糙米發(fā)酵濾液的護(hù)膚功效研究

王志華 陳雪平 任姝靜 陸震 劉衛(wèi) 王玉玲

關(guān)鍵詞：糙米發(fā)酵濾液、斑馬魚、保濕、美白、舒緩、修復(fù)

隨著消費(fèi)者對(duì)護(hù)膚品綠色、安全觀念的增強(qiáng)，以及對(duì)功效需求的持續(xù)增長，現(xiàn)代護(hù)膚品原料已由早期的化學(xué)合成物質(zhì)向天然物質(zhì)發(fā)展，原料生產(chǎn)技術(shù)也已經(jīng)從化學(xué)合成、植物提取發(fā)展到生物發(fā)酵、生物合成，其中生物發(fā)酵技術(shù)是現(xiàn)階段行業(yè)的主流與熱點(diǎn)發(fā)展方向。相較于從植物中提取的原料和化學(xué)合成原料，發(fā)酵原料具有天然的屬性，可以將一些有致敏風(fēng)險(xiǎn)的大分子物質(zhì)分解為小分子物質(zhì)[1]，在發(fā)酵過程中還可以產(chǎn)生新的營養(yǎng)素，不僅營養(yǎng)豐富，生物活性和安全性也更高，且具備獨(dú)特的功效[2]。其基本原理是利用微生物緩慢發(fā)酵植物原料，釋放植物中的活性物質(zhì)，再經(jīng)微生物酶類修飾結(jié)構(gòu)、改造或分解，進(jìn)一步獲得有利于皮膚吸收，提高護(hù)膚功效的有價(jià)值的生物活性物質(zhì)[3]。糙米作為最常見的全谷物原料，由于保留了種皮和胚芽，較高程度地實(shí)現(xiàn)了稻米的全營養(yǎng)保留，其中含有的酚類[4]、多糖[5]、蛋白質(zhì)等成分具有提高人體免疫力、清除體內(nèi)自由基、延緩衰老等美容功效，在護(hù)膚品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。因此，以糙米作為原料，提取其中有益于皮膚健康的活性物質(zhì)，制成發(fā)酵濾液后，其主要成分為多種氨基酸、有機(jī)酸、小分子多肽等活性物質(zhì)，在護(hù)膚領(lǐng)域具有極高的潛在應(yīng)用價(jià)值。

所以，選擇合適的方法評(píng)價(jià)糙米發(fā)酵濾液在護(hù)膚品中的實(shí)際應(yīng)用效果是十分必要的。

斑馬魚與人類具有高達(dá)87%的疾病相關(guān)基因相似度[6]，在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用已超過30年，相比于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)而言，斑馬魚是完整生物體實(shí)驗(yàn)，測試結(jié)果更可靠。另外，斑馬魚個(gè)體小，繁殖力強(qiáng)，個(gè)體間差異小，可同時(shí)開展大量樣品實(shí)驗(yàn)，且測試成本更低。因此，斑馬魚測試不論是在產(chǎn)品早期的原料篩選，還是配方驗(yàn)證方面都得到了廣泛應(yīng)用[7][8][9]。本文通過斑馬魚胚胎測試，研究了華熙生物科技股份有限公司的BioyouthTM-Brice糙米發(fā)酵濾液（INCI名：酵母菌/大米發(fā)酵產(chǎn)物濾液）在皮膚保濕、美白、舒緩及修復(fù)方面的功能。

01材料與方法

1.1試劑

糙米發(fā)酵濾液、氯化鈉、苯硫脲工作液、硫酸銅、吲哚美辛工作液、蘇丹黑染色液、熟地黃提取物。

1.2儀器

SMZ645解剖顯微鏡（Nikon公司）、AZ100電動(dòng)聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡（Nikon公司）、96孔板（NestBiotech公司）、CP214精密電子天平（Ohaus公司）

1.3試驗(yàn)動(dòng)物

野生型AB系斑馬魚，以自然或成對(duì)交配方式進(jìn)行繁殖。

02試驗(yàn)部分

2.1補(bǔ)水保濕功效評(píng)價(jià)模型

斑馬魚表皮具有一定的滲透壓耐受范圍，超過耐受范圍將產(chǎn)生失水現(xiàn)象[10]。使用高滲透壓溶液處理斑馬魚，會(huì)導(dǎo)致斑馬魚尾部因失水而皺縮、變小。據(jù)此，可以建立斑馬魚補(bǔ)水保濕的誘導(dǎo)模型。

將72尾3d大斑馬魚胚胎隨機(jī)平均分成3組，各組轉(zhuǎn)移至3cm培養(yǎng)皿中，分別設(shè)置為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和樣品處理組，分別加入5mL魚胚胎培養(yǎng)液、5mL濃度為15g/L的氯化鈉溶液和5mL氯化鈉溶液（15g/L）與樣品（5g/L）的混合液，于28±1℃恒溫箱中培養(yǎng)3h后對(duì)魚胚胎進(jìn)行顯微鏡拍照后用ImageJ測量尾部面積并進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。

2.2美白功效評(píng)價(jià)模型

人類皮膚變黑的主要原因是酪氨酸酶促進(jìn)黑色素合成，而斑馬魚具有和人類相同的黑色素調(diào)控機(jī)制，皮膚結(jié)構(gòu)也與人類高度相似，且斑馬魚在胚胎階段是透明的，色素細(xì)胞易于觀察[11]，方便于顯微鏡下拍照，用分析軟件定量讀取黑色素含量水平，可比較魚胚胎黑色素變化水平，因此，斑馬魚技術(shù)可有效地評(píng)價(jià)護(hù)膚品的美白功效。

實(shí)驗(yàn)參照T/SHRH036-2021化妝品黑色素抑制—斑馬魚胚胎測試方法。將96尾8h大斑馬魚胚胎分別置于96孔板中，每孔含1尾魚胚胎，隨機(jī)平均分為4組，設(shè)置為空白對(duì)照組、100%黑色素抑制組、陽性對(duì)照組和樣品處理組，分別加入0.2mL魚胚胎培養(yǎng)液、0.2mL濃度為1.5mg/mL的苯硫脲溶液（完全抑制黑色素生成，用作100%美白效果對(duì)標(biāo)數(shù)據(jù)）、0.2mL濃度為2.5g/L的曲酸溶液和0.2mL濃度為5g/L的樣品溶液，于28±1℃恒溫箱中培養(yǎng)48h后對(duì)魚胚胎進(jìn)行顯微鏡拍照，用ImageJ測量魚胚胎透光率作為色素信號(hào)強(qiáng)度并進(jìn)行計(jì)算統(tǒng)計(jì)分析。

2.3舒緩功效評(píng)價(jià)模型（中性粒細(xì)胞）

斑馬魚胚胎的中性粒細(xì)胞和人體中性粒細(xì)胞在形態(tài)、生化和生理功能上高度相似。受到外界刺激后，免疫反應(yīng)的發(fā)生將導(dǎo)致中性粒細(xì)胞致免疫細(xì)胞的遷移和聚集，而中性粒細(xì)胞是在損傷或病菌入侵部位第一批出現(xiàn)的白細(xì)胞，作用是清除感染或有害物質(zhì)[12][13]，因此，應(yīng)用硫酸銅誘導(dǎo)斑馬魚胚胎側(cè)線區(qū)域神經(jīng)丘細(xì)胞損傷而引起中性粒細(xì)胞聚集的模型[14]進(jìn)行測試，比較受試物處理組和模型對(duì)照組的魚胚胎側(cè)線區(qū)域中性粒細(xì)胞的數(shù)量變化，可作為評(píng)價(jià)原料、配方或產(chǎn)品舒緩功效的一種有效手段。

將72尾魚胚胎分為3組，各置于3cm培養(yǎng)皿中，設(shè)置為模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組和樣品組，分別加入5mL含0.16mg/L五水硫酸銅的魚胚胎培養(yǎng)液、5mL含0.16mg/L五水硫酸銅和0.0036mg/L吲哚美辛（已知具有抑制中性粒細(xì)胞聚集作用）[14]的魚胚胎培養(yǎng)液和5mL含0.16mg/L五水硫酸銅和5g/L樣品的魚胚胎培養(yǎng)液，于28±1℃恒溫箱中培養(yǎng)40—45min后，將魚胚胎進(jìn)行固定并使用蘇丹黑染液（中性粒細(xì)胞特異性染料[15]）進(jìn)行染色，顯微鏡下拍照后計(jì)數(shù)側(cè)線區(qū)域內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)目并進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。

2.4修復(fù)功效評(píng)價(jià)模型

當(dāng)皮膚受到傷害時(shí)必須快速重生來修復(fù)皮膚屏障，在胚胎階段，傷口愈合十分迅速且不會(huì)留下傷疤;但過了胚胎階段，傷口愈合需經(jīng)過凝血、炎癥、皮膚再生、血管重生和肉芽組織的形成，最終形成傷疤等步驟。斑馬魚在傷口修復(fù)過程中，除了不會(huì)形成凝血外，其余皮膚修復(fù)過程與人類相同[16]。因此，可以作為人體皮膚修復(fù)功效的檢測篩查模型[17]。

將72尾切除尾鰭的魚胚胎隨機(jī)平均分為3組，轉(zhuǎn)移至96孔板中，每孔含1枚魚胚胎，分別設(shè)置為空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組和樣品組，分別加入0.2mL魚胚胎培養(yǎng)液、0.2mL濃度為1mg/mL熟地黃提取物和0.2mL濃度為5g/L的樣品溶液，放置于28±1℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，然后于顯微鏡下對(duì)魚胚胎進(jìn)行拍照，用ImageJ測量尾鰭長度并進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。

2.5數(shù)據(jù)處理

以上功效評(píng)價(jià)結(jié)果均采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，P<0.05為具有顯著性差異。

03結(jié)果與討論

3.1補(bǔ)水保濕功效

如圖1所示，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組斑馬魚尾部面積明顯減小，表明斑馬魚補(bǔ)水保濕功效評(píng)價(jià)模型造模成功。樣品處理組斑馬魚胚胎尾巴面積明顯大于模型組，其收縮抑制率為72±4%（P=0.043），這說明BioyouthTM-Brice糙米發(fā)酵濾液可以防止因高滲透壓引起的失水，具有顯著的補(bǔ)水保濕效果。

3.2美白功效

如圖2所示，空白對(duì)照組的斑馬魚胚胎具有較高水平的黑色素，與空白對(duì)照組相比，使用濃度為5g/L的糙米發(fā)酵濾液處理的斑馬魚胚胎，其黑色素含量明顯降低，抑制率達(dá)15±2.4%（P=0.00053），這說明BioyouthTMBrice糙米發(fā)酵濾液在該測試濃度下可以顯著抑制斑馬魚胚胎黑色素生成，具有一定的美白功效。

3.3舒緩功效

如圖3所示，經(jīng)硫酸銅溶液處理后，模型組的斑馬魚胚胎側(cè)線區(qū)域具有較多的中性粒細(xì)胞聚集，而添加5g/L的糙米發(fā)酵濾液的試驗(yàn)組，側(cè)線區(qū)域中性粒細(xì)胞數(shù)目明顯減少，抑制率為48±8%（P=0.00035），這說明BioyouthTM-Brice糙米發(fā)酵濾液在該測試濃度下可以顯著抑制斑馬魚胚胎中性粒細(xì)胞聚集，具有顯著的舒緩功效。

3.4修復(fù)功效

如圖4所示，與空白對(duì)照組相比，樣品處理組斑馬魚尾鰭長度（紅色虛線與實(shí)線間距離）明顯增大，BioyouthTM-Brice糙米發(fā)酵濾液在該測試濃度下對(duì)斑馬魚胚胎尾鰭修復(fù)促進(jìn)率為17±2.4%（P=0.0023），該樣品具有一定的皮膚修復(fù)功效。

04結(jié)果與討論

綜上所述，濃度為5g/L的BioyouthTM-Brice糙米發(fā)酵濾液具有顯著的保濕、美白、舒緩和修復(fù)功效。推測其機(jī)理是：經(jīng)過發(fā)酵后，其本身含有的酚類、多糖和大分子蛋白質(zhì)類可以分解為小分子的氨基酸以及有機(jī)酸類等營養(yǎng)物質(zhì)[18]，是天然保濕因子的主要成分，能夠促使糙米發(fā)酵濾液具有極強(qiáng)的水合、保濕能力，并且可以重塑皮膚屏障;另一方面，糙米中含有豐富的維生素E、植酸、乳酸、多酚類等多種活性成分[19]，能夠激活衰老細(xì)胞，促進(jìn)表皮細(xì)胞分裂和基底層細(xì)胞再生，有助于促進(jìn)皮膚屏障修復(fù)，減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生，此外，陳保平等人的研究證明，酵母菌/大米發(fā)酵濾液可以在一定程度上抑制黑色素生成，從而延緩皺紋、黃褐斑、老年斑的出現(xiàn)，使肌膚看起來光滑、明亮[20]。

因此，糙米發(fā)酵濾液作為化妝品原料，具有良好的護(hù)膚功效，作為護(hù)膚品配方基質(zhì)，在保濕、美白、修復(fù)、舒緩等功效方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。