建立一種動(dòng)物源性食品中沙丁胺醇的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)方法

葉夏聲　邱永為　黃婷　李湘媛

摘? 要：本研究建立了一種高效檢測(cè)沙丁胺醇的方法，并對(duì)所建立的方法進(jìn)行了方法學(xué)的考察與驗(yàn)證，參考已有的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)處理步驟進(jìn)行優(yōu)化，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分析。其標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.999 83，方法檢出限為0.068 8 μg/kg，回收率范圍為92.0%～102.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～4.6%。所得結(jié)果表明，該方法檢出限低，回收率較好，精準(zhǔn)度高，重復(fù)性好，為動(dòng)物源性食品中的沙丁胺醇檢測(cè)提供了有力的方法支撐。

關(guān)鍵詞：動(dòng)物源性食品;沙丁胺醇;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號(hào)：S859.84 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2022）04-0094-04

沙丁胺醇（salbutamol，SAL）是人工合成的腎上腺素β2受體興奮藥之一，屬水楊醇類的腎上腺素激動(dòng)藥[1]，臨床上常被用于治療哮喘。沙丁胺醇對(duì)動(dòng)物骨骼?。ㄊ萑猓┑纳L(zhǎng)具有促進(jìn)作用，具有能夠有效減少脂肪含量、提高攝入食物的轉(zhuǎn)化率、增大經(jīng)濟(jì)效益等作用，故常被黑心商家作為飼料添加劑用于畜禽的飼養(yǎng)中[2]。中國(guó)、歐盟等許多國(guó)家或地區(qū)的管理部門都禁止將沙丁胺醇在畜禽生產(chǎn)中使用，而實(shí)際生產(chǎn)中依舊存在違法使用的情況[3]。當(dāng)消費(fèi)者攝入含有沙丁胺醇的肉制品時(shí)，由于機(jī)體對(duì)丁胺醇的代謝較慢，導(dǎo)致其在心臟和肝腎中積累，進(jìn)而引發(fā)各種不良的生理反應(yīng)，如心悸、頭暈、煩悶、肌肉顫抖、失眠等;嚴(yán)重時(shí)還會(huì)誘發(fā)和加重糖尿病、心血管疾病[4]。2009年10月29日，歐洲藥品管理局發(fā)出警告，認(rèn)為沙丁胺醇在治療有嚴(yán)重心臟疾病患者的呼吸道疾病時(shí)存在引發(fā)心肌缺血的風(fēng)險(xiǎn)，可能會(huì)出現(xiàn)心臟病惡化的癥狀，并且不適用于患有缺血性心臟病或有明顯缺血性心臟病風(fēng)險(xiǎn)因素的女性患者[5]。對(duì)于糖尿病患者，沙丁胺醇能增加肌糖原的分解，引起血乳酸和丙酮酸水平的升高，酮體含量增多，從而導(dǎo)致代謝紊亂，出現(xiàn)酮癥酸中毒和乳酸中毒[6]。資料顯示，沙丁胺醇還可能會(huì)導(dǎo)致攝入者出現(xiàn)低血鉀癥和生殖內(nèi)分泌毒性[7]。荷蘭藥物警戒中心收錄報(bào)告顯示沙丁胺醇可引起兒童齲齒[8]。

目前，常用的沙丁胺醇檢測(cè)方法有高效液相法、酶聯(lián)免疫法、氣質(zhì)聯(lián)用法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。前三種方法存在靈敏度較低、前處理步驟復(fù)雜、極容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和定性結(jié)果的準(zhǔn)確性較差等問題。相比之下，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有高效的分離能力和準(zhǔn)確的定性定量能力，因此被廣泛使用[9]。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，MS/MS）是目前分析SAL最有效的方法之一。一方面HPLC法可分離一些熱不穩(wěn)定的小分子極性物質(zhì)，無需衍生化步驟;另一方面質(zhì)譜對(duì)化合物的定性能力，特別是二級(jí)質(zhì)譜多反應(yīng)離子檢測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）的定性能力超強(qiáng)[10]。在國(guó)家相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)主要有農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025號(hào)公-18-2008《動(dòng)物源性食品中β–受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法》、GB/T21313《動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》、GB/T22286《動(dòng)物源性食品中多種β-受體激動(dòng)劑殘留量的測(cè)定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》[11-13]等。本研究旨在針對(duì)動(dòng)物源性食品中沙丁胺醇，對(duì)上述涉及的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行一定的優(yōu)化整合，縮減前處理步驟，使用液質(zhì)聯(lián)用儀來對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性定量檢測(cè)，提高檢測(cè)工作效率，為動(dòng)物源性食品中沙丁胺醇的檢測(cè)提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

安捷倫1290液相色譜儀、AB Science質(zhì)譜儀、恒溫水浴搖床、氮吹儀、漩渦混合儀、電子天平、旋渦混合器、冷凍離心機(jī)、超純水儀、超聲波清洗機(jī)、混合陽(yáng)性離子（mixed-mode cation exchanger，MCX）固相萃取柱（規(guī)格：60 mg，3 cc）均從相關(guān)生產(chǎn)廠家采購(gòu)。

1.1.2 藥品與試劑

0.2 mol/L乙酸銨（pH=5.2）;0.1 mol/L高氯酸溶液;5%氨化甲醇;甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）;乙酸（分析純）;氫氧化鈉（分析純）;β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶（20 U/mL）;復(fù)溶液：甲醇/水/甲酸（10∶90∶0.09，v/v/v）。

1.2 樣品準(zhǔn)備

取適量新鮮牛肉組織，充分絞碎且均質(zhì)，于-20 ℃避光保存。

1.3 標(biāo)液的配制

準(zhǔn)確稱取沙丁胺醇的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃冰箱中保存，有效期6個(gè)月;再分別移取適量的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋成適當(dāng)濃度的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取試樣2.00 g（±0.01 g），置于50 mL離心管中，加入8 mL乙酸銨溶液（0.2 moL/L）（pH=5.2）和 40 ?L 20 U/mL β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶，加蓋1 900 r/min渦旋振蕩5 min，37 ℃恒溫?fù)u床避光酶解12 h。酶解后放置至室溫，在酶解液中加入300 ?L高氯酸（將pH調(diào)至1.00），渦旋30 s，10 000 r/min 低溫離心5 min，移上清液置于另一50 mL離心管中。在殘?jiān)屑尤? mL高氯酸溶液（0.1 moL/L），渦旋30 s，10 000 r/min低溫離心5 min，合并上清液。上清液中加入570 μL氫氧化鈉溶液（5.0 moL/L）（將pH調(diào)至4.00），備用。

MCX固相萃取柱分別依次用3 mL甲醇、3 mL水活化。取備用液全部過柱，再依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗小柱，抽干。用5 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集至15 mL塑料離心管。洗脫液在40 ℃下氮吹干，用甲醇+水+甲酸（10+90+0.09）溶液定容至1 mL，震蕩? ? ? 5 min，過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2? 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025號(hào)公告-18-2008標(biāo)準(zhǔn)條件設(shè)置儀器參數(shù)，配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液（0.25 ?g/kg、0.5 ?g/kg、? ? ? 1.00 ?g/kg、2.50 ?g/kg、5.00 ?g/kg），待儀器參數(shù)穩(wěn)定后，對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，沙丁胺醇相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 83。

2.2 方法檢出限確定

以空白牛肉樣品為基質(zhì)，設(shè)置一個(gè)陽(yáng)性樣品，濃度為C（0.25 μg/kg），按照操作進(jìn)行前處理，之后上機(jī)，測(cè)得沙丁胺醇信噪比分別為S/N=10.9，可計(jì)算檢出限（method detection limit，MDL）為0.068 8 ?g/kg。計(jì)算公式 如下：

檢出限（MDL）（μg/kg） =3C/（S/N）

2.3 回收率及精密度確定

使用空白牛肉的樣品作為基質(zhì)條件，測(cè)定加標(biāo)回收率，加標(biāo)濃度分別為0.25 ?g/kg、 0.50 ?g/kg、2.50 ?g/kg。將加標(biāo)樣品和空白樣品通過前處理后進(jìn)行上機(jī)測(cè)試，結(jié)果見表1所示。根據(jù)表1與表2中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，該方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較低，且回收率表現(xiàn)較好，沙丁胺醇的回收率范圍為92.0%～102.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～4.6%。該方法的檢出限較低、重復(fù)性較好，能保持較為優(yōu)異的回收率，可用于沙丁胺醇的定性、定量檢測(cè)。

3? 結(jié)論

經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，沙丁胺醇一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液（0.25 μg/kg、0.50 μg/kg、1.00 μg/kg、2.50 μg/kg、5.00 μg/kg）的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線相關(guān)系數(shù)為R²=0.999 83，實(shí)驗(yàn)結(jié)果滿足標(biāo)準(zhǔn)方法的要求。經(jīng)測(cè)定，沙丁胺醇的方法檢出限為0.068 8 μg/kg，符合標(biāo)準(zhǔn)方法的要求。加標(biāo)回收試驗(yàn)中加標(biāo)濃度分別為0.25 μg/kg、0.50 μg/kg、2.50 μg/kg，經(jīng)測(cè)定，沙丁胺醇的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%、4.6%和1.1%，加標(biāo)試驗(yàn)回收率范圍為92.0%～102.0%，均符合方法要求，驗(yàn)證結(jié)果滿足農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025號(hào)公告-18-2008《動(dòng)物源性食品中β–受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法》的要求，具有較好的精密度和準(zhǔn)確度，同時(shí)該方法具有前處理相對(duì)簡(jiǎn)單、溶劑的使用量較少、凈化效率高和待測(cè)組分損失小等特點(diǎn)，適合動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑的定性及定量測(cè)定。

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