電針干預(yù)對(duì)帕金森病模型小鼠黑質(zhì)中酪氨酸羥化酶及氧化應(yīng)激因子表達(dá)的影響

趙穎倩,亢愷雯,劉奇,馬雪,李杰,魯剛,王強(qiáng),3,4

[1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,咸陽 712046;2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,咸陽 712046;3.陜西省針?biāo)幗Y(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,咸陽 712046;4.咸陽市神經(jīng)生物學(xué)(針灸)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,咸陽 712046]

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。PD多好發(fā)于中老年人,臨床常根據(jù)患者運(yùn)動(dòng)體征的改變?nèi)珈o止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌肉僵硬和體態(tài)不穩(wěn)來診斷及針對(duì)治療。其主要病理學(xué)特點(diǎn)為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元選擇性變性及缺失,殘存神經(jīng)元中出現(xiàn)以α-突觸核蛋白為主要成分的路易小體[2],導(dǎo)致紋狀體多巴胺耗竭,丘腦功能增強(qiáng)以及皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)的興奮性傳入減少,從而使患者出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙。PD的發(fā)病與遺傳、環(huán)境、免疫、氧化應(yīng)激等多種因素綜合作用有關(guān),氧化應(yīng)激在其中起著至關(guān)重要的作用[3],但其具體的發(fā)病機(jī)制尚未明確[4]。PD在世界范圍內(nèi)影響著近500萬人的身體健康,預(yù)計(jì)2040年全球PD患者人數(shù)將增加4倍[5]。因此,尋找PD相關(guān)致病因素,為治療及預(yù)防提供新的策略和靶點(diǎn)已經(jīng)迫在眉睫。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)小鼠模型是目前應(yīng)用最廣泛的 PD模型,研究已證實(shí)MPTP小鼠模型在癥狀及病理學(xué)方面均符合臨床PD的特征,是一種較理想的PD模型[6]。

本實(shí)驗(yàn)擬通過MPTP皮下緩釋構(gòu)建小鼠PD模型,觀察早期電針干預(yù)對(duì)PD模型小鼠運(yùn)動(dòng)障礙改善、小鼠腦黑質(zhì)組織中酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、氧化應(yīng)激因子超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)-2和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, Gpx-1)蛋白表達(dá)的影響,證明“嗅三針”可以通過抑制 PD小鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng),達(dá)到改善PD模型小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙的目的。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與方法

選取40只10周齡清潔級(jí)雄性昆明小鼠作為研究對(duì)象,體質(zhì)量(18±5)g,實(shí)驗(yàn)使用許可證號(hào)為SYXK(陜)2018-001。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組、PD組、針刺組和左旋多巴組,每組10只。動(dòng)物由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(陜)2020-001。環(huán)境溫度為 20～24 ℃,濕度為40%～70%,12 h明暗交替,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。對(duì)動(dòng)物的處理遵循《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見》[7]。

1.2 主要試劑與儀器

山羊抗鼠SOD2抗體(ab118340,英國(guó)Abcam);山羊抗小鼠Gpx-1抗體(PAB7049, Abnova);山羊抗小鼠TH抗體(ab75875, Abcam);山羊抗兔IgG H&L(HRP)抗體(ab3816,英國(guó) Abcam);抗生物素蛋白生物素化辣根過氧化物酶復(fù)合物(ZY131095,澤葉生物);小鼠 TH免疫組化試劑盒(ab137869,英國(guó) Abcam);Braford蛋白濃度測(cè)定盒(批號(hào) V900144, biosharp);SDS-PAGE凝膠制備盒(批號(hào)V900483, biosharp);左旋多巴(72816,美國(guó)SIGMA);MPTP(M0896,美國(guó)Sigma)。高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼);組織切片機(jī)(德國(guó)萊卡);SDZ-Ⅱ型電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio-Rad);Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics);蛋白電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)。

1.3 模型制備

PD模型[8]采用清潔級(jí)成年昆明小鼠,吸入式麻醉機(jī)麻醉小鼠(異氟醚溶液誘導(dǎo)濃度4%,維持濃度1.5%),手術(shù)過程中持續(xù)麻醉。小鼠后背部皮下0.5 cm左右做橫切口,鈍性分離皮膚與肌肉,手術(shù)植入注滿 MPTP溶液的膠囊滲透壓泵,向泵內(nèi)注射 200 μL的 MPTP溶液,MPTP含量為0.5 mg,緩釋速度7 μL/d,總時(shí)長(zhǎng)4周;空白組小鼠予以同樣處理,泵內(nèi)注射200 μL生理鹽水溶液[9]。小鼠出現(xiàn)震顫、立毛、倦怠及運(yùn)動(dòng)測(cè)試障礙證明造模成功[10]。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 空白組

僅同步抓取,無其他干預(yù)。

1.4.2 PD組

僅植入注滿MPTP膠囊滲透壓泵,之后不進(jìn)行任何干預(yù)。

1.4.3 針刺組

于造模2周后開始采用針刺干預(yù)。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[11]進(jìn)行穴位定位,取神庭和雙側(cè)天樞、上巨虛穴。神庭位于前正中線,額頂骨縫交界線前方;上巨虛穴位于小鼠脛骨外側(cè),偏下方6 mm,直刺3～4 mm;天樞穴位于小鼠前正中線旁開5 mm,恥骨聯(lián)合以上20 mm,直刺2～3 mm。正極接天樞穴,負(fù)極分別接神庭穴10 min,上巨虛穴10 min,刺激參數(shù)為疏密波,頻率為2～15 Hz,強(qiáng)度為 1 mA,以小鼠肢體輕微震顫為度。每日干預(yù)20 min,1個(gè)療程為5 d,后休息2 d,共治療6個(gè)療程。

1.4.4 左旋多巴組

應(yīng)用西藥左旋多巴,以每日3 mg/kg的劑量,對(duì)PD模型小鼠于造模2周后進(jìn)行灌胃。每日1次,治療5 d為1個(gè)療程,休息2 d,共治療6個(gè)療程。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 行為學(xué)檢測(cè)

電針干預(yù)6個(gè)療程結(jié)束后第1天進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè),包括步長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和游泳實(shí)驗(yàn)。步長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)具體為,設(shè)置泡沫板通道,在通道的底部固定等尺寸的膠水白紙,在實(shí)驗(yàn)前對(duì)全部的小鼠進(jìn)行適當(dāng)?shù)挠?xùn)練,確定出步長(zhǎng),將小鼠后趾使用墨汁染黑后等待其穿過通道,最后測(cè)算同側(cè)腳印間距的平均值[12]。游泳實(shí)驗(yàn)具體為,小鼠禁食 12 h后稱重,在小鼠尾部懸吊約為其體質(zhì)量10%的保險(xiǎn)絲,后將小鼠放入水箱,自投入水內(nèi)開始,用秒表計(jì)算鼻孔下沉水面所需時(shí)間,水溫27 ℃左右,測(cè)定其游泳時(shí)間。行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后進(jìn)行心臟灌注取材[13]。

1.5.2 免疫組化法檢測(cè)黑質(zhì)區(qū)TH表達(dá)

用4%的水合氯醛溶液(每10 g體質(zhì)量注射0.1 mL)腹腔注射麻醉,麻醉小鼠后,用生理鹽水和 4%多聚甲醛溶液經(jīng)左心室快速灌注固定腦組織,根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜,切除前囟后,于 3～4 mm的冠狀切面,采用腦模具截取黑質(zhì)部分。制作切片后BSA封閉,一抗孵育 4 ℃過夜后 PBS沖洗,滴加二抗孵育,PBS沖洗后DAB溶液顯色并觀察。200倍視野下,每張切片選取3～4個(gè)視野,Image Pro-Plus分析并計(jì)算TH陽性細(xì)胞數(shù),陽性細(xì)胞為細(xì)胞漿染成棕褐色。

1.5.3 Western blot法檢測(cè)黑質(zhì)區(qū) TH、SOD-2和Gpx-1蛋白表達(dá)

小鼠腦黑質(zhì)組織中加入 RIPA裂解液進(jìn)行冰上研磨、裂解、離心(15 min)后,然后用考馬斯藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度,繼而進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉液孵育1 h。于4 ℃冰箱分別置于TH、SOD-2、Gpx-1和GAPDH(均為1:5 000)一抗中孵育過夜、洗膜后,使用相應(yīng)二抗(1:2 000)避光室溫孵育1 h后洗膜后,發(fā)光顯影。結(jié)果用Bandscan5.0軟件進(jìn)行掃描,分析TH、SOD-2、Gpx-1及內(nèi)參GAPDH的灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所以數(shù)據(jù)采用 SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組造模后行為學(xué)測(cè)試結(jié)果比較

與空白組比較,PD組小鼠步長(zhǎng)距離減少,游泳時(shí)間縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與PD組比較,針刺組小鼠的步長(zhǎng)距離顯著加長(zhǎng),游泳時(shí)間有顯著延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與PD組比較,左旋多巴組小鼠的步長(zhǎng)和游泳時(shí)間也有顯著提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 4組造模后行為學(xué)測(cè)試結(jié)果比較 (±s)

表1 4組造模后行為學(xué)測(cè)試結(jié)果比較 (±s)

注:與空白組比較1)P＜0.05;與PD組比較2)P＜0.05

組別 n 步長(zhǎng)距離(cm) 游泳時(shí)間(min)空白組 10 8.89±1.12 4.85±0.99 PD組 10 4.23±1.381) 1.81±1.081)針刺組 10 6.51±1.012) 3.14±1.212)左旋多巴組 10 7.32±1.222) 3.26±1.512)

2.2 4組小鼠中腦黑質(zhì)中SOD-2、Gpx-1表達(dá)比較

與空白組比較,PD組小鼠黑質(zhì)中SOD-2和Gpx-1的蛋白表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與PD組比較,針刺組黑質(zhì)中SOD-2和Gpx-1表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與PD組比較,左旋多巴組的SOD-2和Gpx-1表達(dá)也顯著提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見圖1、圖2。

圖1 4組小鼠黑質(zhì)SOD-2蛋白的表達(dá)及條帶圖

圖2 4組小鼠黑質(zhì)Gpx-1蛋白的表達(dá)及條帶圖

2.3 4組小鼠中腦黑質(zhì)中TH表達(dá)比較

與空白組比較,PD組小鼠黑質(zhì)中TH蛋白表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與 PD組比較,針刺組黑質(zhì)中 TH表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與PD組比較,左旋多巴組TH表達(dá)無顯著性變化(P＞0.05),詳見圖3、圖4。

圖3 4組小鼠黑質(zhì)中TH蛋白免疫組化結(jié)果(×200倍)

圖4 4組小鼠黑質(zhì)中TH蛋白表達(dá)及條帶圖

3 討論

隨著我國(guó)進(jìn)入人口老齡化階段,老年病之一的帕金森病(PD)患者人群數(shù)量逐漸龐大,目前臨床主要采用多巴胺類藥物進(jìn)行治療,但長(zhǎng)期使用所致的副作用使患者備受困擾,所以探求發(fā)病原因以及尋找新的治療方式逐漸成為重要的研究方向。PD的主要病理改變?yōu)槎喟桶?dopamine, DA)能神經(jīng)元變性、丟失及路易小體(lewy body, LB)的形成,氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎癥及機(jī)體免疫反應(yīng)參與其中。鈣超載、多巴胺代謝失衡、谷胱甘肽等還原劑水平降低等諸多因素均會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)的氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡[14]。氧化反應(yīng)過程中線粒體中的超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(glutathione, rglutamyl cysteingl glycine, GSH)可催化活性氧生成二價(jià)氧和水,避免細(xì)胞損傷[15]。在許多PD病例中,氧化應(yīng)激被認(rèn)為是導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和死亡的潛在機(jī)制[16]。PD患者尸檢結(jié)果表明,其黑質(zhì)內(nèi)8-羥基鳥苷、蛋白質(zhì)羰基等氧化標(biāo)志物顯著高于其他腦區(qū),表明黑質(zhì)細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激損傷[17]。在帕金森病中,線粒體功能障礙可能提高發(fā)病率,黑質(zhì) DA神經(jīng)元更容易發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),繼而導(dǎo)致線粒體 DNA突變幾率增高,最終會(huì)形成不斷的惡性循環(huán),導(dǎo)致帕金森病病情加重[18]。本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,針刺組與PD組相比,針刺組黑質(zhì)中SOD-2和Gpx-1表達(dá)升高,針刺組小鼠的抗氧化能力顯著升高,這為其治療帕金森病提供理論依據(jù)。

氧化應(yīng)激也促進(jìn)致病蛋白質(zhì)的聚集,干擾細(xì)胞自噬,導(dǎo)致年齡和疾病相關(guān)蛋白酶體功能障礙[19]。在線粒體基因組突變、氧化應(yīng)激,毒素刺激等因素下,線粒體產(chǎn)生功能失調(diào),這是PD發(fā)病關(guān)鍵環(huán)節(jié)。經(jīng)典PD模型制備,正是抑制了線粒體復(fù)合體Ⅰ功能導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[20]。線粒體復(fù)合體Ⅰ被抑制后,不僅影響ATP生成,也導(dǎo)致活性氧(reactive oxygenspecies, ROS)生成增加,損傷mtRNA, ATP合成不足也會(huì)導(dǎo)致門冬氨酸及谷氨酸等興奮性遞質(zhì)增加,對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性[21]。Aβ寡聚體也可干擾線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子交換,抑制受損線粒體自噬[22-23]。隨著機(jī)體的衰老,氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡增加,產(chǎn)生大量ROS,線粒體DNA損傷加劇,因此年齡是影響PD發(fā)病最大風(fēng)險(xiǎn)因素[24]。

黑質(zhì)中的酪氨酸羥化酶(TH)表達(dá)近年來被認(rèn)為與PD發(fā)病具有相關(guān)性,有報(bào)道針灸療法可以提高腦黑質(zhì)TH的表達(dá)[25],本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠TH含量減少,針刺干預(yù)可以提高TH的表達(dá),推測(cè)可能是通過增加 TH的表達(dá)而提高了多巴胺的合成能力,進(jìn)而達(dá)到改善模型小鼠運(yùn)動(dòng)能力的目的。

1-甲基-4-苯基-吡啶離子(1-methyl-4-phenyl pyridinium, MPP+)是MPTP的活性代謝產(chǎn)物,有研究證明,它同 MPTP一樣,對(duì)多巴胺能神經(jīng)元具有損傷作用[26],其不僅會(huì)促使 DA異常釋放,還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞一系列的氧化應(yīng)激反應(yīng)[27]。近來MPTP與膠質(zhì)細(xì)胞活化以及DA神經(jīng)元損傷之間的關(guān)系也引起了廣泛的關(guān)注[28],其次通過神經(jīng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià),證明MPTP誘導(dǎo)完全可以模擬PD患者的運(yùn)動(dòng)障礙[29]。本實(shí)驗(yàn)采用緩釋模型,總時(shí)長(zhǎng)4周,與腹腔注射急性模型比較,慢性模型更好地模擬了PD的病理學(xué)特征[30]。本實(shí)驗(yàn)選用游泳實(shí)驗(yàn)及步長(zhǎng)實(shí)驗(yàn),分別從步態(tài)及運(yùn)動(dòng)耐性兩個(gè)角度評(píng)價(jià)其運(yùn)動(dòng)功能。針刺組小鼠的步長(zhǎng)距離、游泳時(shí)間與PD組比較顯著加長(zhǎng),針刺干預(yù)改善小鼠PD典型運(yùn)動(dòng)癥狀。

PD屬于中醫(yī)學(xué)“顫證”“震顫”“痙證”的范疇,早在《素問·至真要大論》中就諸如“諸風(fēng)掉眩,皆屬于肝”“諸痙項(xiàng)強(qiáng),皆屬于濕”等記載[31]?；凇澳X病治腸”理論,在前期研究中發(fā)現(xiàn)針刺由、神庭和雙側(cè)天樞、上巨虛五穴對(duì)PD及其以早期便秘為主的非運(yùn)動(dòng)癥狀均有較好的改善作用[32]。其中神庭為督脈穴,為與足陽明胃經(jīng)之交會(huì)穴,“病變?cè)谀X,首取督脈”,其功效是開竅通絡(luò)止顫;足陽明胃經(jīng)穴位上巨虛是大腸的下合穴,“邪在腑,取之合”[33],“合治內(nèi)腑”,具有調(diào)節(jié)胃腸功能的作用。天樞穴為大腸募穴,是人體上下氣機(jī)交匯之處,升清降濁之樞紐,能夠通大腸和通肺氣,配合上巨虛共同發(fā)揮調(diào)節(jié)胃腸功能作用。以上諸穴合用,“上下同調(diào)”可開竅、止顫,通調(diào)氣機(jī)、合胃通腑[34-35]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,早期電針干預(yù)可抑制 PD小鼠氧化因子表達(dá),增強(qiáng)機(jī)體抗氧化作用,緩解 PD運(yùn)動(dòng)功能障礙,為治療PD提供了新的治療靶向。