fā)酵產(chǎn)物調(diào)控及強化曲的研究較為豐富。如DUNG N T P等[4]發(fā)現(xiàn)多種酵母與霉菌復(fù)配發(fā)酵米酒可產(chǎn)生獨特香味成分；況啟生等[5]用不同菌種混合制曲生產(chǎn)多種風(fēng)味的米酒；張新武等[6]從客家糯米酒藥曲中分離出兩株根霉和酵母，通過復(fù)配開發(fā)強化曲。

所謂“好曲釀好酒”，甜酒曲的質(zhì)量好壞取決于甜酒曲菌種的性能，甜酒曲菌的組成是決定甜酒好壞的核心因素[7]。酒曲中霉菌分泌的酶（淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等）可以加速將谷物中的淀粉、蛋白質(zhì)等轉(zhuǎn)變成糖、氨基酸。糖分在酵母菌的酶的作用下，進一步分解成乙醇[8-10]。因此篩選優(yōu)良菌種，進一步制備強化曲具有重要的理論和實踐意義。本研究選擇不同地區(qū)具代表性的市售酒曲，分離篩選出酶活力高的根霉菌，制備純種根霉曲，與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）不同比例復(fù)配，結(jié)合酶活及試制糯米甜酒理化指標對比分析確認最佳配比，制備具有高糖化力、發(fā)酵力的強化曲，以期為強化曲的開發(fā)與應(yīng)用提供必要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

糯米：武漢市武泰閘農(nóng)貿(mào)市場。

釀酒高活性干酵母（Saccharomyces cerevisiae）：宜昌市安琪酵母有限公司。

酒曲：安琪風(fēng)味甜酒曲、富陽甜酒曲、蘇州蜜蜂甜酒藥、上海太白曲、孝感風(fēng)窩曲，分別編號為Ⅰ、II、Ⅲ、IV、V。

1.1.2 培養(yǎng)基與主要試劑

孟加拉紅培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

馬鈴薯瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基：土豆200g，瓊脂20g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

酵母浸出粉葡萄糖（yeastextractpeptone，YPD）液體培養(yǎng)基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、冰醋酸、醋酸鈉、可溶性淀粉、亞甲基藍、碘化鉀等（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器及設(shè)備

ZHJH-C1212B超凈工作臺、ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；CX31正置生物顯微鏡：日本Olympus有限公司；LDZX-75KB高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；AP-01P抽濾機：杭州賽析科技有限公司；HK-04A粉碎機：廣州市旭朗機械設(shè)備有限公司；分樣篩（40目、60目）：浙江上虞市五四紗篩廠；DK-98-11電爐：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 市售酒曲酶活力測定方法

將市售酒曲研磨粉碎，過40目篩，供測定用。糖化酶活力及液化酶活力的測定：參照國標GB1886.174—2016《食品添加劑食品工業(yè)用酶制劑》中的方法；蛋白酶活力的測定：參照國標GB/T23527—2009《蛋白酶制劑》。

1.3.2 酒曲中根霉的分離與純化

選取酶活力最高的市售甜酒曲[11-12]，從中分離根霉作為生產(chǎn)菌株。在無菌條件下，將酒曲粉碎，稱取0.5 g樣品加入無菌水中搖勻，等梯度稀釋104倍，用涂布平板法涂于馬丁孟加拉紅平板上，28℃培養(yǎng)24 h。從平板中選擇典型的霉菌菌落，用接種環(huán)挑取一小塊菌絲移植于另一平板培養(yǎng)基上。經(jīng)過3～4次分離純化得到根霉，對菌落形態(tài)進行記錄。將分離的根霉轉(zhuǎn)接到PDA斜面上28℃培養(yǎng)36 h，待長好后置于4℃冰箱中保存待用。

1.3.3 純種甜酒曲的制備

在無菌條件下，用接種環(huán)從冰箱保存的根霉斜面挑取1～2環(huán)，接入50mL的YPD培養(yǎng)基中，28℃、100r/min恒溫搖床振搖24 h制備孢子懸液。將糯米洗凈瀝干，粉碎過60目篩，紗布包好干蒸20～25 min，冷去后打散分裝于500 mL三角瓶中，在108℃高壓滅菌20 min。將三角瓶置于無菌室中冷卻至室溫，每100g米粉接種1.0mL準備好的孢子懸液，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)24 h，待觀察到三角瓶內(nèi)部分菌絲倒伏時，間歇12h進行一次扣瓶，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，用牛皮紙包裹37℃通風(fēng)干燥24 h，粉碎過40目篩，即得到純種根霉曲。

1.3.4 強化酒曲的制作

制曲過程中適當(dāng)?shù)慕臃N量有利于菌體的生長、培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的合理利用及酶的產(chǎn)生。同時雙菌種混合制曲過程中，根霉與酵母的比例直接影響酒曲糖化力與發(fā)酵力的平衡。參考張新武等[6]相關(guān)酒曲接種量的工藝參數(shù)，按接種量1%（根霉∶釀酒酵母=0.70∶0.30～0.95∶0.05）配比，強化酒曲制作工藝如下：

操作要點：

干炒：將洗凈的糯米進行小火翻炒，炒至米色偏黃、燙手為宜；

粉碎：將炒熟糯米放入清洗干凈、干燥的粉碎機中粉碎，過40目篩；

拌勻：按總量1%接入純種根霉曲與釀酒酵母（接種比例為0.70∶0.30～0.95∶0.05），加入40%的無菌水中溶解后，拌入米粉中混合均勻；

制丸：將混合均勻的米漿捏成丸子，丸子不能太大，每100 g大概捏15～20個丸子；

發(fā)汗：將丸子放入干凈的曲盒中，蓋上一層紗布，在28℃恒溫培養(yǎng)4～6 d；

烘干：將培養(yǎng)好的酒曲放入38℃干燥箱中烘干至水分含量＜15%。

1.3.5 糯米甜酒工藝流程及操作要點

操作要點：

浸泡：選取顆粒飽滿、無發(fā)黃、無霉變、無蟲害的糯米，洗凈，放入陶缸中加糯米質(zhì)量2.5～3.0倍的水浸泡9～12 h；

蒸飯：在108℃條件下蒸米飯20～25 min，蒸好的米飯外硬內(nèi)軟，疏松不爛，無白心，均勻一致；

淋冷：糯米蒸熟后立即用冷水澆淋，至30～35℃即可；

拌曲：等待米飯攤涼后，將1%酒曲和米飯攪拌均勻；

糖化發(fā)酵：將米飯置于28～32℃恒溫發(fā)酵，在20～30 h出現(xiàn)糖化液時按米飯質(zhì)量1∶1加水，繼續(xù)發(fā)酵3～4 d；

過濾：將發(fā)酵好的米飯先經(jīng)過四層紗布過濾，再經(jīng)抽濾機抽濾。

巴氏滅菌：將過濾后的米酒清汁放入65℃水浴鍋加熱25～30min，待冷卻后放入4℃冰箱保藏待用，即為成品酒。1.3.6糯米甜酒指標測定

為進一步比較市售甜酒曲與強化曲的性能，將兩者釀制糯米甜酒理化指標進行對比分析。糯米甜酒總糖的測定：采用國標GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》；總酸的測定：采用國標GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》；酒精度和總酯的測定：參考邸利娜等[15]的研究方法。

1.3.7 甜酒感官評定

參照吳瓊燕等[16-17]對米酒評定方法，對釀制的糯米甜酒進行感官評定，請30位品評員對各酒樣進行感官評價，滿分100分。糯米甜酒感官評分標準見表1。

表1 糯米甜酒感官評分標準Table 1 Standards of sensory evaluation of glutinous rice wine

2 結(jié)果與分析

2.1 市售酒曲的比較

對5種酒曲的糖化力、液化力及蛋白酶活力進行測定，結(jié)果如表2所示。

表2 不同酒曲發(fā)酵性能的比較Table 2 Comparison of fermentation performance of differentJiuqu

由表2可知，II號酒曲糖化力、液化力、蛋白酶活力均高于其他酒曲。DUNG N T P等[18]報道了關(guān)于越南米酒霉菌與酵母的功能研究，表明糯米甜酒還原糖的含量與霉菌的降解淀粉能力密不可分。因此可判斷，II號酒曲含優(yōu)良降解淀粉、生成還原糖的霉菌，并且性能穩(wěn)定，將其分離純化，可作為高糖化力純種根霉曲使用。

2.2 根霉的分離純化

在孟加拉紅培養(yǎng)基上經(jīng)過多次分離純化，從II號酒曲中篩選出一株根霉，編號為M9。對菌株M9進行形態(tài)觀察，結(jié)果見圖1。由圖1A可知，菌株M9菌落疏松，菌絲細弱，產(chǎn)生孢子少且顏色較淺，菌絲生長迅速。菌株M9應(yīng)用于甜酒曲制作過程中能使菌體短時間內(nèi)大量增殖，避免酒曲變黑變黃，是制備甜酒曲的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)菌株的前提條件。由圖1B可知，菌株M9菌絲無隔膜、有分支，匍匐枝的節(jié)間形成特有的假根，從假根處叢生直立的孢子梗，孢子囊成球形或近球形，從形態(tài)學(xué)角度初步判斷菌株M9為根霉菌。

圖1 菌株M9的菌落特征（A）和菌株形態(tài)（B）Fig.1 Colony characteristics(A)and cell morphology(B)of strain M9

2.3 強化曲復(fù)配試驗

對不同復(fù)配比例的強化曲進行酶活測定，其結(jié)果見表3。

表3 不同復(fù)配比例對強化曲發(fā)酵性能的影響Table 3 Effect of different compound proportion on fermentation performance of fortified Qu

由表3可知，適當(dāng)添加釀酒酵母，強化曲酶活力有所提高。當(dāng)純種根霉曲∶釀酒酵母=0.90∶0.10時，強化曲酶活力均達到最大，糖化力達796.5 U/g，較II號酒曲提高14.8%；液化力達694.2 U/g，較II號酒曲提高20.7%。而隨著釀酒酵母添加比例的繼續(xù)加大，霉菌的生長受到了抑制，酒曲糖化力、液化力直線下降。

2.4 試制糯米甜酒的對比驗證

2.4.1 試制糯米甜酒理化指標比較

參考1.3.4糯米甜酒釀制工藝，通過比較②號強化曲與5種市售曲試制糯米甜酒的總糖、總酸、總酯及酒精度，進一步對比強化曲與市售曲的發(fā)酵性能，結(jié)果如表4所示。

表4 不同酒曲對糯米甜酒品質(zhì)的影響Table 4 Effect of differentJiuquon quality of glutinous rice wine

由表4試制糯米甜酒理化指標對比，②號強化曲試制糯米甜酒總糖137.5 g/L，總酸5.2 g/L，酸甜適中?？傰ミ_0.78g/L，同比II號提高168.9%，酒精度達12.1%vol，同比II號提高92.1%。這說明在接種量為1%（根霉M9曲0.90%，安琪釀酒酵母0.10%）時，酒曲糖化力、液化力不僅能保持在較高水平，而且試制糯米甜酒出酒率及酯類化合物的生成對比市售酒曲有了顯著的提升。

2.4.2 試制糯米甜酒的感官評價比較

對5種市售糯米甜酒曲和②號強化曲試制的糯米甜酒進行感官評價，結(jié)果見表5。

表5 糯米甜酒的感官評價結(jié)果Table 5 Sensory evaluation results of glutinous rice wine

由表5可知，綜合品評分數(shù)最高是②號強化曲試制的糯米甜酒，為96分。表明②號曲不僅保持了較高的糖化力，而且與適當(dāng)比例釀酒酵母復(fù)配后亦有較高的發(fā)酵力，因此釀制甜酒香甜可口，風(fēng)味十足，酒體豐滿協(xié)調(diào)。

3 結(jié)論

通過對市售酒曲酶活力的比較篩選出優(yōu)良市售曲—“富陽甜酒曲”，將富陽甜酒曲中的根霉進行分離提純，釀酒酵母，對強化曲進行發(fā)酵試驗，對所制糯米甜酒進行理化指標檢測和感官評價。結(jié)果表明，以糯米為制曲原料，接種量為1%（其中根霉M9曲0.90%，釀酒酵母0.10%），強化曲糖化力達796.5 U/g，液化力達694.2 U/g，蛋白酶活力達752.8 U/g。試制糯米甜酒測定總酯達0.78 g/L，同比富陽甜酒曲提高168.9%，酒精度達12.1%vol，同比富陽甜酒曲提高92.1%。本研究提高酒曲的發(fā)酵力和酯化力，彌補了市售酒曲產(chǎn)香不足、酒化力較低的特點，所釀甜酒香甜可口、聞香舒適、回味悠長，為制作新型酒曲提供新思路。

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Screening ofRhizopusfrom glutinous rice wine starter and research on fortified Qu

WEI Haolin1,3,4,ZHOU Jinhu1,3,4,LIU Fengchun2,GUAN Jian1,3,4,DENG Qijin1,3,4,CHEN Maobin1,3,4,FANG Shangling1,3,4*
(1.Key Laboratory of Fermentation Engineering of Ministry of Education,College of Bioengineering and Food,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China;2.Hubei Chuyuanchun Winery Co.,Ltd.,Yichang 444200,China;3.Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation,Wuhan 430068,China;4.Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology,Wuhan 430068,China)

Choosing five kinds of popular commercial glutinous rice wine starter from different regions,usingJiuquenzyme activity as evaluation index,the excellent glutinous rice wine starter was screened.The mold in the glutinous rice wine starter was isolated and purified,pureRhizopusQu was made and then was mixed with different proportion ofSaccharomyces cerevisiaeto make fortified Qu.Through the comparison of theJiuqu enzymes activity of the fortified Qu and commercial Daqu,and the contents of total sugar,total acid,total ester and alcohol in glutinous rice wine fermented by the Daqu were detected.The results showed that the optimum complex proportion of fortified Qu:inoculum 1%(includingRhizopusM9 Qu 0.90%andS.cerevisiae0.10%).Compared with the commercial Daqu,the saccharification power and liquefaction power of the fortified Qu were 796.5 U/g and 694.2 U/g,respectively,and increased by 14.8%and 20.7%,respectively.The total ester and alcohol contents of glutinous rice wine fermented by fortified Qu were up to 0.78 g/L and 12.1%vol,respectively,which increased 168.9%and 92.1%,respectively.By sensory evaluation,the glutinous rice wine fermented by the fortified Qu had mellow and sweet taste and outstanding flavor,the sensory score was 96.

glutinous rice wine starter;screening;mold;fortified Qu

TS262.4

0254-5071（2017）09-0041-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.009

2017-03-22

“十三五”國家重點研發(fā)計劃項目重點課題子課題（2016YFD0400500）

魏浩林（1996-），男，本科生，研究方向為發(fā)酵工程。

*通訊作者：方尚玲（1967-），女，教授，博士，研究方向為釀酒微生物。