角質(zhì)酶在滌綸織物表面改性中的應(yīng)用

王艷萍， 陳曉倩， 夏 偉， 傅佳佳， 高衛(wèi)東， 王鴻博， ARTUR Cavaco-Paulo

(1. 江南大學(xué) 江蘇省功能紡織品工程技術(shù)研究中心， 江蘇 無錫 214122； 2. 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室， 江蘇 無錫 214122； 3. 米尼奧大學(xué) 生物工程中心， 葡萄牙 布拉加 4710-057)

滌綸是當(dāng)前應(yīng)用最廣、產(chǎn)量最高的合成纖維之一，其在化纖總產(chǎn)量中的占比穩(wěn)定在80%以上[1-2]。滌綸強度較高，具有耐磨、耐拉伸、機可洗、抗皺等諸多優(yōu)良特性,但滌綸大分子中無活性基團(tuán)，回潮率偏低，在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下為0.4%，這使得滌綸織物的親水性、染色性、透氣性及抗靜電性均較差[3-4]，影響其服用舒適性。

當(dāng)前，一般可通過化學(xué)處理(如氧化劑氧化法、表面水解法等)、物理涂層、表面接枝改性(如化學(xué)引發(fā)接枝改性和輻射接枝改性)等技術(shù)實現(xiàn)對滌綸織物親水性能的改善[5-7],但這些方法需用到刺激性化學(xué)試劑或需高能量的輸入，處理過程對環(huán)境不友好且繁瑣。輻照處理(如低溫等離子體處理)的滌綸織物具有時效性，短期內(nèi)易恢復(fù)疏水性[4,8-9]；堿減量處理需消耗大量堿和水，產(chǎn)生廢水，污染環(huán)境，且處理后纖維性能受到損傷，導(dǎo)致織物力學(xué)性能下降，影響其服用性能[4,6,10]。相比之下，采用生物酶法進(jìn)行滌綸織物的表面改性，處理條件溫和，節(jié)能、節(jié)水，處理過程綠色生態(tài)環(huán)保，且酶作用僅限制在滌綸表層，不損壞纖維本身的性能[11]。

滌綸織物生物酶法親水改性所用的酶制劑大都是脂肪酶和角質(zhì)酶，都屬于酯酶，這2種酶對滌綸酯鍵起到催化水解作用，在纖維表層生成親水基團(tuán)，達(dá)到親水化改性效果，且同時可維持纖維自身較好的物理力學(xué)性能[12-14]。相較于脂肪酶，角質(zhì)酶的活性中心無蓋子結(jié)構(gòu)，這使其活性中心更容易結(jié)合底物，因此，本文選用熱穩(wěn)定性好且活力較高的H.insolens角質(zhì)酶對滌綸織物進(jìn)行表面改性，探究酶用量、反應(yīng)時間、反應(yīng)pH值、溫度以及非離子型表面活性劑Trition X-100等對改性效果的影響。通過定量測試反應(yīng)體系中對苯二甲酸(即TPA)及其衍生物的釋放量，結(jié)合高效液相色譜(HPLC)、掃描電鏡(SEM)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)等分析技術(shù)以及水接觸角、亞甲基藍(lán)染色性能測試，評價滌綸織物酶法改性的效果。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

100%滌綸平紋織物，經(jīng)、緯紗線密度均為2.22 tex，經(jīng)、緯密分別為880、680根/(10 cm)，面密度為56 g/m2，由吳江市中鵬紡織有限公司提供。

H.insolens角質(zhì)酶(特異腐質(zhì)霉來源角質(zhì)酶)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室(江南大學(xué))；對硝基苯丁酸酯(pNPB)，Sigma-Aldrich公司;對苯二甲酸(TPA，分析純)、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、碳酸鈉、無水乙醇、十二烷基硫酸鈉(SDS),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

TG16.5型高速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司),P5型紫外-可見分光光度計(上海美普達(dá)儀器有限公司),TU-1900型雙光束紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器公司),GZX-9146 MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱、BSD-YF2200型立式雙層精密搖床(上海博訊實業(yè)有限公司),Nicolet is 10型傅里葉變換紅外光譜儀(美國Thermo Fisher公司),Datacolor 650型測色配色儀(美國Datacolor公司),SU1510型掃描電子顯微鏡(日本日立公司),BHS-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江陰保利科研機械有限公司),1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司),DSA 25接觸角測量儀(德國KRUSS公司)。

1.3 織物前處理

將滌綸織物按照浴比為1∶30，浸沒在含有5 g/L皂片、4 g/L碳酸鈉的溶液中，在98 ℃條件下處理30 min，達(dá)到精練效果。然后用去離子水清洗，平鋪在培養(yǎng)皿中，置于烘箱中，在105 ℃下烘干。最后將處理后織物放入恒溫恒濕箱，在溫度為(21±1) ℃和相對濕度為(65±2)%的條件下平衡至少24 h，以備后續(xù)實驗使用。

1.4 織物酶處理

將質(zhì)量為0.4 g的滌綸織物，按1∶40浴比放入Tris-HCl緩沖液(pH值 8.0，濃度5 mmol/L)中，取一定劑量的角質(zhì)酶加入上述處理液中。將整個反應(yīng)體系用封口膜密封，放在60 ℃，150 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中反應(yīng)。將酶處理后的滌綸織物在超聲波作用下，分別采用1%SDS和20%無水乙醇各清洗30 min，然后放入烘箱中，在105 ℃下烘干。將烘干后的滌綸織物置于恒溫恒濕箱中，在溫度為(21±1) ℃和相對濕度為(65±2)%條件下平衡至少24 h，以備后續(xù)測試使用。其中，處理織物的對照樣是在相同條件下用緩沖液代替酶液處理的滌綸織物，反應(yīng)殘液的對照樣是在相同條件下僅加酶而未加滌綸織物的反應(yīng)液。

1.5 測試方法

1.5.1 角質(zhì)酶活性測定

采用連續(xù)紫外-可見分光光度計測定角質(zhì)酶的活力[15]。酶活性測定反應(yīng)體系中含有酶液(適度稀釋)和對硝基苯丁酸酯(pNPB，50 mmol/L)各30 μL，Tris-HCl緩沖液(pH值 8.0，濃度5 mmol/L)1 440 μL，即總反應(yīng)體積為1.5 mL。在波長為405 nm處測定對硝基酚(pNP)的生成速率，并定義溫度設(shè)為37 ℃時，每分鐘催化pNPB水解生成1 μmol對硝基苯酚pNP的酶量即為1個酶活力單位U。

1.5.2 滌綸織物水解產(chǎn)物釋放量測定

滌綸經(jīng)酶催化水解生成的產(chǎn)物對苯二甲酸(TPA)及其衍生物在波長240 nm處會出現(xiàn)吸收峰，因此，可通過紫外-分光光度計測定體系中TPA及其衍生物的生成量來評價酶對滌綸改性的效果。通?？赡艿拿附猱a(chǎn)物有TPA、單(對苯二甲酸-2-羥基乙酯)(MHET)、二(對苯二甲酸-2-羥基乙酯)(BHET)。由于這3種產(chǎn)物的羰基基團(tuán)產(chǎn)生的摩爾吸光系數(shù)相同，因此可利用TPA的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算產(chǎn)物的釋放總量，參照文獻(xiàn)[16]繪制TPA的標(biāo)準(zhǔn)線如圖1所示。

圖1 TPA質(zhì)量濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of TPA concentration and absorbance

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程為

A=1.289 97×10-4+4.127 91C

式中：A為測試樣品在240 nm處紫外光譜吸光度；C為TPA的質(zhì)量濃度，mg/mL。相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 76。

在測定體系中產(chǎn)物生成量時，需將反應(yīng)殘液在沸水中放置30 min，使角質(zhì)酶失去活力。然后離心(8 000 r/min,10 min)，取上清液作為產(chǎn)物釋放量的測試樣。參照樣為相同條件下僅加角質(zhì)酶未加滌綸織物的處理體系反應(yīng)殘液，經(jīng)過酶失活、離心所取的上清液。測定反應(yīng)殘液在240 nm波長下的吸光度，每組樣品測試3次。

1.5.3 滌綸織物水解產(chǎn)物種類鑒別測試

采用的反向色譜柱是Athena C18-WP(100 A，4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動相為體積比為35∶65的1%冰乙酸/甲醇溶液，進(jìn)樣量為5 μL，流速為0.5 mL/min，色譜柱保持在30 ℃，在240 nm波長下進(jìn)行分析。

1.5.4 表面形貌觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察角質(zhì)酶處理前后滌綸織物形貌變化。設(shè)置加速電壓為5.0 kV。

1.5.5 滌綸織物化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

采用傅里葉變換紅外光譜儀對角質(zhì)酶處理前后滌綸織物表面進(jìn)行全反射紅外光譜測試，掃描次數(shù)為32次，掃描范圍為4 000～500 cm-1。

1.5.6 滌綸織物亞甲基藍(lán)染色性能測試

亞甲基藍(lán)是堿性染料，具有吸附在—COO-基團(tuán)上的特性，可用于測定滌綸表面—COOH基團(tuán)數(shù)量的變化。分別對角質(zhì)酶處理后的滌綸織物及未處理滌綸織物進(jìn)行染色，染色工藝為：亞甲基藍(lán)染料用量0.5%(o.w.f)，浴比1∶100，置于恒溫?fù)u床振蕩箱中，在60 ℃和150 r/min條件下染色2 h。隨后用去離子水沖洗樣品，并在室溫下進(jìn)行干燥。

使用測色配色儀中軟件(Datacolor TOOLS Plus)評價酶處理前后滌綸織物的染色性能。三刺激值X、Y和Z是可見區(qū)域內(nèi)通過標(biāo)準(zhǔn)觀測儀(10°)在光源D65下進(jìn)行測定的，波長范圍設(shè)定為360～700 nm，基于最大吸收波長(λmax)處的反射率計算測試樣品的K/S值。

1.5.7 織物水接觸角測試

在距布面10 mm處滴下10 μL去離子水液滴，通過接觸角測量儀分析軟件記錄樣品接觸角。同一樣品選取5個不同位置進(jìn)行測量，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 角質(zhì)酶催化水解反應(yīng)的影響因素

2.1.1 角質(zhì)酶用量對水解效果的影響

在溫度為60 ℃，時間為48 h，pH值為8.0的反應(yīng)條件下，考察角質(zhì)酶用量與TPA及其衍生物釋放量的關(guān)系，結(jié)果如圖2所示。H.insolens角質(zhì)酶催化水解滌綸織物的產(chǎn)物(即TPA及其衍生物)釋放量隨著酶用量的增加而增加。當(dāng)體系中酶用量高于100 U/mL時，由于滌綸表面沒有足夠多的作用位點與角質(zhì)酶的活性位點結(jié)合，加之角質(zhì)酶是大分子，無法進(jìn)入表面較致密的滌綸內(nèi)部反應(yīng)，因此角質(zhì)酶的催化效率開始下降，TPA及其衍生物釋放量不再增加。

圖2 角質(zhì)酶用量對TPA及其衍生物釋放量的影響Fig.2 Influence of cutinase dosage on release of TPA and its derivatives

2.1.2 反應(yīng)時間對水解效果的影響

在溫度為60 ℃，酶用量為100 U/mL，pH值為8.0的條件下，考察反應(yīng)時間與TPA及其衍生物釋放量的關(guān)系，結(jié)果如圖3所示。反應(yīng)初期，H.insolens角質(zhì)酶催化水解滌綸織物的產(chǎn)物(即TPA及其衍生物)釋放量隨反應(yīng)時間的延長而快速增長。相關(guān)研究中曾報道采用畢赤酵母來源脂肪酶催化水解滌綸織物7 h時，生成的產(chǎn)物量達(dá)到穩(wěn)定飽和值，為12.5 mg/L[10]，而圖3所示采用H.insolens角質(zhì)酶處理滌綸織物6 h時，生成的產(chǎn)物量可達(dá)17.2 mg/L。反應(yīng)前72 h，產(chǎn)物釋放量隨時間的延長而顯著增長；反應(yīng)72 h后，產(chǎn)物生成量高達(dá)119.6 mg/L，繼續(xù)延長反應(yīng)時間，產(chǎn)物釋放量的增長趨于平緩?？梢?，該酶對滌綸作用效果顯著。

圖3 反應(yīng)時間對TPA及其衍生物釋放量的影響Fig.3 Influence of reaction time on release of TPA and its derivatives

角質(zhì)酶對滌綸內(nèi)部酯鍵的可及度較低，隨著反應(yīng)時間的延長，滌綸表面可被水解的酯鍵的數(shù)量變少，因此酶水解生成的產(chǎn)物量增加趨勢變緩。此外，角質(zhì)酶的活力也隨著時間的延長逐漸下降，加之可能的產(chǎn)物抑制作用，使得角質(zhì)酶的催化效率也會降低。

2.1.3 反應(yīng)pH值對水解效果的影響

在溫度為60 ℃，酶用量為100 U/mL，反應(yīng)時間為48 h的反應(yīng)條件下，考察反應(yīng)pH值與TPA及其衍生物釋放量的關(guān)系，結(jié)果如圖4所示。H.insolens角質(zhì)酶催化水解滌綸織物的產(chǎn)物(即TPA及其衍生物)釋放量隨反應(yīng)pH值的增加呈先增加后減少的變化趨勢。當(dāng)pH值為8.5時，反應(yīng)體系中產(chǎn)物的釋放量最大。酶的活力即其催化反應(yīng)的能力會受到pH值的影響，這是因為pH值變化直接影響酶活性中心基團(tuán)的解離程度，進(jìn)而活性中心與底物的結(jié)合和催化作用受到影響；因此，只有當(dāng)體系的pH值設(shè)定為酶促反應(yīng)最適pH值時，酶分子構(gòu)象穩(wěn)定，其活性中心處在與底物結(jié)合和催化最適宜的狀態(tài)，催化反應(yīng)能力最強。偏離酶催化反應(yīng)最適pH值后，角質(zhì)酶催化酯鍵水解會受到限制。

圖4 反應(yīng)pH值對TPA及其衍生物釋放量的影響Fig.4 Influence of pH on release of TPA and its derivatives

2.1.4 反應(yīng)溫度對水解效果的影響

在酶用量為100 U/mL，反應(yīng)時間為48 h，pH值為8.0的條件下，考察反應(yīng)溫度與TPA及其衍生物釋放量的關(guān)系，結(jié)果如圖5所示。

圖5 反應(yīng)溫度對TPA及其衍生物釋放量的影響Fig.5 Influence of reaction temperature on release of TPA and its derivatives

H.insolens角質(zhì)酶催化水解滌綸織物的產(chǎn)物釋放量(即TPA及其衍生物的量)隨反應(yīng)溫度增加呈先增加后減少的變化趨勢。當(dāng)反應(yīng)溫度為60 ℃時，反應(yīng)體系中產(chǎn)物的釋放量最大。溫度對酶的活力即其催化反應(yīng)的能力具有雙向影響。一方面，溫度升高，有利于化學(xué)反應(yīng)加速進(jìn)行，酶催化反應(yīng)速度也隨之加快，從這個角度看，溫度升高可增大酶的催化活力，當(dāng)溫度達(dá)到酶的最適溫度時，其具有最高催化活力；另一方面，溫度升高會影響酶蛋白性狀，反應(yīng)溫度過高，酶蛋白質(zhì)容易變性，會造成酶活力降低甚至喪失，酶的作用效果受到限制。

2.1.5 表面活性劑對水解效果的影響

在H.insolens角質(zhì)酶用量為100 U/mL，溫度為60 ℃，反應(yīng)時間為72 h，pH值為8.5的條件下，考察表面活性劑Trition X-100對產(chǎn)物(即TPA及其衍生物)釋放量的影響，測得Trition X-100、角質(zhì)酶、角質(zhì)酶+Trition X-100條件下TPA及其衍生物的釋放量分別為10.39、120.85、285.7 mg/L?？梢姡隗w系中加入0.1%的表面活性劑Trition X-100，產(chǎn)物釋放量較未加入時提高了136%。這是因為表面活性劑Trition X-100分子中含有疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)，在反應(yīng)過程中，表面活性劑分子中的疏水基團(tuán)與滌綸的疏水表面相結(jié)合，而表面活性劑分子中的親水基團(tuán)向外延伸，可有效吸引酶蛋白分子，因此，表面活性劑Trition X-100的加入為疏水的滌綸和親水的酶分子提供“橋梁”，有利于酶分子靠近并吸附在滌綸表面，提升角質(zhì)酶對滌綸織物的催化效率，使得產(chǎn)物的釋放量顯著增加。

2.2 滌綸織物水解產(chǎn)物種類分析

在H.insolens角質(zhì)酶用量為100 U/mL，時間為72 h，pH值為8.5，溫度為60 ℃，同時加入0.1%表面活性劑Trition X-100的反應(yīng)條件下，對反應(yīng)殘液進(jìn)行高效液相色譜分析，以鑒定水解產(chǎn)物的種類，結(jié)果如圖6所示。

圖6 酶處理滌綸織物反應(yīng)殘液高效液相色譜圖Fig.6 High performance liquid chromatography diagram of residual reaction liquid from enzymatic treatment of polyester fabric

TPA和MHET對應(yīng)出峰時間分別是27.21和30.08 min。用H.insolens角質(zhì)酶處理滌綸織物時，產(chǎn)物中檢測到相當(dāng)量的TPA和MHET，而未檢測到BHET，這與先前文獻(xiàn)[12]報道的結(jié)果一致。

2.3 織物表面形貌分析

圖7示出H.insolens角質(zhì)酶處理前后滌綸織物的掃描電鏡照片?？煽闯?，酶處理前滌綸織物表面光滑，酶處理后織物表面變得粗糙，出現(xiàn)不同程度的刻蝕，這是由于酶催化滌綸表面結(jié)構(gòu)較疏松的無定形區(qū)內(nèi)酯鍵水解造成的。酶催化滌綸水解的作用僅限于纖維表層，不會過度損壞滌綸的力學(xué)性能。

圖7 角質(zhì)酶處理前后滌綸的掃描電鏡照片(×10 000)Fig.7 SEM images of polyester before (a) and after (b) cutinase treatment

2.4 滌綸織物表層化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

圖8 角質(zhì)酶處理前后滌綸織物的紅外光譜圖Fig.8 Infrared spectrum of polyester fabric before and after cutinase treatment

2.5 滌綸織物亞甲基藍(lán)染色性能分析

角質(zhì)酶對滌綸織物的水解反應(yīng)體現(xiàn)在酶催化滌綸織物表面酯鍵斷裂生成羥基(—OH)和羧基(—COOH)。亞甲基藍(lán)色染料可用于測定吸附在滌綸上的—COOH基團(tuán)數(shù)量。圖9示出角質(zhì)酶處理前后滌綸織物的K/S值變化情況?？煽闯?，在550～650 nm范圍內(nèi)角質(zhì)酶處理后織物的K/S值增加顯著，證實了角質(zhì)酶可催化滌綸織物發(fā)生水解反應(yīng)。酶處理后滌綸織物的K/S值增加，說明滌綸織物水解后羧端基增多，導(dǎo)致滌綸織物表面亞甲基藍(lán)染料的吸附顯著增加。

圖9 角質(zhì)酶處理前后滌綸織物的K/S值曲線Fig.9 K/S curve of polyester fabric before and after cutinase treatment

2.6 織物水接觸角分析

圖10示出角質(zhì)酶處理前后滌綸織物的水接觸角變化?？煽闯?，滌綸織物經(jīng)酶處理后，水接觸角由93.4°降至83.1°，達(dá)到織物表面由疏水向親水轉(zhuǎn)化的改性。這是由于角質(zhì)酶催化滌綸表面酯鍵水解，酯鍵的斷裂會生成親水的基團(tuán)(羥基和羧基)，使得纖維表面極性增加，進(jìn)而改善了滌綸織物的親水性能。

圖10 角質(zhì)酶處理前后滌綸織物接觸角變化Fig.10 Change of contact angle of polyester fabric before (a)and after (b) cutinase treatment

3 結(jié) 論

1)采用H.insolens角質(zhì)酶對滌綸織物進(jìn)行改性，優(yōu)化工藝參數(shù)為：角質(zhì)酶用量100 U/mL，反應(yīng)時間72 h，pH值8.5，溫度60 ℃。在此條件下，角質(zhì)酶催化滌綸織物水解得到的反應(yīng)產(chǎn)物高達(dá)120.85 mg/L，主要為對苯二甲酸(TPA)和單(對苯二甲酸-2-羥基乙酯)(MHET)。進(jìn)一步在反應(yīng)體系中加入表面活性劑Trition X-100，可使產(chǎn)物的釋放量提高136%。

2)H.insolens角質(zhì)酶處理后滌綸織物表面變得粗糙，經(jīng)亞甲基藍(lán)染色后，在550～650 nm波長下的K/S值增加顯著。

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