靜態(tài)頂空-氣質(zhì)聯(lián)用法檢測葡萄酒中香氣成分條件的優(yōu)化

祁新春，張會寧*，衛(wèi)磊鵬，白春艷

（山西戎子酒莊有限公司，山西 鄉(xiāng)寧 042100）

靜態(tài)頂空-氣質(zhì)聯(lián)用法檢測葡萄酒中香氣成分條件的優(yōu)化

祁新春，張會寧*，衛(wèi)磊鵬，白春艷

（山西戎子酒莊有限公司，山西 鄉(xiāng)寧 042100）

采用靜態(tài)頂空（SHS）與氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）測定葡萄酒中揮發(fā)性香氣成分。通過單因素試驗分別考察平衡溫度、平衡時間、樣品量和NaCl添加量對干紅葡萄酒香氣成分有效峰個數(shù)的影響。以有效峰個數(shù)（匹配度＞85%）為評價指標，采用正交試驗優(yōu)化了香氣成分的檢測條件。結(jié)果表明，靜態(tài)頂空-氣質(zhì)聯(lián)用檢測干紅葡萄酒中香氣成分的最佳條件為：平衡溫度55℃，平衡時間35 min，樣品量8 mL，NaCl添加量2.4 g。在此條件下，共鑒定出干紅葡萄酒中的香氣成分18種，其中醇類8種、酯類9種和1種酸。

葡萄酒；香氣成分；條件優(yōu)化；靜態(tài)頂空-氣質(zhì)聯(lián)用

葡萄酒是破碎或未破碎的新鮮葡萄果實或葡萄汁經(jīng)完全或部分酒精發(fā)酵后獲得的飲料。香氣物質(zhì)是構(gòu)成葡萄與葡萄酒質(zhì)量的主要因素之一，其主要來源有葡萄品種本身、生化反應、微生物代謝、葡萄酒貯存期間的化學或酶反應等[1-3]。葡萄酒中所含香氣成分的種類、含量、感官閾值是評判葡萄酒品質(zhì)的重要指標，決定了葡萄酒的風味和典型性[4-5]。

目前，色譜技術(shù)已廣泛用于葡萄酒香氣成分的分析，頂空萃取可以準確并精確地進行多個樣品的自動分析，使用頂空進樣可以非常有效地減少用于樣品前處理的時間和金錢，無需從基體中提取出被分析物以便進行液體進樣。常見的的頂空類型包括：靜態(tài)頂空（static headspace，SHS）、動態(tài)頂空或稱吹掃捕集（dynamic headspace，DHS）、固相微萃取技術(shù)（solidphase microextraction，SPME）。常用的氣相色譜定量方法主要有4種，即面積歸一化法、外標法、內(nèi)標法和標準加入法[6-7]。

本研究采用靜態(tài)頂空結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法（static headspacegaschromatography-massspectrometry，SHS/GC-MS）檢測干紅葡萄酒中香氣成分，使用峰面積歸一法進行定量分析，以有效峰個數(shù)為評價指標，采用正交試驗研究了平衡溫度、平衡時間、樣品量和NaCl添加量對干紅葡萄酒香氣成分有效峰個數(shù)的影響，優(yōu)化葡萄酒香氣成分檢測參數(shù)，旨在為干紅葡萄酒香氣成分的檢測方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2012年干紅葡萄酒酒樣：山西戎子酒莊有限公司；NaCl（分析純）：汕頭市西隴化工廠有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC7890A-MS5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、7697A頂空進樣器、DB-Wax毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國Agilent公司；明澈TM-D 24UV純水系統(tǒng)：德國默克密理博公司；KQ3200E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器清洗有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理方法

將準備好的干紅葡萄酒酒樣8.0 mL與2.4 g NaCl加入20 mL頂空瓶中，壓緊瓶蓋，密封，待測。

1.3.2 頂空條件[8]

進樣環(huán)體積1 mL，樣品瓶加壓壓力138 kPa，加壓時間0.2 min，充氣時間0.2 min，進樣時間1 min。頂空平衡溫度55℃，頂空平衡時間35 min。

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜檢測條件[9-10]

氣相色譜條件：進樣口溫度250℃；柱溫采用程序升溫，起始溫度50℃，保留5 min，以4℃/min升至160℃，再以10℃/min升至220℃，保留10 min；恒定流速1 mL/min，分流比30∶1，載氣：氦氣（He）。

質(zhì)譜條件：連接桿溫度280℃，電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV；離子源溫度230℃，傳輸線溫度280℃，質(zhì)譜掃描范圍50～550m/z；電子倍增器電壓1 141 V；溶劑延遲時間2 min。

1.3.4 定性定量方法[11]

香氣成分利用MS全離子掃描模式下的總離子流圖譜，依據(jù)色譜保留時間、質(zhì)譜信息和美國國家標準及技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）08標準譜庫比對結(jié)果相結(jié)合的方法進行定性分析；各香氣成分的相對含量采用氣相色譜峰面積歸一法進行定量。

1.3.5 試驗設(shè)計

單因素試驗：根據(jù)動力學和熱力學原理分析得出，平衡溫度、平衡時間、樣品量和NaCl添加量是影響靜態(tài)頂空-氣質(zhì)聯(lián)用法檢測葡萄酒中香氣成分有效峰個數(shù)的主要因素[3]。因此，分別考察平衡溫度（45℃、50℃、55℃、60℃、65℃）、平衡時間（25 min、30 min、35 min、40 min、45 min）、樣品量（5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL）和NaCl添加量（1.6 g、2.0 g、2.4g、2.8g、3.2g）對干紅葡萄酒香氣成分有效峰個數(shù)的影響。

正交試驗：在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，本試驗將平衡溫度（A）、平衡時間（B）、樣品量（C）和NaCl添加量（D）作為影響因素，以匹配度＞85%的有效峰個數(shù)為評價指標，每個因素選取4個水平，進行4因素4水平的正交設(shè)計試驗，研究靜態(tài)頂空/氣-質(zhì)聯(lián)用檢測葡萄酒中香氣成分有效峰個數(shù)的最佳參數(shù)，正交試驗因素與水平見表1。

表1 葡萄酒香氣成分檢測條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for determination conditions optimization of aroma components in wine

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 平衡溫度對干紅葡萄酒香氣成分有效峰個數(shù)的影響

考察平衡溫度對干紅葡萄酒香氣成分檢測結(jié)果的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 平衡溫度對干紅葡萄酒香氣成分有效峰個數(shù)的影響Fig.1 Effect of equilibrium temperature on the effective peak number of aroma components in dry red wine

由圖1可知，隨著平衡溫度的升高，有效峰個數(shù)逐漸增加，當平衡溫度達到55℃時，有效峰個數(shù)達到最多，為13個；當繼續(xù)升高平衡溫度，可能導致某些香氣組分分解，分配系數(shù)降低，有效峰個數(shù)開始減少[13]。因此，選擇55℃作為最佳平衡溫度。

2.1.2 平衡時間對干紅葡萄酒香氣成分有效峰個數(shù)的影響

考察平衡時間對干紅葡萄酒香氣成分檢測結(jié)果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 平衡時間對干紅葡萄酒香氣成分有效峰個數(shù)的影響Fig.2 Effect of equilibrium time on the effective peak number of aroma components in dry red wine

由圖2可知，隨著平衡時間的延長，有效峰個數(shù)顯著增加，當平衡時間達到40min時，有效峰個數(shù)達到最多，為14個；當平衡時間持續(xù)延長，葡萄酒香氣成分的有效峰個數(shù)變化不明顯，平衡時間既能讓組分盡可能多的揮發(fā)出來，又可盡量減少溶劑的揮發(fā)[14]。因此，選擇最佳平衡時間為40min。

2.1.3 樣品量對干紅葡萄酒香氣成分有效峰個數(shù)的影響

考察樣品量對干紅葡萄酒香氣成分檢測結(jié)果的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 樣品量對干紅葡萄酒香氣成分有效峰個數(shù)的影響Fig.3 Effect of sample volume on the effective peak number of aroma components in dry red wine

由圖3可知，隨頂空瓶中葡萄酒樣品量的增加，香氣成分的有效峰個數(shù)也增加，當樣品量為7 mL時，有效峰個數(shù)達到最多，為15個；當樣品添加量＜7 mL時，由于樣品量對頂空具有一定影響，直接決定氣液兩相的分配平衡[15]。因此，有效峰個數(shù)開始下降。另外，20 mL的樣品瓶，樣品加入量不能超過瓶高75%。綜合考慮，選用7 mL葡萄酒溶液作為頂空瓶的最佳進樣量。

2.1.4 NaCl添加量對干紅葡萄酒香氣成分有效峰個數(shù)的影響

考察NaCl添加量對干紅葡萄酒香氣成分檢測結(jié)果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 NaCl添加量對干紅葡萄酒香氣成分有效峰個數(shù)的影響Fig.4 Effect of NaCl addition on the effective peak number of aroma components in dry red wine

在液態(tài)樣品溶劑中，為了提高被分析物的含量，可以將葡萄酒溶液加鹽進行飽和[16]。由圖4可知，在干紅葡萄酒溶液中添加適量的鹽，減少了分析物在樣品溶劑中的溶解度，降低了分配系數(shù)，提高了頂空瓶氣相中的濃度和靈敏度；當加鹽量為2.4 g時，有效峰個數(shù)最多，為15個；隨著加鹽量的增多會影響酒樣的黏性，降低分析物的擴散速度從而影響有效峰個數(shù)。因此，選擇NaCl的最佳添加量為2.4g。

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以平衡溫度、平衡時間、樣品量和NaCl添加量作為考察因素，進行正交試驗，以有效峰個數(shù)作為評價指標，確定靜態(tài)頂空/氣-質(zhì)聯(lián)用檢測干紅葡萄酒中香氣成分的最佳條件。正交試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 干紅葡萄酒香氣成分檢測條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonalexperiments for determination conditions optimization of aroma components in dry red wine

由表2可知，通過A、B、C、D四個因素中極差R值的大小，可以得出影響有效峰個數(shù)的主次順序是：A＞B=C＞D，即平衡溫度為影響最大的因素。

從表2直觀地找出最優(yōu)水平組合為10號，即A3B2C4D3，此時有效峰個數(shù)為18個。按照各因素最好水平選取的理論上最優(yōu)處理組合為A3B2C4D1，在此條件下，檢測到的有效峰個數(shù)為16個。因此，可以確定最優(yōu)組合為A3B2C4D3。

由表3可知，A（平衡溫度）影響極顯著（P＜0.01），其他因素對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05），與極差分析結(jié)果相符合。因此，可以確定靜態(tài)頂空-氣質(zhì)聯(lián)用檢測干紅葡萄酒中香氣成分的最佳條件為：平衡溫度55℃，平衡時間35 min，樣品量8 mL，NaCl添加量2.4 g。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.3 葡萄酒香氣成分檢測方法優(yōu)化前后分析

通過正交試驗獲得頂空/氣-質(zhì)聯(lián)用檢測干紅葡萄酒中香氣成分的最佳條件，在此最佳條件下，采用氣相色譜-質(zhì)譜法對干紅葡萄酒中的香氣成分進行檢測，GC-MS分析優(yōu)化前后總離子流色譜圖見圖5；通過NIST08標準譜庫進行檢索，對優(yōu)化前后干紅葡萄酒香氣成分進行對比，結(jié)果見表4。

由表4可知，依據(jù)色譜保留時間和質(zhì)譜信息等方法對干紅葡萄酒香氣成分進行定性分析，檢測出優(yōu)化前干紅葡萄酒香氣成分14種，其中酯類7種，分別為：乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、琥珀酸二乙基酯；醇類有6種，分別為：乙醇、丙醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、2,3-丁二醇、苯乙醇；1種酸：乙酸。檢測出優(yōu)化后干紅葡萄酒香氣成分18種，其中酯類9種、分別為：乙酸乙酯、乙酸-2-甲基丙酯、乙酸丁酯、乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯、2-羥基-丙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、琥珀酸二乙基酯；醇類8種，分別為：乙醇、丙醇、2-甲基丙醇、丁醇、3-甲基丁醇、己醇、2,3-丁二醇、苯乙醇；1種酸：乙酸。

圖5 干紅葡萄酒香氣成分檢測條件優(yōu)化前（A）和優(yōu)化后（B）總離子流色譜圖Fig.5 Total ion chromatogram of aroma components in dry red wine before(A)and after(B)optimization of determination conditions

表4 干紅葡萄酒實驗方法優(yōu)化前后香氣成分比較Table 4 Comparison of aroma components in dry red wine before and after optimization

干紅葡萄酒香氣成分檢測方法優(yōu)化后，檢測出的香氣成分比優(yōu)化前多檢測出4種，分別為：乙酸-2-甲基丙酯、正丁醇（香氣醉人，酒精味）、2-羥基-丙酸乙酯和正己醇（青草味，吐司味）。各葡萄酒香氣成分的相對含量采用氣相色譜峰面積歸一法進行定量。干紅葡萄酒中醇類相對含量最高的是3-甲基丁醇，酯類相對含量最高的是乙酸乙酯。

3 結(jié)論

本研究以干紅葡萄酒為研究對象，通過單因素試驗分別考察平衡溫度、平衡時間、樣品量和NaCl添加量4個因素對干紅葡萄酒香氣成分有效峰個數(shù)的影響，采用正交試驗對頂空/氣-質(zhì)聯(lián)用檢測干紅葡萄酒中香氣成分的條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，靜態(tài)頂空-氣質(zhì)聯(lián)用檢測干紅葡萄酒中香氣成分的最佳條件為：平衡溫度55℃，平衡時間35 min，樣品量8 mL，NaCl添加量2.4 g。在此條件下，鑒定出干紅葡萄酒中的香氣成分18種，其中醇類8種、酯類9種和1種酸。檢測出的香氣成分比優(yōu)化前多出4種，分別為：乙酸-2-甲基丙酯、正丁醇（香氣醉人，酒精味）、2-羥基-丙酸乙酯和正己醇（青草味，吐司味）。

本研究對靜態(tài)頂空-氣質(zhì)聯(lián)用檢測葡萄酒香氣成分進行優(yōu)化，優(yōu)化后檢測出的香氣成分比優(yōu)化前多出4種，分別為：乙酸-2-甲基丙酯、正丁醇（香氣醉人，酒精味）、2-羥基-丙酸乙酯和正己醇（青草味，吐司味）。與固相微萃取技術(shù)（SPME）檢測結(jié)果比較，本試驗方法在樣品濃縮富集前處理上還需要進行改進，以建立一種快速、簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性及線性好的檢測干紅葡萄酒中揮發(fā)性香氣成分的分析方法。

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Optimization of determination conditions of aroma components in wine by SHS/GC-MS

QI Xinchun,ZHANG Huining*,WEI Leipeng,BAI Chunyan
(Shanxi Chateau Rongzi,Co.,Ltd.,Xiangning 042100,China)

Volatile aroma components in wine were determined by static headspace-gas chromatography-mass spectrometer(SHS/GC-MS).The effects of equilibrium temperature,time,sample volume and NaCl addition on the effective peak number of aroma components in dry red wine were investigate by single factor experiments.Using the effective peak number(matching degree＞85%)as the evaluation index,the determination conditions of aroma components were optimized by orthogonal experiments.The results showed the optimum determination conditions of aroma components in dry red wine by SHS/GC-MS were as follows:equilibrium temperature 55℃,time 35 min,sample volume 8 ml and NaCl addition 2.4 g.Under this condition,18 kinds of aroma components in dry red wine were identified,including 8 kinds of alcohols,9 kinds of esters and one kind of acid.

wine;aroma components;condition optimization;SHS/GC-MS

TS262.6

0254-5071（2017）09-0168-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.036

2017-05-22

祁新春（1983-）男，釀酒師，本科，主要從事葡萄及葡萄酒的研究工作。

*通訊作者：張會寧（1974-），女，工程師，碩士，主要從事葡萄及葡萄酒的研究工作