富含膠原蛋白肉制品中亞硝酸鹽檢測方法改進

張新 向俊 唐文杰 ?康紹英 胡小軍

摘 要：為解決富含膠原蛋白肉制品亞硝酸鹽檢測過程中出現(xiàn)的樣液混濁、難以過濾、實驗回收率低等問題，本方法引入木瓜蛋白酶對富含膠原蛋白肉制品進行分解，通過加標實驗和精密度實驗發(fā)現(xiàn)，本方法加標回收率在93.6%～97.8%，相對標準偏差范圍在1.7%～4.1%。方法的改進有效地解決了該類食品的亞硝酸鹽檢測過程中出現(xiàn)的困擾，極大地提高了檢測的準確度。

關(guān)鍵詞：膠原蛋白;肉制品;亞硝酸鹽;木瓜蛋白酶

Improved Detection Method of Nitrite in Collagen-Rich Meat Products

ZHANG Xin1，2， XIANG Jun1，2， TANG Wenjie1，2， KANG Shaoying1，2， HU Xiaojun1，2

（1.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Safety Monitoring and Early Warning， Changsha 410007， China; 2.Hunan Provincial Institute of Produce and Goods Quality Inspection， Changsha 410007， China）

Abstract： In order to solve the problems of turbidity of sample solution， difficult to filter and low experimental recovery in the detection process of collagen-rich meat products， papain was introduced in this method to decomposed collagen-rich meat products. The results were found by standard test and precision test： the recoveries were 93.6%～97.8%， and the relative standard deviations were 1.7%～4.1%. The improvement of the method effectively solved the trouble in the process of nitrite detection of this kind of food， and greatly improved the accuracy of detection.

Keywords： collagen; meat products; nitrite; papain

膠原蛋白為細胞外基質(zhì)的重要成分，具有良好的延伸性能[1]，主要歸結(jié)于其含有一個或者多個由α-鏈組成的三螺旋結(jié)構(gòu)，同時還含有少量的葡萄糖和半乳糖。膠原蛋白在皮膚組織細胞中主要承擔儲水功能，保持皮膚的細嫩度，柔軟度及彈性度的生理功能[2-4]。近幾年，隨著人們生活品質(zhì)的提高和對健康的重視，富含膠原蛋白的肉制品越來越受到大家的青睞。在肉制品中加入亞硝酸鹽可以起到護色及防腐作用，但亞硝酸鹽可與血紅蛋白結(jié)合，生成高鐵血紅蛋白，使紅細胞運輸氧的能力減弱，對人體造成危害，因此肉制品中亞硝酸鹽含量是每年國家抽檢的重點檢測項目，成人亞硝酸鹽中毒的劑量為0.3～0.5 g，亞硝酸鹽攝入量超過3.0 g會產(chǎn)生嚴重的致死風(fēng)險[5]。GB 2762—2017 規(guī)定，肉制品中亞硝酸鹽的限量值為30 mg/kg。有研究表明，長期過量食用富含亞硝酸鹽的食品可能誘發(fā)高鐵血紅蛋白癥，同時還會增加患癌癥風(fēng)險[6-9]。

目前亞硝酸鹽的檢測國家標準為GB 5009.33—2016，標準規(guī)定，樣品進行前處理時需要進行加熱，此時富含膠原蛋白的肉制品往往會出現(xiàn)溶液混濁、難以過濾、實驗回收率低等現(xiàn)象。因此，很有必要對該類產(chǎn)品亞硝酸鹽的測定方法進行改進。邵明華[10]通過先定性篩選，再定量檢測的方法對國標法進行了改進，能一定程度上減少檢驗時間，提高檢驗員工作效率，但是該方法容易出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象，導(dǎo)致漏檢事故發(fā)生;同時樣品本身顏色較深時對定性結(jié)果也存在一定干擾。木瓜蛋白酶屬于一種半胱氨酸蛋白水解酶，具有良好的穩(wěn)定性和很強的蛋白水解能力，可以從番木瓜及其根莖中提取得到。它可以通過切割氨基酸的肽鍵的方式改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，對蛋白質(zhì)進行水解，從而有效降低蛋白質(zhì)的分子量[11-14]。本方法利用木瓜蛋白酶對膠原蛋白良好的分解作用，對膠原蛋白進行分解處理，從而有效解決該類產(chǎn)品亞硝酸鹽測定過程中存在的難題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5種富含膠原蛋白的不同食品：樣A為香辣豬腳;樣B為鹵雞爪;樣C為臘豬臉;樣D為鹵鴨掌;樣E為五香豬皮，以上樣品均為市場上購買。

木瓜蛋白酶（酶活力≥3 700 U/g）、硼酸鈉、亞鐵氰化鉀、鹽酸、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸、乙酸鋅和亞硝酸鹽標準液。所用試劑均為分析純，所用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

萬分之一電子分析天平，奧豪斯儀器有限公司;DZKW-4電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;紫外可見光分光光度計（T9CS），北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

準確稱取5 g均勻試樣于錐形瓶中，再加入0.1 g木瓜蛋白酶，同時加12.5 mL 50 g/L飽和硼砂溶液，加入大約150 mL、70 ℃左右的超純水，手動搖勻后放置沸水浴中加熱15 min。取出冷卻至室溫，將樣液全部轉(zhuǎn)移到200 mL容量瓶中，分別加入5 mL?106 g/L亞鐵氰化鉀溶液和5 mL 220 g/L乙酸鋅溶液，最后用超純水定容。靜置30 min后用濾紙過濾，初濾液30 mL棄去不用，后面濾液備用。同時按照GB 5009.33—2016準確稱取5 g均勻試樣于錐形瓶中，加12.5 mL 50 g/L飽和硼砂溶液，加大約150 mL、70 ℃左右的超純水，混勻，于沸水中加熱15 min，取出置冷水浴中冷卻，并放置至室溫。定量轉(zhuǎn)移上述提取液至200 mL容量瓶中，加入5 mL 106 g/L亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入5 mL 220 g/L乙酸鋅溶液。加水至刻度，搖勻，放置30 min后用濾紙過濾，棄去初濾液30 mL，濾液備用。相較于國標法，本法前處理加入了木瓜蛋白酶對樣品中膠原蛋白進行酶解。

1.3.2 亞硝酸鹽的測定

于50 mL具塞比色管中準確吸取40.0 mL前處理好的濾液，同時另外準確吸取相當于0 μg、1.0 μg、2.0 μg、3.0 μg、4.0 μg、5.0 μg、7.5 μg、10.0 μg和12.5 μg的亞硝酸鈉標準使用液，分別置于50 mL具塞比色管中。將2 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液分別加入標準管與試樣管中，混勻，靜置5 min后各加入1 mL 2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液。定容搖勻，靜置15 min。在波長538 nm處用1 cm比色杯測量標準液和樣液的吸光度，通過繪制標準曲線比較得到樣液濃度。同時做試劑空白。

2 結(jié)果與分析

2.1 本方法與國標法前處理樣液吸光度對比

對樣A、樣B、樣C、樣D和樣E分別按國標GB 5009.33—2016和本方法進行前處理。將處理的樣液于波長538 nm處測吸光度，所測結(jié)果如表1所示。本方法處理的樣液吸光度明顯小于國標法處理的樣液，國標法處理的樣液混濁，而本方法處理的樣液明顯澄清透明，其原因在于富含膠原蛋白樣品受熱再冷卻溶液發(fā)生團聚，造成樣液混濁，從而導(dǎo)致吸光度偏高，給后期亞硝酸鹽的測定造成偏高的影響。而本方法加入木瓜蛋白酶后膠原蛋白被酶解，樣液變得澄清，便于樣液亞硝酸鹽的測定，有利于實驗準確度的提高。

2.2 本方法與國標法加標回收率對比

分別稱取5 g樣A、樣B、樣C、樣D和樣E，同時用本方法和國標法分別加入方法測定低限（1 mg/kg）、2倍方法測定低限、10倍方法測定低限的亞硝酸鈉標準物質(zhì)，進行加標回收實驗，做6次平行實驗，取平均值，其結(jié)果見表2。

由表2可知，本方法加標回收率在93.6%～97.8%，具有良好的準確度。同時，本方法回收率明顯較國標法好，其原因在于國標法前處理時富含膠原蛋白的樣品會出現(xiàn)團聚包覆，不利于亞硝酸鹽的有效提取，造成加標回收率明顯偏低。本方法通過加入木瓜蛋白酶對樣品進行酶解，避免了團聚的發(fā)生，使得樣品澄清透明，便于提取，回收率及準確度得到有效提升。

2.3 精密度實驗

分別稱取5.000 0 g樣A、樣B、樣C、樣D和樣E，采用本方法進行6次平行實驗，其結(jié)果如表3所示。經(jīng)過6次平行測定，實驗RSD在1.7%～4.1%，小于5.3%，滿足實驗技術(shù)要求，該方法具有良好的精密度。

3 結(jié)論

本實驗改進了富含膠原蛋白肉制品亞硝酸鹽測定的前處理，通過木瓜蛋白酶的加入，水解膠原蛋白，有效地解決了該類產(chǎn)品樣液混濁，回收率低的檢測困擾。本方法加標回收率在93.6%～97.8%，相對標準偏差在1.7%～4.1%，小于5.3%，該方法可以有效提高該類產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量檢測的準確度。

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基金項目：食品安全監(jiān)測與預(yù)警湖南省重點實驗室開放基金項目（2020KFJJ11）。

作者簡介：張新（1984—），男，湖南邵陽人，碩士，工程師。研究方向：食品檢驗與安全研究。