仙靈骨葆膠囊TLC鑒別方法研究

祝清燦　徐東　汪娥　孫宜春　段麗　李慧馨　胡曉

【摘 要】 目的： 提高仙靈骨葆膠囊質(zhì)量標準。方法： 采用薄層色譜法對仙靈骨葆膠囊中淫羊藿、續(xù)斷、丹參、補骨脂、知母進行鑒別。結(jié)果： 薄層色譜斑點清晰，陰性對照無干擾。結(jié)論： 建立的方法專屬性強，重現(xiàn)性好，可作為仙靈骨葆膠囊的定性鑒別。

【關(guān)鍵詞】 仙靈骨葆膠囊;薄層色譜;淫羊藿;續(xù)斷;丹參;補骨脂;知母

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2022）14-0053-04

Studies on TLC Identification of Xianlinggubao Capsules

ZHU Qingcan¹XU Dong¹WANG E¹SUN Yichun^1*DUAN Li¹LI Huixin¹HU Xiao²

1.China National Pharmaceutical Group（Gui Zhou） Tongjitang Pharmaceutical Co.，Ltd，Guiyang 550026，China;

2.State Key Lab.of New Drug and Pharmaceutical Process，Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry， China State Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai 201203，China

Abstract：Objective? To improve the quality standard of Xianlinggubao Capsules.Methods The TLC method was used to qualitatively identify Epimedii folium， Dipsaci radix， Radix et rhizoma， Psoraleae fructus and Anemarrhenaee rhizoma.Results The spotson the TLC plate were clear and the negative control sample didn't disturb.Conclusion The established methods were accurate， reliable， andreproducible， and could be used for the quality control ofXianlinggubao Capsules.

Key words：Xianlinggubao Capsules;TLC; Epimedii Folium; Dipsaci Radix;Radix et Rhizome;Psoraleae Fructus; Anemarrhenaee Rhizoma

仙靈骨葆膠囊收載于《國家中成藥標準匯編》骨傷科分冊，由淫羊藿、續(xù)斷等6味中藥組成，具有滋補肝腎、接骨續(xù)筋、強身健骨的功效。用于骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)疏松癥、骨折、骨關(guān)節(jié)炎、骨無菌性壞死等^[1]。近年來，國內(nèi)外對仙靈骨葆膠囊藥理活性和臨床應(yīng)用的研究成果不斷涌現(xiàn)，但對質(zhì)量標準的研究較少，現(xiàn)行質(zhì)量標準[WS-10269（ZD-0269）-2002-2011Z]中，僅對淫羊藿、丹參和補骨脂進行薄層色譜鑒別，且淫羊藿的鑒別方法斑點拖尾;補骨脂的鑒別方法主斑點Rf值較低;無續(xù)斷和知母的薄層鑒別方法。國家中醫(yī)藥管理局將仙靈骨葆膠囊標準列入中藥重點產(chǎn)品行業(yè)標準制定提升計劃，研究根據(jù)淫羊藿、續(xù)斷、丹參、補骨脂和知母的化學(xué)成分研究結(jié)果^[2-6]，對仙靈骨葆膠囊薄層色譜鑒別方法進行了系統(tǒng)地研究，改進了淫羊藿、丹參、補骨脂的薄層鑒別方法，提高了方法專屬性，增加了續(xù)斷和知母的薄層色譜鑒別方法，提高了質(zhì)量標準的可控性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ML204-102型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;ZF-7N型智能暗箱式三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）;KQ-5000A型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;101-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）;薄層成像儀（CAMAG Visualizer 2）。

1.2 試藥 淫羊藿苷（批號：110737-202017）、川續(xù)斷皂苷Ⅵ（批號：111685-201908），丹參酮ⅡA（批號：110766-201721）、異補骨脂素（批號：110738-201614）、知母皂苷BⅡ（批號：111839-201706）對照品，丹參（批號：120923-201615）、補骨脂（批號：121056-201605）、淫羊藿（批號：121632-201502）、續(xù)斷（批號：121033-201812）、知母（批號：430023-201807）對照藥材，均由中國食品藥品檢定研究院提供。硅膠G預(yù)制板（批號：20180801，青島海洋化工有限公司;批號：1.05626.0001，德國默克公司）?；瘜W(xué)試劑均為分析純;水為純化水。仙靈骨葆膠囊樣品（批號：20180704，20180706，20180708）由國藥集團同濟堂（貴州）制藥有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 淫羊藿、續(xù)斷的鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物1 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液^[7]。

2.1.2 對照藥材溶液的制備 分別取淫羊藿對照藥材、續(xù)斷對照藥材各0.2 g，照2.1.1供試品溶液的制備方法制備淫羊藿對照藥材和續(xù)斷對照藥材溶液。

2.1.3 混合對照品溶液的制備 分別取淫羊藿苷對照品、川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品，加甲醇制成每1 mL含淫羊藿苷0.2 mg和川續(xù)斷皂苷Ⅵ 1 mg的混合溶液，作為混合對照品溶液^[8]。

2.1.4 陰性對照溶液的制備 按照仙靈骨葆膠囊處方配比，分別取除淫羊藿、續(xù)斷外的其他處方藥味，按照仙靈骨葆膠囊制備工藝制備缺淫羊藿和續(xù)斷的陰性樣品，照2.1.1供試品溶液的制備方法制備缺淫羊藿和續(xù)斷的陰性對照溶液。

2.1.5 薄層鑒別方法及結(jié)果 吸取上述溶液各2～5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，使成條帶狀（8 mm），以三氯甲烷-甲醇-水（8∶3∶1.5）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，在105 ℃加熱，置紫外光（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與淫羊藿對照藥材和淫羊藿苷對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯綠色的熒光條帶^[9]。再噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至條帶顯色清晰，在日光下檢視。供試品色譜中，在與續(xù)斷對照藥材和川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的棕色條帶。如圖1所示。

2.2 丹參、補骨脂的鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物4 g，置具塞錐形瓶中，加乙醚50 mL，超聲處理5 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，作為供試品溶液^[10-11]。

2.2.2 對照藥材溶液的制備 取丹參對照藥材1 g，照2.2.1供試品溶液的制備方法制備丹參對照藥材溶液。再取補骨脂對照藥材0.2 g，加乙酸乙酯20 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，作為補骨脂對照藥材溶液。

2.2.3 混合對照品溶液的制備 分別取丹參酮ⅡA、異補骨脂素對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含丹參酮ⅡA 0.5 mg、異補骨脂素0.2 mg的混合溶液，作為混合對照品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按照仙靈骨葆膠囊處方配比，分別取除丹參、補骨脂外的其他處方藥味，按照仙靈骨葆膠囊制備工藝制備缺丹參和補骨脂的陰性樣品，照2.2.1供試品溶液的制備方法制備缺丹參和補骨脂的陰性對照溶液。

2.2.5 薄層鑒別方法及結(jié)果 吸取上述溶液各2～5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，使成條帶狀（8 mm），以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（14∶1∶0.5）為展開劑^[12]，展開，取出，晾干，在日光下檢視。供試品色譜中，在與丹參對照藥材和丹參酮ⅡA對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙色條帶。噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液，晾干，置105 ℃下加熱，在紫外光燈（365 nm）下放置5 min左右檢視。供試品色譜中，在與補骨脂對照藥材和異補骨脂素對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的天藍色熒光條帶。如圖2所示。

2.3 知母的鑒別

2.3.1 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物3 g，置具塞錐形瓶中，加50 mL甲醇，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次15 mL，棄去乙酸乙酯層，合并水層，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次15 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌4次，每次20 mL，取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液^[13]。

2.3.2 對照藥材溶液的制備 取知母對照藥材0.2 g，照2.3.1供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。

2.3.3 對照品溶液的制備 取知母皂苷BⅡ?qū)φ掌罚蛹状贾瞥擅? mL含1 mg的對照品溶液。

2.3.4 陰性對照溶液的制備 照仙靈骨葆膠囊處方配比，分別取除知母外的其他處方藥味，按仙靈骨葆膠囊制備工藝制成不含知母的陰性樣品。照2.3.1供試品溶液的制備方法制備知母陰性對照品溶液。

2.3.5 薄層鑒別方法及結(jié)果 吸取供試品溶液3～7 μL、對照藥材溶液5 μL、對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，使成條帶狀（6 mm），以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸（7∶3.5∶1.0∶0.5）的下層溶液為展開劑^[14]，展開，取出，晾干，再以正丁醇-甲酸-三氯甲烷（4∶0.5∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液-乙醇（1∶6）的混合溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與知母皂苷BⅡ?qū)φ掌泛椭笇φ账幉纳V相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。如圖3所示

3 討論

3.1 供試品溶液制備 根據(jù)化學(xué)成分的溶解性，分別對提取溶劑（甲醇、乙醇、乙酸乙酯、水），萃取溶劑（乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇），超聲提取時間（10 min、20 min、30 min），樣品取樣量（0.5 g、1 g、3 g、5 g、7 g）、加入溶劑量（10 mL、30 mL、50 mL）等條件進行考察，結(jié)果表明，以本文中制備方法制備的供試品溶液鑒別斑點最清晰。

3.2 色譜條件考察 根據(jù)展開樣品主要化學(xué)成分的極性，選擇適用性較廣的展開劑，對展開系統(tǒng)如：甲苯-乙酸乙酯-甲酸（1.5∶4∶0.7）、水飽和的正丁醇、正己烷-乙酸乙酯-甲酸（3∶1∶0.15）、石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（4∶2）、三氯甲烷-甲醇-水-甲酸（6.5∶3.5∶1.5∶0.5），硅膠板種類（硅膠G板、硅膠GF₂₅4板、硅膠H板），點樣量（1 μL、3 μL、5 μL、7 μL、10 μL），條帶點樣寬度（5 mm、6 mm、7 mm、8 mm），薄層板預(yù)平衡時間（10 min、20 min、30 min）等進行了考察。結(jié)果表明，使用文中所用的色譜條件時，展開效果較好，供試品與對照品及對照藥材在不同的檢視條件下色譜條帶數(shù)較多，分離度較好。

3.3 專屬性考察 分別吸取供試品溶液、對照品溶液、對照藥材溶液、陰性對照品溶液，進行薄層鑒別試驗，根據(jù)擬鑒別化學(xué)成分的化學(xué)性質(zhì)，選用不同的顯色劑顯色，結(jié)果顯示，供試品色譜在與對照品相對應(yīng)位置顯相同顏色的熒光條帶，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置有相同顏色的熒光條帶，陰性樣品無干擾;在日光下檢視，供試品色譜在與對照品色譜相對應(yīng)位置有相同顏色條斑，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置有相同顏色條帶斑，陰性對照無干擾，說明方法的專屬性較好。

3.4 顯色劑的選擇 顯色的順序直接影響薄層鑒別的效果。通過對三氯化鋁乙醇溶液、硫酸乙醇溶液等多種顯色劑和顯色條件進行顯色研究。結(jié)果^[15]表明，三氯化鋁是一種可逆性的顯色劑，噴三氯化鋁顯色后，被激發(fā)的熒光斑點大多數(shù)是可逆的，顯色檢視完畢后，不影響薄層板再噴其他顯色劑顯色，因此，在進行淫羊藿和續(xù)斷的鑒別時，先噴3%三氯化鋁乙醇溶液進行淫羊藿鑒別，后噴硫酸乙醇溶液進行續(xù)斷鑒別。

綜上，本實驗利用薄層色譜鑒別技術(shù)，對仙靈骨葆膠囊薄層鑒別方法進行系統(tǒng)研究，根據(jù)擬鑒別化學(xué)成分的化學(xué)性質(zhì)，選用不同的顯色劑顯色，在不同的顯色條件下分別收集顯色信息，從而鑒別不同的藥材，優(yōu)化了淫羊藿、丹參、補骨脂的薄層鑒別方法，增加續(xù)斷、知母的薄層鑒別方法，實現(xiàn)制備同一供試品，使用同一塊薄層板，同時鑒別兩種不同的藥材，與原標準中的薄層色譜鑒別方法相比，可節(jié)省檢測時間，提高檢測效率。新建的薄層鑒別方法能控制處方中大部分藥味，全面地控制產(chǎn)品質(zhì)量，為該制劑的質(zhì)量標準提升提供參考。

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（收稿日期：2021-11-02 編輯：陶希睿）