雜交水稻品種鑒定方法（綜述）

丁健美 劉之熙

摘 要 通過查閱文獻，歸納總結(jié)了目前用于雜交水稻品種鑒定的幾類方法。種子形態(tài)鑒定法、幼苗形態(tài)鑒定法、田間種植鑒定法、計算機模擬形態(tài)分析技術(shù)等形態(tài)學方法，難以辨別種子形狀差異和形態(tài)不太明細的真假品種，且鑒定周期長，在一定程度上受鑒定人員的自身技術(shù)與經(jīng)驗制約。同工酶電泳鑒定、蛋白質(zhì)電泳鑒定等生化鑒定法，受限條件較多，實際工作中應用較少。DNA分子技術(shù)鑒定法主要有RAPD標記鑒定、RFLP標記鑒定、AFLP標記鑒定、SSR標記鑒定、SNP標記鑒定。DNA分子標記鑒定，可應用于雜交水稻品種純度與真實性鑒定、審定監(jiān)管等各環(huán)節(jié)，具有鑒定快速、周期短、準確、簡便、經(jīng)濟等諸多優(yōu)點，是農(nóng)作物品種鑒定的發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞 雜交水稻;品種鑒定

中圖分類號：S511.5 文獻標志碼：C DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.13.040

品種鑒定是種子市場監(jiān)管和品種審定準入的主要內(nèi)容，是育種工作的重要階段，也是衡量成果能否轉(zhuǎn)化的重要環(huán)節(jié)。因此，品種鑒定在種子生產(chǎn)、加工、儲藏及經(jīng)營貿(mào)易等流通過程中具有重要意義和應用價值。但在種子流通中，為節(jié)省成本與縮短時間周期，往往忽略品種鑒定的重要性，導致仍有種子摻假的案件發(fā)生，給生產(chǎn)造成了難以挽回的損失[1]。雜交水稻是我國最主要的農(nóng)作物，對保障國家糧食安全起到舉足輕重的作用，因此，隨著全國雜交水稻種植面積比重逐年增大，對雜交水稻種子的質(zhì)量（主要是真實性和純度）檢查和監(jiān)督尤為重要。目前，雜交水稻品種鑒定的方法主要有形態(tài)鑒定法、生化鑒定法、DNA分子技術(shù)鑒定法。

1? 形態(tài)鑒定法

1.1? 種子形態(tài)鑒定法

種子形狀比較穩(wěn)定，故形態(tài)鑒定方法簡單，快速經(jīng)濟。主要通過觀察種子的外觀形態(tài)特征，包括種子的長寬度與大小、形狀、顏色、光澤、種皮形態(tài)、堊白、胚乳等性狀，借助儀器或工具（如放大鏡、解剖鏡等）觀察，進行品種鑒定，一般情況下可鑒定出雜交水稻樣品的真實性[2-3]。但由于這些性狀只適用于品種間差異較大的樣品鑒定，且受鑒定者經(jīng)驗的制約，品種鑒定結(jié)果可靠性較差，應用范圍較窄。

1.2? 幼苗形態(tài)鑒定法

在相同條件的溫濕度、光照等環(huán)境下，對種子進行培養(yǎng)，當發(fā)芽良好的種子生長發(fā)育到適合鑒定的幼苗階段，結(jié)合獨特的形態(tài)特征進行比較鑒定。李穩(wěn)香等用幼苗形態(tài)鑒定法，發(fā)現(xiàn)應用于鑒定威優(yōu)、汕優(yōu)、協(xié)優(yōu)系統(tǒng)的雜交一代均有較好效果，尤以鑒定威優(yōu)46效果與田間種植鑒定結(jié)果均基本一致[4]。此鑒定方法較簡單，易于操作，成本低，鑒定周期短，鑒定結(jié)果較準確。但由于幼苗期所依據(jù)的性狀有限，且受種子處理方法與生長環(huán)境的影響頗大。因此，該鑒定方法只適用于幼苗形狀差異較明顯的品種。

1.3? 田間種植鑒定法

田間種植是鑒定品種最為可靠的方法之一，主要依據(jù)品種的特征特性進行鑒定。將種子適時催芽、播種，秧苗栽插到田間，通過水肥管理、病蟲害預防等，直到抽穗時進行鑒定。我國每年冬季都會在海南島進行田間種植鑒定，這種鑒定方法比較簡單，鑒定結(jié)果較為符合大批量的實際生產(chǎn)。雖然該鑒定方法不影響內(nèi)地的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，但鑒定時間較長，對于種子的經(jīng)營特別是種子的出口貿(mào)易是一道不可逾越的障礙，尤其是我國加入WTO以后，這道障礙越來越明顯。受季節(jié)、環(huán)境等條件的影響，試驗有誤差（如光、溫敏兩系不育系），占用資源土地和生產(chǎn)技術(shù)人員，一旦試驗失敗，不容易重新布置試驗，但是不可否認的是，該鑒定方法適合大批量的實際生產(chǎn)。

1.4? 計算機模擬形態(tài)分析技術(shù)

在常規(guī)鑒定技術(shù)的基礎上利用計算機的優(yōu)勢進行有限的模擬分析，在鑒定方法上并沒有根本改進，因而鑒定效果并不理想。

由于形態(tài)學方法難以辨別種子形狀差異和形態(tài)不太明細的真假品種，且鑒定周期長，在一定程度上受鑒定人員的自身技術(shù)與經(jīng)驗制約。因此，通過專業(yè)的實驗室內(nèi)檢測方法來代替形態(tài)學鑒定已成為雜交水稻種子鑒定技術(shù)發(fā)展的必然方向[5]。

2? 生化鑒定法

蛋白質(zhì)是基因表達的產(chǎn)物，也是測定基因組一致性的依據(jù)。生化鑒定法的原理是依據(jù)不同品種之間所遺傳的物質(zhì)不相同，則形成不一樣的RNA，最終產(chǎn)生不一樣的蛋白質(zhì)或者同工酶。因此，生化鑒定法是在特定的環(huán)境下，利用電泳中的譜帶多樣性，對不同品種（系）的遺傳特性進行純度與真實性鑒定，具有不受外部環(huán)境影響、較為方便、鑒定準確性高等優(yōu)點。此法主要包括同工酶電泳鑒定和蛋白質(zhì)電泳鑒定。

2.1? 同工酶電泳鑒定

同工酶電泳技術(shù)于20世紀60年代初就初步應用于品種鑒定的研究。朱英國等對國內(nèi)166個水稻品種在苗期進行酯酶同工酶檢測，獲得11種酶譜類型[6]。武漢大學遺傳研究所與北京種子公司協(xié)作，用水稻的幼苗為材料，并利用雜種F1和三系親本的酯酶同工酶圖譜的差異來鑒定不同的水稻品種和品系[7];顏啟傳也利用該技術(shù)檢測了雜交水稻及其三系親本的真實性和品種純度，通過檢測分析證實該鑒定法的檢測結(jié)果較準確，提高了鑒定分辨率[8]。因此，20世紀70年代已推廣同工酶電泳法用于品種鑒定，在生產(chǎn)上有著一定的應用價值和意義。

同工酶鑒定法對種子或幼苗的生長質(zhì)量要求較高，酶的提取和電泳技術(shù)的實驗條件也要求嚴格，同工酶表達的特異性又影響著其在不同組織的分布與活性，一旦種子或幼苗出現(xiàn)長勢不太好，產(chǎn)生酶的活性低，就會直接導致酶帶模糊不清，影響鑒定結(jié)果，可利用的同工酶非常有限。

2.2? 蛋白質(zhì)電泳鑒定

種子中蛋白質(zhì)的種類及含量相對比較穩(wěn)定，可以用作品種鑒定的依據(jù)。不同品種遺傳基礎物質(zhì)的DNA不同，形成的模板RNA也有差異，使其合成的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出差異，依據(jù)品種之間在蛋白質(zhì)的差異，利用電泳技術(shù)對品種的蛋白質(zhì)進行分離檢查，制成電泳圖譜，通過觀察不同品種電泳圖譜的不同來加以區(qū)別。蛋白質(zhì)電泳作為鑒定品種的一種方法，應用于雜交水稻品種鑒定方面的報道不多，陸作楣等提取62份雜交水稻三系親本和雜種一代種子胚乳貯藏蛋白中總蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白樣品，采用SDS-PAGE電泳法分析，根據(jù)谷蛋白譜帶特征的差異進行品種鑒定[9]。

蛋白質(zhì)電泳鑒定法快速可靠，不受外部環(huán)境制約。但所用的提取液和電泳系統(tǒng)不同，萌芽的種子、幼芽或幼苗及成熟期各個時期表達不穩(wěn)定，影響著電泳圖譜的分離，鑒定結(jié)果與操作過程也相關(guān)，如實驗材料的采集、電泳系統(tǒng)的條件、提取的蛋白液、膠濃度等不同，結(jié)果也會不同，導致難以形成統(tǒng)一標準[10-11]。此外，對于遺傳相近的品種之間，貯藏蛋白的標記多態(tài)性不太豐富，難以找到特異蛋白，在實踐中未得到推廣應用。

3? DNA分子技術(shù)鑒定法

隨著DNA分子技術(shù)鑒定應用于植物新品種鑒定大量研究的陸續(xù)開展，為雜交水稻品種鑒定提供了新的思路。DNA分子標記技術(shù)以其多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定性強，在基因組中頻繁出現(xiàn)，易獲得、易操作、重復性好等特點被研究者廣泛關(guān)注和應用。研究表明，DNA分子標記可應用于雜交水稻品種純度與真實性鑒定，審定監(jiān)管等各環(huán)節(jié)，其具備鑒定快速、周期短、準確及簡便、經(jīng)濟等諸多優(yōu)點[12-16]，是農(nóng)作物品種鑒定的發(fā)展方向。

DNA分子技術(shù)鑒定不受生物體各組織、各發(fā)育階段、環(huán)境與季節(jié)的限制和人為因素的影響，同時，可以彌補和克服形態(tài)鑒定與生化鑒定的不足。目前，在雜交水稻分類中廣為應用的DNA分子技術(shù)鑒定主要有RAPD、RFLP、AFLP、SSR、SNP。

3.1? RAPD標記鑒定

RAPD是William JGK等和Welsh J等于1990年創(chuàng)建的一種分子標記，在PCR基礎之上的一種可對整個序列的基因組進行分析的分子技術(shù)。利用隨機引物對基因組DNA進行擴增得到多帶，而對某個特定的基因型來講，這些擴增的片段或片段的類型是唯一的，因此，可以用來鑒定品種。1996年，錢前等利用RAPD標記，成功實現(xiàn)對真、假“II優(yōu)63”種子的鑒定[17]。相比RFLP，RAPD操作較簡單，所需的DNA量小，多態(tài)性強、操作簡便，成本較低。

隨著雜交水稻品種的豐富性及交易市場的活躍性，只用單個多態(tài)標記鑒定種子的做法，不能滿足特定品種大量篩選引物的需求，RAPD標記鑒定對引物的選擇和實驗的條件要求較嚴，因此，該技術(shù)在品種鑒定中有一定的局限性。

3.2? RFLP標記鑒定

RFLP即限制性片段長度多態(tài)性標記，是根據(jù)不同品種間不同基因組的限制性內(nèi)切酶位點的堿基發(fā)生變化，或者是酶切位點間發(fā)生了堿基的缺失與插入，酶切位點的片段發(fā)生了變化，造成差異，這種差異可以通過特定的探針進行雜交檢測，根據(jù)探針位于染色體的不同位點可以作為一種分子標記，構(gòu)建分子圖譜，根據(jù)圖譜的特異性，從而鑒別真假種子[18]。RFLP標記可用于形態(tài)標記、同工酶標記和蛋白質(zhì)電泳技術(shù)難以區(qū)別的品種的鑒定。

RFLP是較早使用DNA分子標記的應用，檢查結(jié)果比較穩(wěn)定，該技術(shù)已在小麥、玉米、黃瓜、辣椒、大白菜和甘藍等作物上得到初步應用。但RFLP對DNA的質(zhì)量要求較高，檢測技術(shù)繁瑣，不適合雜交育種和品種鑒定的大規(guī)模應用。

3.3? AFLP標記鑒定

AFLP標記是以結(jié)合RFLP標記和PCR技術(shù)為基礎建立起來的，通過DNA制備、擴增酶切片段、凝膠及電泳四個基本步驟，對品種進行鑒定。陳一華等最少利用3對AFLP引物組合就可以區(qū)分l5個雜交水稻品種，根據(jù)品種間DNA多態(tài)性條帶的有無，轉(zhuǎn)換成1和0指紋數(shù)據(jù)，從而實現(xiàn)了計算機輔助種子鑒定[19]。美國先鋒公司培育的一個優(yōu)良玉米雜交種的親本（申請專利）被一個小公司偷用制種，獲得了很大利潤。先鋒公司發(fā)現(xiàn)了該公司的侵權(quán)行為后，提出訴訟，但因證據(jù)不充分一直未能得到解決，最后，先鋒公司用AFLP技術(shù)獲得DNA指紋證據(jù)后贏得了訴訟，那個小種子公司因被罰巨額賠款而倒閉。

AFLP多態(tài)性水平相當高，且穩(wěn)定可靠，但需DNA模板量大，需酶切，對DNA純度要求高，如基因組的酶切不完全，會影響鑒定結(jié)果。同時，操作程序長，步驟繁瑣，電泳技術(shù)較復雜，成本太高，并要求較高的試驗技能和高精度的儀器設備[20-21]，同時，它還是專利技術(shù)，難以在雜交水稻品種鑒定中普及使用。

3.4? SSR標記鑒定

目前在雜交水稻品種鑒定中，利用分子標記檢測技術(shù)最多的就是SSR分子標記鑒定，與RAPD、RFLP、AFLP分子標記鑒定法相比，SSR分子標記鑒定結(jié)果更容易觀察分析，且對差異不太明顯的品種也能鑒定區(qū)分。

SSR標記法是發(fā)展起來的一種以特異引物PCR為基礎的分子標記技術(shù)，具有實驗穩(wěn)定、多態(tài)性高、實驗程序簡單等優(yōu)點，SSR標記法已被廣泛用于農(nóng)作物類品種鑒定。SSR標記法主要包括DNA提取、PCR擴增、凝膠電泳、成像觀察四個基本步驟，檢測程序相對簡單，一份樣品從取樣、檢測及讀取結(jié)果可在幾小時內(nèi)完成，且不受外部環(huán)境與季節(jié)的影響。

SSR標記兩端的序列多是相對保守的單拷貝序列[22-23]。不同品種間微衛(wèi)星基序重復次數(shù)的不同而形成了多態(tài)性，這種多態(tài)性可以通過PCR擴增檢測出來，即為簡單序列長度多態(tài)性[24]。優(yōu)化PCR擴增程序主要是在保證取得較好擴增效果的前提下，縮短反應時間，提高工作效率。詹慶才利用SSR 標記鑒定雜交水稻種子純度時，改變PCR擴增程序，將變性和退火時間改為15 s，延伸時間改為30 s，擴增35個循環(huán)，縮短PCR反應時間，得到了理想的擴增結(jié)果[25]。

SSR標記法的DNA 提取和純化是雜交水稻品種鑒定重要而基礎的操作步驟。劉之熙等分別采用CTAB方法和簡單方法提取“兩優(yōu)培九”幼苗的DNA，均以RM234為引物進行PCR擴增，結(jié)果表明簡單方法提取的DNA不會影響準確性和分辨率，且簡單方法縮短了提取時間，降低成本，極大地提高了工作效率;同時，對傳統(tǒng)CTAB和PCR程序進行了改善，利用4%的瓊脂糖凝膠進行電泳[26]。

隨著雜交水稻新品種組合的培育與栽培，SSR引物的特異性可能會逐步退化，甚至喪失，已有的SSR引物可能滿足不了新品種鑒定要求，因此，需不斷創(chuàng)建新的SSR標記。馬紅勃等利用12個SSR標記構(gòu)建了42份雜交稻（其中有24份材料為雜交稻品種，另外18份材料為雜交稻親本）的DNA指紋圖譜，并對于遺傳多樣性進行統(tǒng)計分析[27]。通過聚類將這42個品種分成六大類群，較好地反映了品種之間的親緣關(guān)系，也為雜交親本的選擇提供了一定的參考。同時，所構(gòu)建的指紋圖譜也為雜交水稻品種鑒定提供了科學依據(jù)。肖子發(fā)等通過實驗選用了48對SSR引物，多于國內(nèi)一些專業(yè)檢測機構(gòu)或科研單位采用的12對或24對引物[28];通過實驗，利用篩選的48對SSR引物完成了湖南省審定的77個雜交稻品種的DNA指紋圖譜構(gòu)建，成功建立了品種指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，可有效進行雜交水稻品種鑒定。

根據(jù)國家水稻品種鑒定DNA指紋方法推薦的24對SSR引物，任輝對8個雜交水稻品種進行SSR分子標記鑒定，優(yōu)化DNA提取方法和PCR擴增反應體系，并將SSR分子標記鑒定結(jié)果與分別在5個不同省份的制種基地田間鑒定結(jié)果進行比較，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：SSR分子標記鑒定結(jié)果與田間檢驗結(jié)果無顯著差異，但SSR分子標記鑒定結(jié)果更容易區(qū)分異（雜）種子，而田間鑒定結(jié)果難以區(qū)分相似的異（雜）株[29]。因此認為，采用SSR分子標記鑒定方法能夠更快速、更準確地鑒定雜交稻品種。

2014年6月1日，農(nóng)業(yè)部出臺了新的農(nóng)業(yè)行業(yè)標準（NY/T1433-2014）《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程? SSR標記法》，當日正式實施，推薦引物增加48對，其中，保留了原來的19對引物，新增29對引物。曾曉珊等為確保研究結(jié)果與國家標準的一致性，采用國家規(guī)定的水稻品種真實性鑒定方法中要求的48對引物，對27個親本進行了DNA指紋分析，依次對27個水稻親本材料基因組DNA（按順序排列）進行PCR擴增，經(jīng)顯影、拍照，得到一套SSR引物的圖譜[30]，根據(jù)所構(gòu)建的指紋圖譜，可對某一品種的真實性進行鑒定。

綜上所述，通過SSR分子標記鑒定雜交水稻品種，其檢測技術(shù)已成熟。但隨著每年不斷出現(xiàn)新的品種，SSR引物的特異性可能喪失，因此，還需不斷優(yōu)化和更新SSR分子標記鑒定體系。

3.5? SNP標記鑒定

SNP指在基因組上單個核苷酸的變異所形成的核酸序列多態(tài)性，是目前認為最具有研發(fā)潛力的檢測技術(shù)，與SSR標記相比具有以下優(yōu)勢：1）遺傳穩(wěn)定性更高;2）高效檢測、通量高，每次可檢測多個樣品，甚至上千個，實現(xiàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析自動化，共享發(fā)展數(shù)據(jù)平臺，間接降低了檢驗檢測成本;3）檢測快速，檢測位點數(shù)可達幾百萬個;4）部分標記與功能基因甚至植物表型相關(guān)。

美國康奈爾大學McCouch實驗室率先在Affymetrix公司定制了含有4.4萬個SNP標記的SNP芯片，國內(nèi)研究者對幾千份國內(nèi)外水稻品種的基因序列進行了重新測序，這些研究表明，通過SNP芯片構(gòu)建水稻品種DNA指紋是切實可行的[31]。

王鈺等通過一種基于PCR的水稻SNP標記檢測方法結(jié)果得出，開發(fā)的SNP標記有助于分析水稻品種的遺傳差異[32]，也為建立水稻SSR/SNP指紋數(shù)據(jù)庫，實現(xiàn)水稻種子信息比對、追溯、防偽、統(tǒng)計、監(jiān)管和服務等功能奠定了基礎。

2021年6月20日，全國農(nóng)技中心在北京組織召開農(nóng)業(yè)行業(yè)標準審定會，《水稻品種真實性鑒定? SNP標記法》《玉米品種真實性鑒? SNP標記法》《小麥品種真實性鑒定? SNP標記法》3項標準通過審定。標志著SNP標記法在生物檢測領(lǐng)域有著廣闊的發(fā)展前景，為維護農(nóng)作物品種創(chuàng)新、市場流通秩序等提供了強有力的技術(shù)支撐及依據(jù)。

盡管SNP成本高、一般實驗室無法完成檢測分析工作，但SNP這項檢測技術(shù)具有準確性高的特點，能夠有效避免形態(tài)學和環(huán)境因素的干擾，從而極大地縮短育種進程。因此，構(gòu)建全國統(tǒng)一標準的品種高密度SNP指紋十分必要，今后有望以加強SNP分型檢測儀等實驗室應用平臺為載體，融合種植鑒定，實驗室分子鑒定及分子育種協(xié)同發(fā)展，開啟雜交水稻品種鑒定的新篇章。

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收稿日期：2022-04-21

作者簡介：丁健美（1975—），女，湖南株洲人，本科，研究實習員，主要從事農(nóng)業(yè)檢驗檢測。E-mail：djm1800@126.com。