LC-MS和LC-NMR在中藥三萜和甾體類成分快速鑒定中的研究進(jìn)展

李蓮慧 吳正波 王葳 李大山 王文靜

【摘 要】 三萜和甾體類化合物作為具有多方面生物活性的化學(xué)成分，一直是中藥活性和質(zhì)量控制研究的重點。文章對近十年運用LC-MS和LC-NMR聯(lián)用技術(shù)鑒定、分析中藥中三萜類和甾體類成分的前沿方法進(jìn)行綜述。兩種聯(lián)用技術(shù)的特點是將HPLC的高效分離能力和MS、NMR精確的結(jié)構(gòu)表征能力巧妙結(jié)合起來，方法更具選擇性和靈敏性。與此同時，筆者討論了LC-MS和LC-NMR在中藥三萜和甾體結(jié)構(gòu)指認(rèn)中的適用性并進(jìn)行了展望，期望為實現(xiàn)中藥中復(fù)雜成分結(jié)構(gòu)的快速鑒定提供借鑒。

【關(guān)鍵詞】 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;液相色譜-核磁聯(lián)用;三萜;甾體;結(jié)構(gòu)鑒定

【中圖分類號】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2022）13-0066-07

Progress on LC-MS and LC-NMR in Rapid Identification of Triterpenoids and Steroids in Traditional Chinese Medicine

LI Lianhui WU Zhengbo WANG Wei LI Dashan* WANG Wenjing*

School of Chinese Materia Medica and Yunnan Key Laboratory of Southern Medicinal Resources， Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming650500， China

Abstract：Triterpenoids and steroids， as chemical components with various biological activities， have been the focus of quality control of traditional Chinese medicine （TCM）. Herein we reviews the frontier methods for the identification and analysis of triterpenoids and steroids in TCM by LC-MS and LC-NMR in recent decade. The characteristics of the two combined techniques are the ingenious combination of the high-efficiency separation ability of HPLC and the accurate structural characterization ability of MS and NMR， which shows more selective and sensitive. At the same time， the applicability of LC-MS and LC-NMR in the identification of triterpenoids and steroids in TCM is discussed and prospected， which could provide reference for the rapid identification of complex components structures in TCM.

Key words：LC-MS; LC-NMR; Triterpenoids; Steroids; Structural Identification

中藥組成成分具有多樣性，在使用時一般需結(jié)合辨證施治原則[1]，其品質(zhì)與含量不但決定疾病防治效果，且直接影響患者的生命安全，所以有必要對中藥中的指標(biāo)性成分進(jìn)行定性定量分析。三萜和甾體類化合物是許多珍貴中草藥的主要有效成分，以游離或苷類形式廣泛分布于自然界的天然藥物中[2]。這兩類化合物都有著廣泛的藥理活性，其中，抗腫瘤活性一直是國內(nèi)外研究的熱點[3-7]。有些已被用作藥物或新先導(dǎo)化合物的可能來源[8]。但天然產(chǎn)物的內(nèi)在多樣性對分析、分離及檢測帶來了很大的挑戰(zhàn)，在早期的一些研究中，這兩類化合物通常被檢測為復(fù)合物[9]，若要完成分子結(jié)構(gòu)及其立體結(jié)構(gòu)的鑒定多通過NMR、MS、XRD、UV、IR、ORD、CD等波譜數(shù)據(jù)綜合分析，這不僅效率低、周期長、耗資大，不適合當(dāng)前快速發(fā)展的新藥研發(fā)過程，而且還經(jīng)常導(dǎo)致活性成分尤其是低含量成分的丟失或破壞。迄今為止，單獨針對此類成分結(jié)構(gòu)鑒定的報道日益增加。因此，選用一項高選擇性和高靈敏度檢測技術(shù)是準(zhǔn)確測定中藥中這兩類成分的重要選擇，也是一種重要的發(fā)展趨勢。

從單個技術(shù)采集到技術(shù)聯(lián)用，中藥化學(xué)成分分析采集技術(shù)層出不窮[10]。在聯(lián)用技術(shù)中，液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）和液相色譜-核磁共振（LC-NMR）聯(lián)用技術(shù)以其相對較高的分辨率、靈敏度和專屬性優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、生物、環(huán)保等領(lǐng)域[11-15]，近年來，該技術(shù)日臻完善，應(yīng)用前景日漸廣闊。相比于傳統(tǒng)HPLC或NMR技術(shù)，將該技術(shù)運用于結(jié)構(gòu)類型多樣的三萜和甾體類成分，更能快速準(zhǔn)確地提供結(jié)構(gòu)鑒定的特征信息。

筆者在總結(jié)前人研究成果的基礎(chǔ)上，結(jié)合最新研究動態(tài)，對近十年運用LC-MS和LC-NMR聯(lián)用技術(shù)分析中藥中三萜類和甾體類成分的方法進(jìn)行了綜述。

1 LC-MS聯(lián)用技術(shù)研究現(xiàn)狀

LC-MS聯(lián)用是以高效液相色譜為分離方法，質(zhì)譜為檢測手段的現(xiàn)代分析技術(shù)。在對未知成分進(jìn)行研究時，其原理是先基于高效液相色譜對于復(fù)雜樣品的高分離能力得到相對單一的化合物，再串聯(lián)質(zhì)譜得到特征碎片離子等結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合已知結(jié)構(gòu)化合物的裂解規(guī)律，對未知成分進(jìn)行定性分析，此過程及目的也正好滿足中藥指紋圖譜研究的需要[16-17]。

三萜類和甾體類化合物多以缺少生色團的苷類形式存在，傳統(tǒng)的HPLC檢測方法通常因靈敏度不高而很難對微量成分進(jìn)行響應(yīng)測定[18]。而質(zhì)譜檢測可克服基質(zhì)抑制效應(yīng)，提供化合物的分子量和結(jié)構(gòu)信息，特別適合分析中藥復(fù)雜基質(zhì)中的三萜和甾體成分[9]。

質(zhì)譜有高分辨質(zhì)譜（HRMS）和低分辨質(zhì)譜（LRMS）之分?；贖RMS靈敏度高、掃描速度快且質(zhì)量范圍寬，能提供母離子和子離子小數(shù)點后4～6位的精確質(zhì)量測定等優(yōu)點，該技術(shù)常被應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的快速鑒定和區(qū)分分子量（MW）近似的化合物[19]。但HRMS缺少靶標(biāo)性掃描模式，對微量成分的檢測不如LRMS[20-21]。發(fā)展至今，HRMS主要有飛行時間質(zhì)譜（time-of-flight，TOF）、四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（quadrupole time-of-flight，QTOF）和線性離子阱串聯(lián)靜電場軌道阱質(zhì)譜（linear ion trap quadrupole-Orbitrap，LTQ-Orbitrap）等。常見的LRMS包括三重四級桿質(zhì)譜（triple quadrupole，TQ）、離子阱質(zhì)譜（ion trap，IT），以及結(jié)合了前兩種質(zhì)譜優(yōu)點的三重四級桿線性離子阱質(zhì)譜（triple quadrupole linear ion trap，QTRAP）[22]，另外，離子遷移譜與質(zhì)譜聯(lián)用作為一種新型分析技術(shù)，對于較低含量組分的分析鑒定有著重要意義，也常用于藥物的質(zhì)量控制、快速篩查和分析檢測[23]。相對而言，LRMS的掃描速度與分辨率雖不及HRMS，但該技術(shù)具有多種特有的掃描模式，對微量與痕量成分的檢測具有一定優(yōu)勢[24-25]。因此，將優(yōu)勢互補組合的HRMS-LRMS用于中藥成分鑒定更能提高檢測效率。現(xiàn)將已報道的，針對中藥三萜和甾體類成分快速鑒定，對完善中藥質(zhì)量評價能夠提供技術(shù)支持的現(xiàn)代聯(lián)用技術(shù)的幾類常用方法介紹如下。

1.1 液相色譜-離子阱質(zhì)譜（IT-MS）聯(lián)用 Sut等[26]為了闡明銀背委陵菜（Potentilla argentea）和直立委陵菜（Potentilla recta）水提物的生物制藥潛力，采用一維、二維核磁共振結(jié)合LC-DAD-ESI-MS和LC-APCI-MS技術(shù)，建立了LC-MS、NMR化學(xué)相關(guān)圖譜，鑒定出鞣花素、黃酮醇苷和三萜等成分，并對每個成分進(jìn)行定量分析，最終證明兩種植物的水提物都是最有效的ABTS清除劑。

孟月華等[27]應(yīng)用Finnigan LCQ Fleet IT-MS對預(yù)知子提取物在ESI-MSn負(fù)離子模式下能夠得到較多三萜皂苷類成分的多級裂解信息，結(jié)果發(fā)現(xiàn)裂解形成的皂苷元以常春藤皂苷元（m/z 471）及少量阿江欖仁酸（m/z 487）、齊墩果酸（m/z 455）等為主，這些特征苷元碎片離子可作為鑒定皂苷類型的直接依據(jù)，最后共推測鑒定了17種皂苷類成分，為建立該類化合物的LC-MS指紋圖譜提供參考方法。

相比于其它聯(lián)用技術(shù)，IT-MS存在穩(wěn)定性差、動態(tài)范圍窄、質(zhì)量歧視效應(yīng)難以規(guī)避及軟件適配度差等問題，但I(xiàn)T-MS成本較低，適用于三萜、甾體類分子結(jié)構(gòu)的局部分析。

1.2 液相色譜-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（QTOF-MS）聯(lián)用 Xia等[28]利用超高效液相色譜-電噴霧四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-ESI-QTOF-MS）在SWATH MSE模式下，同時采集前體離子[M+H]+、[M+NH4]+、[M+Na]+和相應(yīng)的碎片離子，對刺五加葉片中的三萜皂苷進(jìn)行綜合結(jié)構(gòu)表征。SWATH MS作為一種互補的信息采集技術(shù)用于分辨洗脫物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果共有89個三萜皂苷和14個皂苷元被明確鑒定。在這些化合物中，有33個被鑒定為潛在的新化合物，包括首次報道的刺五加屬中的malonyl-saponin。此外，在進(jìn)行多元統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的三萜類化合物是大量穩(wěn)定存在的，Xia等[28]建議將其中幾個三萜皂苷作為建立刺五加化學(xué)成分指紋圖譜以及質(zhì)量評價的新指標(biāo)成分。

Król-Kogus等[29]采用HPLC-ELSD-ESI-QTOF-MS方法對波蘭栽培的葫蘆巴種子中的甾體皂苷復(fù)合物進(jìn)行了定性和定量分析，該研究首次將兩根C-18柱串聯(lián)分析胡蘆巴皂苷，并對ELSD檢測器參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。在此方法下共檢測出26種呋甾固醇皂苷，其中24種已完成初步鑒定。在對波蘭和亞洲葫蘆巴種子中的總皂苷HPLC-MS圖譜進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，不同品種的皂苷種類和含量都存在顯著差異，與亞洲品種相比，波蘭胡蘆巴種子中原薯蕷皂苷含量最高，而其他甾體皂苷含量相對較少。

由此可見，LC-QTOF-MS由于離子化效率提高，在化合物結(jié)構(gòu)鑒別方面存在較大優(yōu)勢，可作為分析三萜和甾體及其皂苷的一種常用方法，但在色譜分辨能力上往往不足以分離分子量近似的化合物。應(yīng)用LC-MS/MS，可以提供苷元獨特的裂解模式，包括附著在苷元上的糖基的數(shù)量和類型的信息，以進(jìn)一步完善化合物的結(jié)構(gòu)表征[30]。

Ling等[8]開發(fā)了一種分離和表征蘆筍（Asparagus cochinchinensis，RAC）干根藥材中主要活性成分——甾體皂苷的一種方法。該研究首次使用電噴霧電離與四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-ESI-QTOF-MS/MS）相結(jié)合的新型高效液相色譜法對RAC中甾體皂苷進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。此方法因運用串聯(lián)質(zhì)譜，裂解所得到的離子信息得以進(jìn)一步放大，所以即使在極低濃度下，甾體皂苷也具有豐富的苷元和糖鏈結(jié)構(gòu)解析信息。最后，共檢測和鑒定了30個甾體皂苷，其中包括17個潛在的新化合物。此方法可廣泛應(yīng)用于化學(xué)成分相對復(fù)雜樣品的綜合分析，可為進(jìn)一步建立指紋圖譜進(jìn)行質(zhì)量控制提供化學(xué)基礎(chǔ)。但此方法在對糖單元的連接位置確認(rèn)上仍有一定局限性。

Li等[31]在UHPLC-QTOF-MS/MS分析基礎(chǔ)上，建立多反應(yīng)檢測掃描（MRM）的特征離子采集方法，對澤瀉三萜類成分進(jìn)行了全面表征，通過建立指紋圖譜對不同產(chǎn)地、不同炮制手段的澤瀉樣品中三萜類成分進(jìn)行成分差異研究?；赒TRAP-MS/MS的MRM技術(shù)建立的特征輪廓譜能夠?qū)?fù)雜的QTOF總離子流色譜圖簡化，采用此方法測定澤瀉三萜化合物，其響應(yīng)值約為QTOF-MS/MS的3倍，因此特別適合微量化合物的定性和定量分析。譜圖顯示，不同產(chǎn)地的澤瀉樣品經(jīng)炮制后其三萜類成分的相對含量發(fā)生不同程度變化。該研究所建立的MRM特征輪廓譜分析方法對不同產(chǎn)地/炮制手段的澤瀉藥材質(zhì)量控制具有潛在的應(yīng)用價值。

Q-TOF的出現(xiàn)有效地解決了中藥分析中組分復(fù)雜、定量困難等問題，但Q-TOF只能形成二級碎片，對于未知結(jié)構(gòu)化合物的解析尚有不足，且離子源更換麻煩，配套的液相系統(tǒng)穩(wěn)定性欠佳，在后期發(fā)展中應(yīng)更注重硬件適配問題。

1.3 液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜（TQ-MS）聯(lián)用 鑒于triple TOF-MS/MS具有較強的全掃描定性分析能力，而QTRAP-MS/MS具有良好的定量靈敏度和穩(wěn)定性，Chen等[32]將兩種技術(shù)的優(yōu)勢充分結(jié)合，采用超快速液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（UFLC-Triple TOF-MS/MS）和超快速液相色譜-三重四極桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（UFLC-QTRAP-MS/MS）對西洋參（PJR）中的皂苷建立定性定量分析方法;采用UFLC-Triple TOF-MS/MS對PJR中的皂苷成分進(jìn)行鑒定，通過標(biāo)準(zhǔn)品對照分析，明確鑒定出23種皂苷，其余皂苷通過裂解行為分析也得以初步推斷。采用UFLC-QTRAP-MS/MS同時測定不同采收時間的PJR樣品中13種皂苷的含量，并通過灰色關(guān)聯(lián)度分析（Grey Relational Analysis， GRA）對樣本質(zhì)量進(jìn)行了評價，為確定PJR最佳采收期提供了基本信息，對其質(zhì)量評價和控制有一定的指導(dǎo)意義。

在MRM應(yīng)用于三萜苷類的分析表征時，廣泛使用傳統(tǒng)的直接進(jìn)樣方式，此方法下，MRM離子對的使用并不規(guī)范。為此，Xia等[33]研究發(fā)現(xiàn)，三萜皂苷經(jīng)溫和的氣相分解質(zhì)子化或形成氨化前體（DPAP）后，可以高效、穩(wěn)定地生成一系列豐富的配基離子（[A+H-nH2O]+（n = 0，1，2，3，…）?；谶@些考慮和發(fā)現(xiàn)，他們在QTRAP 4000儀器上設(shè)計了一種創(chuàng)新性的ESI+-MRM-DPAP-MS方案，可以對植物中的三萜皂苷進(jìn)行快速定性和定量分析。通過對20種中草藥中85個模型化合物的詳細(xì)研究，經(jīng)驗證、評價后正式提出了ESI+-MRM-DPAP-MS策略。他們將該方法實際應(yīng)用于三七（Panax notoginseng）、紅毛七（Caulophyllum robustum）、龍牙楤木（Aralia elata）等中藥中的總?cè)贫嘣镔|(zhì)群疊加圖譜采集，作為構(gòu)建質(zhì)量控制的綜合評價平臺，也表現(xiàn)出良好的敏感性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。

TQ-MS在保留了原四極桿質(zhì)譜的強定量能力的基礎(chǔ)上，提供了串級功能，使質(zhì)譜的定性能力和效率進(jìn)一步加強。除一般離子掃描功能外，TQ-MS還具有SRM、MRM、母離子掃描等功能，且MSM信噪比也有了明顯提高，這對特征基團的結(jié)構(gòu)研究有很大幫助。但TQ-MS在分辨率方面仍有不足，在進(jìn)行三萜、甾體類化合物鑒別時，近似m/z離子的干擾比較大。

1.4 液相色譜-離子淌度（遷移）質(zhì)譜（IMS）聯(lián)用 上述質(zhì)譜方法為三萜和甾體的結(jié)構(gòu)表征提供了極大的便利，但在鑒定結(jié)構(gòu)上僅具有細(xì)微差異的同分異構(gòu)化合物時仍具挑戰(zhàn)性，所以難以建立準(zhǔn)確、完整的HPLC/UPLC圖譜。而Colson等[34]發(fā)現(xiàn)，利用目標(biāo)組分在行波離子遷移質(zhì)譜（TWIMS）中離子遷移到達(dá)時間分布（ATD）的不同，可對立體異構(gòu)和位置異構(gòu)混合物進(jìn)行部分分離。但因同分異構(gòu)體皂苷ATD差異微小，必須先用液相色譜進(jìn)行初步分離，后用TWIMS分析才能監(jiān)測到。基于此，他們通過整合上述方法再結(jié)合MALDI-TOF、LC-MS和碰撞誘導(dǎo)解離實驗分析了七葉樹（horse chestnut，HC）種子中的皂苷提取物，使結(jié)構(gòu)極其相似的七葉皂苷和異七葉皂苷得以分離鑒定。此方法的開發(fā)又大大拓展了質(zhì)譜的性能和應(yīng)用范圍，為進(jìn)一步完善三萜、甾體類指紋圖譜，提升中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了新的思路。

Feng等[35]針對茯苓提取物中羊毛甾烷類化合物提出了一種基于UPLC-IMS-MSE聯(lián)用技術(shù)，并結(jié)合UNIFITM軟件對所獲取的MS數(shù)據(jù)進(jìn)行有針對性的過濾，建立內(nèi)部化合物數(shù)據(jù)庫，以快速區(qū)分和鑒別該提取物中同分異構(gòu)體的分析策略。因IMS可以根據(jù)質(zhì)譜的電荷狀態(tài)、形狀、尺寸進(jìn)行第二次分離，使得UPLC-IMS-MSE組合分析技術(shù)在分離鑒定方面更具優(yōu)勢。在此方法下，根據(jù)化合物的中性丟失、特征離子、裂解途徑情況，最終共鑒定出121種羊毛脂甾烷型三萜酸，其中有三種化合物被首次檢測到。

面對中藥成分結(jié)構(gòu)類型多樣、濃度變化大、極性跨度大、異構(gòu)體廣泛等挑戰(zhàn)，色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)不斷發(fā)展，在維度方面也繼續(xù)提升。以UPLC/IM-QTOF-HDMSE為代表，由離子遷移率提供離子分離附加維數(shù)，UPLC進(jìn)一步對成分進(jìn)行洗脫保留分離，使QTOF-MS得到了更多的結(jié)構(gòu)鑒別信息。這對從中藥的眾多成分中有選擇性地直接分析目標(biāo)結(jié)構(gòu)類型具有重要意義。

Huang等[36]在對桔梗的化學(xué)成分進(jìn)行綜合表征時運用UPLC/IM-QTOF-HDMSE聯(lián)用技術(shù)，根據(jù)同位素豐度、元素組成和碎片離子信息，初步鑒定了187個化合物，其中三萜皂苷為85個。對洗脫順序進(jìn)行重點考察后確定C-3位上糖基與苷元的連接方式是三萜皂苷結(jié)構(gòu)異構(gòu)化的主要原因。在分析桔梗皂苷異構(gòu)體時，對UPLC/IM-QTOF-HDMSE和UPLC-QTOF-MSE兩種聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)前者鑒別的數(shù)量是后者的兩倍以上，由此可見此聯(lián)用平臺可支持結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣成分的深入研究。

近年來，IMS在異構(gòu)體分析方面彰顯出極大的優(yōu)勢，但該技術(shù)缺乏離子遷移主要標(biāo)準(zhǔn)，分析速度受遷移率與質(zhì)譜儀間界面效率的限制，因此，要將IMS用于三萜、甾體類化合物的快速鑒定需在上述問題上有所改善。

2 LC-NMR聯(lián)用技術(shù)研究現(xiàn)狀

傳統(tǒng)的三萜和甾體類化合物的結(jié)構(gòu)表征分析方法，主要使用單一的核磁共振（NMR）技術(shù)對已純化的樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，這使得樣品的前處理耗時費力。因此，對快速識別和表征結(jié)構(gòu)方法的需求越來越大。

現(xiàn)今，LC-NMR的相關(guān)運用在天然產(chǎn)物鑒定[37]、多聚物分析[38]、異構(gòu)體研究[39]等領(lǐng)域的應(yīng)用迅速增多。HPLC-NMR能夠?qū)⒎蛛x和結(jié)構(gòu)鑒定連為一體，大大簡化了分析過程。隨著該技術(shù)在藥物化學(xué)中的普遍應(yīng)用，現(xiàn)已逐漸成為這一領(lǐng)域中最強有力的分析手段之一，繼而也推動了藥材、飲片、提取物以及制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)研究[40]，為建立更加有效、科學(xué)、可行的質(zhì)量評價體系，提升完善中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了重要支撐。

LC-NMR聯(lián)用技術(shù)最常見的有LC-NMR直接在線聯(lián)用和液相色譜-固相萃取-核磁共振（LC-SPE-NMR）在線聯(lián)用兩種模式，隨著分析要求的提高，LC-NMR又與質(zhì)譜（MS）、尺寸排阻（SEC）等技術(shù)聯(lián)合，LC-MS-NMR和LC-SEC-NMR聯(lián)用等技術(shù)應(yīng)運而生。

Horník等[41]以蕁麻根提取物為研究對象，比較了已有的HPLC-NMR法與他們自己開發(fā)的SEC-NMR法用于快速篩選植物甾醇的優(yōu)缺點。在進(jìn)行HPLC-NMR檢測后，共分離檢測到9種主要成分，在相似的游離植物甾醇1H NMR波譜中，明確鑒別Δ5-Avenasterol、Campesterol和β-Sitostanol等7種甾醇。此方法雖靈敏度較高，卻比較耗時;SEC-NMR法檢測速度相對較快，但由于檢測的是一段時間的洗脫成分，所以無法避免強烈的信號重疊，經(jīng)條件優(yōu)化后分離度有所提高，但靈敏度低、定量限過高等問題依然存在。由此可見，HPLC-NMR法用于分析甾醇類物質(zhì)更具優(yōu)勢。

LC-SPE-NMR是一個相對較新的概念，Koning等[42]于1998年第一次發(fā)表了在線SPE裝插與NMR探針耦合的例子，后續(xù)才有人報道相關(guān)的應(yīng)用。

Khakimov等[43]以冬芥（barbarea vulgaris， winter cress）的無毛型（G）和短柔毛型（P）為研究對象，展示了一種利用GC-MS、LC-MS/MS和LC-SPE-NMR/MS聯(lián)用分析平臺篩選三萜皂苷的方法。該研究使用Bruker/Spark Prospekt 2 LC-SPE系統(tǒng)連接MicroTOF質(zhì)譜，以15min為一個收集點，通過LC-SPE-NMR/MS和GC-MS分析洗脫液后發(fā)現(xiàn)，兩種冬芥中的8種三萜苷元的分子量存在差異。若單獨使用各種分析方法，要實現(xiàn)從復(fù)雜的混合物樣品中直接闡明皂苷的完整結(jié)構(gòu)是具有較高挑戰(zhàn)性，然而，多個平臺聯(lián)合使用，可以獲得大量關(guān)于苷元的結(jié)構(gòu)以及糖基的數(shù)量和連接位置等綜合信息。Khakimov等[43]所提出的方法實現(xiàn)了詳細(xì)比較植物提取物中的完整皂素譜以及水解樣品中的皂素苷元譜。

LC-NMR有多種操作模式，如連續(xù)流、環(huán)貯流、停流等，不同模式在圖譜質(zhì)量、分析時間上有明顯區(qū)別，在實際操作中，可根據(jù)樣品的特性和檢測目的來靈活調(diào)節(jié)。目前，該技術(shù)相對較低的靈敏度和較高的鑒定限是阻礙其發(fā)展的根本原因之一。在分析三萜和甾體類化合物時，為了提高該技術(shù)的靈敏度，大多研究者會選擇在NMR探頭、磁體、參數(shù)、運行模式上做調(diào)節(jié)，但對HPLC系統(tǒng)操作條件的選擇和優(yōu)化也是重要的措施之一。

Goulas等[44]以HPLC-SPE-NMR和HPLC-DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基）聯(lián)用為分析手段，對狹葉香科Teucrium polium的提取物進(jìn)行研究。在多次實驗后，在0.1%醋酸溶液（A）和乙腈（B）梯度洗脫，0.6 mL/min流速，Bruker AV-500NMR儀，3 mm LC SEI 13 C- 1H探頭測定條件下，發(fā)現(xiàn)了在狹葉香科中含量最高、活性最強的成分為金石蠶苷，抗氧化的主要成分為毛蕊花苷和二甲氧基槲皮素。此條件下，可于在線檢測的同時，直接建立LC-NMR信號圖譜，實現(xiàn)以最快速度對其中的三萜苷類進(jìn)行歸屬和指認(rèn)，且對于特征的末端官能團而言，峰的信號強度還可作為定量的依據(jù)。

3 總結(jié)與展望

文章綜述了近十年來LC-MS和LC-NMR聯(lián)用技術(shù)用于三萜和甾體類化合物的分離、檢測和鑒別，可推動中藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的分析手段和方法進(jìn)一步完善。三萜和甾體類化合物雖結(jié)構(gòu)類型多樣，但卻有規(guī)律可循，尤其在LC-MS中三萜皂苷類中各類糖基斷裂產(chǎn)生的中性丟失是最為明顯的裂解特征，而后期UPLC的引入，無論在靈敏度還是在準(zhǔn)確性上都有所提高。總體而言，兩種聯(lián)用技術(shù)的特點是將HPLC的高效分離能力和MS、NMR精確的結(jié)構(gòu)表征能力巧妙結(jié)合起來，在應(yīng)用過程中二者各有優(yōu)劣，可合理綜合使用。建立穩(wěn)定、高效和準(zhǔn)確的分析方法，無論是對中藥整體還是其中的三萜、甾體類成分都有重大意義。在今后的研究過程中還應(yīng)不斷地優(yōu)化LC-MS和LC-NMR聯(lián)用技術(shù)向更快、更精準(zhǔn)方向發(fā)展，推動中藥化學(xué)成分指紋圖譜的完善和建立。

參考文獻(xiàn)

[1]

項麗玲， 苗明三. 中藥質(zhì)量生物學(xué)評價的思考 [J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2020， 31（6）： 1437-1439.

[2]楊秀偉. 人參中三萜類化學(xué)成分的研究[J]. 中國現(xiàn)代中藥， 2016， 18（1）： 7-15.

[3]WANG P， SONG T， SHI R， et al. Triterpenoids from Alisma species： phytochemistry， structure modification， and bioactivities [J]. Frontiers in Chemistry， 2020（8）： 363.

[4]MALYARENKO T V， MALYARENKO O S， KiCHA A A， et al. In Vitro Anticancer and Cancer-Preventive Activity of New Triterpene Glycosides from the Far Eastern Starfish Solaster pacificus [J]. Marine drugs， 2022， 20（3）： 216.

[5]TAND Z Y， LI Y， TAND Y T， et al. Anticancer activity of oleanolic acid and its derivatives： Recent advances in evidence， target profiling and mechanisms of action [J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 2022（145）： 112397.

[6]KUMAR A，GUPTA K B，DHIMAN M，et al.New pentacyclic triterpene from Potentilla atrosanguinea Lodd.as anticancer agent for breast cancer targeting estrogen receptor-α [J].Natural product research，2021，DOI：10.1080/14786419.2021.1986495.

[7]ABD E H M S M， AZI O M A E， IBRAHIM H A H， et al. First report of steroid derivatives isolated from starfish Acanthaster planci with anti-bacterial， anti-cancer and anti-diabetic activities [J]. Natural product research， 2021，31（12）：1-8.

[8]LING Y， TANG Y， XV Y， et al. Rapid screening and identification of chemical constituents from Ophiopogon japonicus by high-performance liquid chromatography coupled to electrospray ionization and quadrupole time-of-flight mass spectrometry [J]. Journal of Chromatographic Science， 2020， 58（7）： 641-650.

[9]孫燕， 葛斐林， 薛春苗， 等. 天然產(chǎn)物中五環(huán)三萜類化合物檢測方法的研究進(jìn)展 [J]. 中國現(xiàn)代中藥， 2019， 21（4）： 552-558.

[10]李元元，彩虹，生寧， 等.中藥多成分藥代動力學(xué)分析技術(shù)研究進(jìn)展[J].質(zhì)譜學(xué)報， 2022，DOI：10.7538/zpxb.2022.0021.

[11]RAIMONDO M， BORINNI A， PRESTINACI F， et al. A NIR， 1H-NMR， LC-MS and chemometrics pilot study on the origin of carvedilol drug substances： a tool for discovering falsified active pharmaceutical ingredients [J]. Analytical methods： advancing methods and applications， 2022，14（14）：1396-1405.

[12]ABDALLAH M F， GIRGIN G， BAYDAR T， et al. Occurrence of multiple mycotoxins and other fungal metabolites in animal feed and maize samples from Egypt using LC-MS/MS [J]. Journal of the science of food and agriculture， 2017， 97（13）： 4419-4428.

[13]MIRBABAEI F， MOHAMMADKHAH A， NASERI M T， et al. Unambiguous identification and determination of A234-Novichok nerve agent biomarkers in biological fluids using GC-MS/MS and LC-MS/MS [J]. Analytical and bioanalytical chemistry， 2022， DOI： 10.1007/s00216-022-03964-1.

[14]WANG H Z， SUN P L， ZHANG X L， et al. Method validation and dissipation kinetics of the new HPPD inhibitor QYR301 in rice， paddy water and paddy soil using a QuEChERS-based method and LC-MS/MS [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2019（184）： 109563.

[15]張哈旦寶力高，布仁巴圖，白塔娜， 等.LC-MS法測定不同產(chǎn)地長柱沙參的指紋圖譜 [J].華西藥學(xué)雜志，2021，36（1）：59-63.

[16]王迪，俞佳，詹固， 等.液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用進(jìn)展 [J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2022，40（2）：68-71.

[17]盧晨娜，楊悅，白思宇，等.藏族藥榜嘎HPLC指紋圖譜研究及其2種基原植物L(fēng)C-MS/MS化學(xué)成分分析[J].中國中藥雜志，2021，46（19）：5027-5037.

[18]TAEWOONG R， JUNG C S， WOO K H， et al. Separation of nine novel triterpene saponins from Camellia japonica seeds using high-performance countercurrent chromatography and reversed-phase high-performance liquid chromatography [J]. Phytochemical analysis： PCA， 2019， 30（2）： 226-236.

[19]WU X W， SUN S， WU X Y， et al. Identification of the metabolites of Methylophiopogonanone A by ultra-high performance liquid chromatography combined with high resolution mass spectrometry [J]. Rapid communications in mass spectrometry： RCM， 2022，36（12）：e9304.

[20]ZARROUK E， LENSKI M， BRUNO C，et al. High-resolution mass spectrometry： Theoretical and technological aspects [J]. Toxicologie Analytique et Clinique， 2021， 34（1）： 3-18.

[21]NARDIN T， LARCHER R， BARNABA C， et al. Alkaloid profiling of Italian alpine herbs using high resolution mass spectrometry （Orbitrap-MS） [J]. Natural product research， 2022， DOI： 10.1080/14786419.2022.2050908.

[22]LV S C， WANG H H， YAN Y ， et al. Quantification and confirmation of four aflatoxins using a LC–MS/MS QTRAP system in multiple reaction monitoring， enhanced product ion scan， and MS3 modes [J]. European Journal of Mass Spectrometry， 2020， 26（1）： 63-77.

[23]王芳，陳潘，席斌，等.離子遷移譜技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展 [J].食品研究與開發(fā)，2021，42（8）：179-185.

[24]CAPRIOTTI A L， CANNAZZA G， CATANI M， et al. Recent applications of mass spectrometry for the characterization of cannabis and hemp phytocannabinoids： From targeted to untargeted analysis [J]. Journal of chromatography. A， 2021， 1655： 462492.

[25]CAMUTO C， GUGLIELMELLI A， DEGIORGIO F， et al. In vitro metabolic profile of mexedrone， a mephedrone analog， studied by high- and low-resolution mass spectrometry [J]. Drug testing and analysis， 2021， 14（2）： 269-276.

[26]SUT S， DALL′ACQUA S， UYSAL S， et al. LC-MS， NMR fingerprint of Potentilla argentea and Potentilla recta extracts and their in vitro biopharmaceutical assessment [J]. Industrial Crops & Products， 2019（131）： 125-133.

[27]孟月華， 黃何松， 余黃鵬， 等. 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定預(yù)知子提取物中的主要化學(xué)成分 [J]. 中草藥， 2013， 44（12）： 1562-1567.

[28]XIA Y G， GONG F Q， GUO X D， et al. Rapid screening and characterization of triterpene saponins in Acanthopanax senticosus leaves via untargeted MS All and SWATH techniques on a quadrupole time of flight mass spectrometry [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2019（170）： 68-82.

[29]KRL-KOGUS B， GLOD D， KRAUZE-BARANOWSKA M. Qualitative and quantitative HPLC-ELSD-ESI-MS analysis of steroidal saponins in fenugreek seed [J]. Acta Pharmaceutica， 2020， 70（1）：89-99.

[30]呂婧，高燕，趙渤年.基于LC-QTOF-MS/MS的西洋參皂苷類成分表征及其增強免疫力作用譜效關(guān)系研究 [J].中華中醫(yī)藥雜志，2020，35（5）：2298-2304.

[31]LI S， JIN S， SONG C， et al. The strategy for establishment of the multiple reaction monitoring based characteristic chemical profile of triterpenes in Alismatis rhizoma using two combined tandem mass spectrometers [J]. Journal of Chromatography A， 2017（1524）： 121-134.

[32]CHEN J， TAN M， ZOU L， et al. Qualitative and quantitative analysis of the saponins in Panacis Japonici rhizoma using ultra-fast liquid chromatography coupled with triple quadrupole-time of flight tandem Mass spectrometry and ultra-fast liquid chromatography coupled with triple quadrupole-linear ion trap tandem Mass spectrometry [J]. Chemical & pharmaceutical bulletin， 2019， 67（8）： 839-848.

[33]XIA Y G， GUO X D， SONG Y， et al. A generic strategy based on gas phase decomposition of protonated and ammoninted precursors producing predictable MRM-MS ion pairs and collision energies for direct analysis of plant triterpene glycosides [J]. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis， 2019（ 165）： 292-303.

[34]COLSON E， DECROO C， COOPER-SHEPHERD D， et al. Discrimination of regioisomeric and stereoisomeric saponins from Aesculus hippocastanum seeds by ion mobility mass spectrometry [J]. Journal of the American Society for Mass Spectrometry， 2019， 30（11）： 2228-2237.

[35]FENG G F， ZHENG Y， SUN Y F， et al. A targeted strategy for analyzing untargeted mass spectral data to identify lanostane–type triterpene acids in Poria cocos by integrating a scientific information system and liquid chromatography–tandem mass spectrometry combined with ion mobility spectrometry [J]. Analytica Chimica Acta， 2018（1033）： 87-99.

[36] HUANG W Z， ZHOU H， YUAN M， et al. Comprehensive characterization of the chemical constituents in Platycodon grandiflorum by an integrated liquid chromatography-mass spectrometry strategy [J]. Journal of Chromatography A， 2021（1654）： 462-477.

[37]GEBRETSADIK T， LINERT W， THOMAS M，et al. LC–NMR for Natural Product Analysis： A Journey from an Academic Curiosity to a Robust Analytical Tool [J]. Sci， 2021， 3（1）： 6.

[38]ELENA U. Applications of Hyphenated Liquid Chromatography Techniques for Polymer Analysis [J]. Chromatographia， 2017， 80（5）： 731-750.

[39]高淑紅，蘇珍枝，楊琳嬌，等.基于液質(zhì)聯(lián)用和核磁共振的龍葵莖化學(xué)成分研究 [J].中草藥，2021，52（5）：1263-1273.

[40]GEBRETSADIK T， LINERT W， THOMAS M， et al. LC-NMR for natural products analysis： a journey from an academic curiosity to a robust analytical tool [J]. Sci， 2019， 1（31）： 1-15.

[41]HORNK ， SAJFRTOVA M， KARBAN J， et al. LC-NMR technique in the analysis of phytosterols in natural extracts [J]. Journal of Analytical Methods in Chemistry， 2013（2013）： 526818.

[42]KONING J A， HOGENBOOM A C， LACKER T， et al. On-line trace enrichment in hyphenated liquid chromatography-nuclear magnetic resonance spectroscopy [J]. Journal Chromatography A， 1998， 813（1）： 55-61.

[43]KHAKIMOV B， TSENG L H， GODEJOHANN M， et al. Screening for triterpenoid saponins in plants using hyphenated analytical platforms [J]. Molecules， 2016， 21（12）：1614.

[44]GOULAS V， GOMEZ-CARAVACA A M， EXARCHOU V， et al. Exploring the antioxidant potential of Teucrium polium extracts by HPLC-SPE-NMR and on-line radical-scavenging activity detection [J]. LWT - Food Science Technology， 2012， 46（1）： 104-109.

（收稿日期：2022-04-18 編輯：黃麗君）