SymWhite?377，一種源于天然靈感的高效美白成分

01市場背景

從古至今，“一白遮百丑的”觀念始終深入人心。即使社會對“美麗女性”的定義會隨著文化和時尚的演變而不斷調(diào)整，但唯獨“膚白”的標準始終屹立不倒。根據(jù)智研咨詢發(fā)布的《2017—2022年中國美白市場監(jiān)測及前景預測報告》，超過80%的女性有美白需求。

另外根據(jù)美麗修行大數(shù)據(jù)顯示，2021年美白祛斑市場規(guī)模高達5013億元。因此在美白的道路上，女性尤其是亞洲女性的追求永無止境，并最終為美白活性成分的持續(xù)發(fā)展增加推動力。

02開發(fā)思路

開發(fā)一種新型皮膚增白劑的方法有很多。包括：①抑制黑色素生成;②抑制黑色素從黑色素細胞向角質(zhì)形成細胞轉(zhuǎn)移;③抑制黑素細胞樹突生長;④抑制角質(zhì)形成細胞分泌的促黑色素因子如α-MSH或內(nèi)皮素-1;⑤促進黑色素代謝[1，2，3]。在這些策略中，通過抑制酪氨酸酶活性來抑制黑色素的產(chǎn)生是最有效的。因為酪氨酸酶催化了黑色素生物合成過程中第一步及速度控制步的反應，即由酪氨酸羥基化生成3，4一二羥基苯丙氨酸（多巴）。

羥基芪化合物已被證明是有效的酪氨酸酶抑制劑。白藜蘆醇是一種植物抗毒素，可從毛葉藜蘆（根）、西伯利亞紅松（樹皮）、葡萄等多種植物中提取。而氧化白藜蘆醇是從桑葉中提取的一種活性物質(zhì)也是這類物質(zhì)的主要代表。白藜蘆醇與曲酸具有相同的活性，但其氧化活性是曲酸的32倍[4]。此外，從面包果樹中提取的二苯乙烯衍生物，如高黃綠桑和異戊二烯氧化白藜蘆醇，其效果分別是曲酸的33.3倍和13.1倍[5]。但眾所周知，二苯乙烯極其不穩(wěn)定，兩個苯環(huán)之間的反式雙鍵在輻射下容易發(fā)生異構反應，形成相應的順式二苯乙烯。后者快速分解，形成環(huán)丁烷二聚體和更多的高分子量光化學產(chǎn)物。

我們的目標是開發(fā)一種具有優(yōu)良美白效果的光穩(wěn)定二苯乙烯衍生物。我們從樟子松（Pinussylvestris）的親脂提取物中發(fā)現(xiàn)3，5-二羥基二苯乙烯和3-0-甲基衍生物，它們是優(yōu)良的酪氨酸酶抑制劑，但光照不穩(wěn)定。因此，我們通過化學合成對赤松的結構進行了改進，以獲得最佳的功效和穩(wěn)定性。最后以二苯基甲烷衍生物4-（1-苯乙基）-1，3-對苯二酚（SymWhite？377）為靶向成分，進行了大量的功效試驗。體外和體內(nèi)實驗證明它是一種高效的皮膚增白劑。

03功效驗證

3.1材料

蘑菇酪氨酸酶（EC.1.14.18.1），購自FLUKAChemieGmbH（Buchs，Switzerland）;l-3，4-二羥基苯丙氨酸，購自跨有機公司（美國新澤西州）;所有細胞培養(yǎng)液來自cambrex（Verviers，Belgium）;Melanoderm水平el-300-b型，MattekCorporation（Ashland，Ma，USA）;所有其他試劑（分析純）均購自sigma（Taufkirchen，德國）。

3.2酪氨酸酶分析試驗

在含50μg/ml蘑菇酪氨酸酶的66.7mM磷酸鹽緩沖液（pH6.8）中進行酪氨酸酶反應，試驗化合物（最終濃度為0.1—1000μg/ml）。反應混合物在96孔微孔板上37°C預培養(yǎng)10min。加入L-3，4-二羥基苯丙氨酸0.1mg/ml（終濃度），在474nm處用分光光度計測定所形成的多巴色素。抑制效果用試驗樣品與對照樣品的比值來表示。計算其IC50值（50%抑制濃度）。

3.3細胞毒性分析試驗

將3T3小鼠纖維瘤細胞或B16v小鼠黑色素瘤細胞以1x104細胞/孔（3T3）和2x104細胞/孔（B16v）的密度接種在96孔微孔板中。然后，在添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（3T3）或RPMI培養(yǎng)基（b16v）中，37℃和5%C02孵育24h，去除培養(yǎng)基，立即配制待測復方溶液和十二醇硫酸鈉溶液（陽性標準品），在新鮮培養(yǎng)基（5%胎牛血清）中溶解，加入微孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)8h。然后去除培養(yǎng)基，用MTT（3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯四唑溴化銨）培養(yǎng)細胞2h。用異丙醇提取染料后，在570nm處測定其吸光度（a），并計算平均值和標準差。根據(jù)以下公式計算細胞活性：活性（%）=（一個試驗物質(zhì)/一個對照樣品）X100%。

3.4對B16v細胞的色度分析試驗

將B16v小鼠黑色素瘤細胞以5X10細胞/孔的密度接種于96孔微孔板中。再添加10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2孵育24h，再加入待測復合物溶液（溶劑：細胞培養(yǎng)液）和10nMα-MSH，培養(yǎng)96h。同樣數(shù)量的培養(yǎng)基也被用于控制。用NaOH提取細胞中的黑色素后，在400nm處測量吸光度（a），計算平均值和標準差。黑色素合成抑制率計算公式如下：色素沉積抑制率（%）=100-[（試驗品A/對照品）X100%]。

3.5在染色3D表皮模型上的分析試驗

MelanoDermtmmel-300-b模型（皮膚類型IV，0.6cm2）在制造商提供的37°C和5%CO2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將4-（1-苯乙基）-1，3-對苯二酚溶于磷酸鹽緩沖液中，分別作用于模型表面（25μL/模型，2個表皮模型），得到0.01%或0.1%的溶液。對照組用純磷酸鹽緩沖液處理。試驗化合物每天一次涂抹表皮模型，每隔一天更換培養(yǎng)基。待培養(yǎng)至規(guī)定時間后，用手術刀將表皮模型從插入物中分離，用Soluene溶劑（30min，60°C）提取，在400nm處測量上清液的吸光度，并與人工合成黑色素的吸光度進行定量分析黑色素含量。

為了測定細胞毒性，將表皮模型按上述方法分別培養(yǎng)在有或無試驗化合物的情況下。14d，3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四苯唑（MTT）處理3D表皮模型3h，異丙醇提取染料，570nm處測定吸光度。

3.6體內(nèi)法試驗

在非輻照皮膚上進行體內(nèi)試驗：在12名亞洲受試者（皮膚類型為III）的背部每天處理2次（面積：12.5cm2），持續(xù)28天。測試階段不允許紫外線照射。在第0天和第28天，通過視覺評分和色度計（L*值，MinoltaCR-300色度計，大阪，日本）評估皮膚顏色的變化。

3.7穩(wěn)定性測試

將含有0.05%4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的水溶液在不同溫度（5°C，室溫，40°C）和pH5.0-9.0條件下培養(yǎng)12周，采用HPLC（HP1100，AgilentTechnologies，waldbronn，Germany）進行定量分析。

光穩(wěn)定性試驗中，將相應組分溶解于甘油中，配制成1%的溶液，分散在12片（20μL/片）上。4張玻片分別在陽光模擬器下照射2h和4h。另取4張作為對照。樣品經(jīng)輻照后提取，用高效液相色譜法定量。計算光降解率相對于對照物質(zhì)（=100%）。

在色牢度測試中，制備含0.5%4-（1-苯乙基）-1，3-醌，含或不含0.5%二苯甲酮-3和0.1%EDTABD的油/水型標準洗劑（pH5.4），用紫外線300WsuntestCPS（Heraeus，Hanau，Germany）燈泡照射24小時，然后用色度計分析樣品相對于安慰劑的顏色變化。褪色等級用輻照前后的值△b*表示。

04結果與討論

在樟子松的乙醇提取物中，除了主要成分松香酸（一種常見于針葉樹中的二萜）外，我們還發(fā)現(xiàn)了二苯乙烯衍生物3，5-二羥基二苯乙烯（赤霉素）和赤霉素-3-0-甲基醚（見圖1）。這兩種二苯乙烯衍生物可以用制備液相色譜法進行分離。但是，我們觀察到赤霉素在紫外線照射下迅速分解（見表1）。

為了獲得更穩(wěn)定的增白靶點，我們通過雙鍵加氫制備了相應的二氫化衍生物。這些化合物二氫chisin和二氫chisin-3-o-甲基醚也是松木[6]中微量的天然成分。光穩(wěn)定性試驗表明，與赤霉素相比，二氫赤霉素具有較高的光穩(wěn)定性（見表1）。

4.1酪氨酸酶抑制

采用曲酸、對苯二酚和β-熊果苷混合，對松二苯乙烯和二氫二苯乙烯的類似物進行蘑菇酪氨酸酶抑制試驗。赤霉素-3-O-甲基醚和二氫赤霉素-3-O-甲基醚均不活躍，說明3-OH在酪氨酸酶抑制中起主要作用。這些結果與ohguchietal.（2003A）[7]的檢驗相關，ohguchietal.（2003A）[7]發(fā)現(xiàn)與雷公藤素相比，雷公藤素-3，5-二甲醚對蘑菇酪氨酸酶沒有抑制作用。有趣的是，二氫赤霉素對酪氨酸酶的抑制效果優(yōu)于赤霉素（50%抑制濃度的IC50值為39.4μM和166.7μm），接近曲酸（IC50值為11.05μm）（見表2）。這一發(fā)現(xiàn)是ohguchi等人（2003A，b）的報告中沒有預料到的[7，8]。他們的觀點是二苯乙烯雙鍵加氫后，其酪氨酸酶抑制活性明顯降低。

遺憾的是，合成的二氫赤霉素采收率太低，不能用于進一步的開發(fā)。因此，我們合成了一些結構與二氫赤霉素非常接近的化合物，并對其進行了蘑菇酪氨酸酶抑制試驗。4-芐基-1，3-對苯二酚的活性與曲酸相近（IC50分別為14.25μM和11.05μM），證實了二氫二苯乙烯能有效抑制酪氨酸酶活性的結論。2-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚對酪氨酸酶的抑制活性較弱（IC50值為258.93μM），這可能與間苯二酚基團的空間位阻有關。出人意料的是，4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚（IC50值為0.50μM）的活性甚至強于4-芐基-1，3-對苯二酚，是所有測試化合物中抑制效果最好的。對苯二酚和β-熊果苷在蘑菇酪氨酸酶抑制試驗中表現(xiàn)出很弱的活性。這與之前發(fā)表的論文[9.10]的實驗結果一致。

此外，4-（1-苯乙基）-1，3-對苯二酚也具有較強的抗光降解性。在非常嚴格的條件下（1%的甘油溶液涂在載玻片上，以40W/m2輻照4h，見表1），降解率僅為5%。將含5%4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的乙醇溶液置于玻璃容器中，用300W紫外燈照射24h（對應的輻射強度約為18W/m2）。經(jīng)HPLC和GCMS分析（未顯示），確認未發(fā)生降解。此外，如圖2，4-（1-苯乙基）-1，3-對苯二酚在最大40°C和pH5.0—9.0條件下可以穩(wěn)定6個月。

然而，即使是酚類化合物的輕微降解也可能導致成品化妝品配方中的變色。因此，我們比較了在不添加任何穩(wěn)定劑、pH5.4的情況下，添加0.5%二苯甲酮-3和同時添加0.5%二苯甲酮-3和0.1%EDTABD的油/水標準配方的穩(wěn)定性。如圖3所示，在不添加任何穩(wěn)定劑的公式1中，出現(xiàn)淺米色變色（△b*值：7.9）。二苯甲酮-3（配方2）明顯減輕了變色情況（△b*值：1.8）。繼續(xù)加入EDTABD（配方3）后，進一步得到了最佳的結果，在這種條件下△b*值僅為0.9。相對于白色安慰劑的這一細微的顏色差別，不再是肉眼可察覺的。

基于其優(yōu)異的酪氨酸酶抑制活性和穩(wěn)定性，利用體外法和體內(nèi)法對（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的功效做進一步評價。

4.2細胞美白功效

接下來，我們研究了4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚降低B16v黑色素瘤細胞黑色素含量的能力。用4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚培養(yǎng)96h后，細胞內(nèi)幾乎沒有黑色素。在所有研究的化合物中，4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚對黑色素合成的抑制作用最強，IC50值分別為67μM和440μM（見表3）。4-芐基-1，3-對苯二酚也表現(xiàn)出良好的細胞美白活性（IC50值=5.08μM）。赤霉素的活性僅與β-熊果苷相當，而二氫紅素不活躍。我們還測試了市場上的一系列其他產(chǎn)品，如鎂、維生素C、磷酸、肌酐、二酸和甘草（數(shù)據(jù)未列）。然而，在我們的細胞測試中，這些產(chǎn)品都沒有顯示出美白活性。

4.3對染色3D表皮模型的美白功效

B16v黑色素瘤細胞是一種小鼠細胞。因此，在研究活性物質(zhì)對人體皮膚黑素生成的影響時，只是一個人工模型。此外，角化細胞分泌促黑素生成的ACTH肽α-MSH、內(nèi)皮素-1等因子作為增效因子并通過吸收黑素細胞分泌的黑素小體在黑素生成中發(fā)揮重要作用。然后，我們研究了4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚相對于彎曲酸在染色的3D表皮模型（Melaniodermtm，皮膚IV型）上的美白效果。每天將含0.1%4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的磷酸鹽緩沖溶液局部應用于3D表皮模型。7d后有明顯的美白效果（未量化）。19d后，觀察到黑色素的生物合成幾乎完全被抑制（黑色素減少了95%）。相反，需要含有1.0%曲酸的磷酸鹽緩沖溶液來達到類似的效果（黑色素減少80%）。最初的深棕色模型幾乎完全脫色（見圖4）。僅含0.01%4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的磷酸鹽緩沖溶液在培養(yǎng)19天后仍然可以使黑素皮層表皮組織的黑色素含量降低40%，這種效果肉眼可以清楚地觀察到（變?yōu)闇\棕色）。相比之下，0.1%的曲酸美白效果可以忽略不計。

這些結果在另一個實驗中得到了證實。用0.1%的4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚溶液在染色的3D表皮模型上連續(xù)處理14d后，黑色素減少98%。14d采用MTT法進行細胞毒性試驗，3D模型細胞活性不受影響。

4.4體內(nèi)法評價4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的美白功效

為了證實4-（1-苯乙基）-1，3-醌在體內(nèi)也有美白作用，我們在臨床試驗范圍內(nèi)考察了4-（1-苯乙基）-1，3-醌對亞洲受試者的皮膚是否有美白作用。在同一實驗中，我們比較了兩種含4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的水分散凝膠的效果。一種凝膠含油量為5.3%，另一種含油量為9.8%（見表4）。經(jīng)比色儀測定，4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚相對0.5%比曲酸和安慰劑的1.0%有明顯的美白效果（見圖5）。從圖中可以看出，4-（1-苯乙基）-1，3-二羥基酚的美白效果明顯（A、B相對于安慰劑P<0.05），且優(yōu)于曲酸（無統(tǒng)計學意義）。在含油量較低（5.3%）的配方中添加4-（1-苯乙基）-1，3-對苯二酚，效果更顯著。

制備方法：將A相和B相分別加熱至約80℃，然后將B相加入A相之中，并混合均勻。在葉片攪拌下加入C相。

在配方B中，F(xiàn)O24409先在中性油中預溶，再添加至油相B中。

05總結與展望

5.1關于SymWhite？？377的開發(fā)

二氫二苯乙烯和二苯甲烷衍生物是高效穩(wěn)定的酪氨酸酶抑制劑。因此，它們是二苯乙烯衍生物美白劑的有價值的選擇。通過高效液相色譜定量分析推斷，二苯基甲烷衍生物4-（1-苯乙基）-1，3-對苯二酚在紫外照射下可以穩(wěn)定存在，最高溫度為40℃，pH為5—9。調(diào)節(jié)pH值至6.0以下，加入廣譜UVA/UVB濾光劑二苯甲酮-3和金屬螯合劑EDTABD，可以防止化妝品洗劑對4-（1-苯乙基）-1，3-醌的少量降解引起的變色。

特別是4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚是迄今為止報道的最有效的酪氨酸酶抑制劑之一。能有效降低b16v黑色素瘤細胞黑色素含量，并能染色3D表皮模型。未受照射的亞洲人皮膚經(jīng)28d后，0.5%的4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚可顯示顯著的美白效果（比色計讀數(shù)和視覺評分），其效果優(yōu)于1.0%曲酸。當4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚應用于低含油量配方時，效果最顯著。結果表明，4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚（Symwhite？？377）是一種有效、穩(wěn)定、安全的皮膚增白劑。

5.2創(chuàng)新與美白的SymRadiance？388&399

基于對膚色改善靶點更全面的調(diào)控，德之馨在專利成分SymWhite？？377的基礎上進行了全新的升級，并開發(fā)出SymRadiance？388、399兩款全新成分。基于創(chuàng)新性的協(xié)同作用，SymRadiance？388、399在抗氧美白的基礎上把功效做的更全面，御氧抗皺，提亮膚色，最終更有效更全面提供肌膚亮白以及環(huán)境暴露導致的膚色暗沉問題。