杭州蘆筍莖枯病病原鑒定與防治

石延霞 李寶聚* 王 朵 張旭娟 施建軍 路雅靜 謝學(xué)文 柴阿麗 李 磊

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2 杭州佳惠農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司，浙江杭州 311200）

蘆筍（L.）也稱石刁柏、龍須菜，素有“蔬菜之王”的美譽(yù)，是世界十大名菜之一，我國(guó)是世界上蘆筍第一大生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)。隨著蘆筍種植面積的擴(kuò)大，土傳病害發(fā)生率亦逐漸上升，常見(jiàn)的病害有莖枯病〔（Sacc.）Bubak〕、枯 萎 ?。ǎ?、根腐?。╯pp.）等，可種傳、種苗傳或者土傳（張?jiān)榔?等，2012），尤其蘆筍莖枯?。╝sparagus stem blight）是一種全球性的毀滅性病害，在中國(guó)、日本、泰國(guó)等國(guó)家均有發(fā)生（Sonoda et al.，1997；Shanmugam et al.，2001；Zhang et al.，2017）。我國(guó)由于氣候原因蘆筍莖枯病普遍發(fā)生，3 年以上的蘆筍發(fā)病率幾乎達(dá)100%，且南方比北方發(fā)生率高（Yang et al.，2016）。近年來(lái)，尤其浙江、江蘇等地蘆筍種植區(qū)莖枯病發(fā)生嚴(yán)重，一旦染病，植株迅速死亡，降低了蘆筍的品質(zhì)和產(chǎn)量，給當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大的損失，嚴(yán)重影響了出口創(chuàng)匯。

蘆筍莖枯病最適發(fā)病溫度為23～26 ℃，病原菌分生孢子器遇水后釋放分生孢子，隨著風(fēng)雨等擴(kuò)散傳播，因此多雨、高濕環(huán)境更利于該病害的發(fā)生和流行（苗華民 等，1991；賈廷祥 等，1992）。2018 年以來(lái)，浙江省杭州市佳慧蘆筍種植基地莖枯病發(fā)生日趨嚴(yán)重，與當(dāng)?shù)貧夂驐l件和未及時(shí)采取防控措施，錯(cuò)過(guò)了最佳防治時(shí)期有關(guān)。目前防治該病害的主要手段仍然是化學(xué)藥劑防治，本試驗(yàn)對(duì)杭州蘆筍莖枯病病原菌進(jìn)行鑒定，探究不同藥劑對(duì)其防治效果，以利于合理用藥，有效防控蘆筍莖枯病。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

2018 年10 月至2020 年10 月，在浙江杭州佳慧蘆筍種植基地采集具有明顯發(fā)病癥狀的蘆筍莖稈，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行致病菌分離，共分離得到病原菌15 株，編號(hào)依次為L(zhǎng)S18102101、LS18102103、LS18102104、LS18102106、LS18102108、LS18102109、LS18102110、LS18102113、LS18102115、LS18102116、LS18102123、LS18102124、LS18102125、LS18102126、LS18102136。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘆筍莖枯病病原菌的分離、純化 選取病癥發(fā)生明顯的蘆筍莖部，在病健交界處切取大小約5 mm × 5 mm 的莖部組織，用75%酒精消毒30 s，置于無(wú)菌水中清洗3 次；晾干后置于PDA 培養(yǎng)基上，于27 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3 d 后在無(wú)菌環(huán)境下挑取新長(zhǎng)出的菌落邊緣菌絲，移至新的PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行多次純化培養(yǎng)，直至菌落無(wú)雜菌。

1.2.2 蘆筍莖枯病病原菌的形態(tài)學(xué)觀察 將純化后的病原菌轉(zhuǎn)接至新的PDA 培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)7 d 后，觀察菌落形態(tài)及顏色等特征。待10 d 后病原菌產(chǎn)生分生孢子器，用接種環(huán)輕輕刮拭培養(yǎng)基分生孢子器表面制片，在顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)、顏色等特征。

1.2.3 蘆筍莖枯病病原菌的分子生物學(xué)鑒定 利用真菌DNA 提取試劑盒（北京酷來(lái)搏科技有限公司），在分離出的15 株病原菌中，隨機(jī)選取8 株提取病原菌DNA，分別采用真菌通用引物ITS1/ITS4（White et al.，1990）和特異性引物SF/SR（杜宜新 等，2018）對(duì)病原菌DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）為：2 ×Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）26 μL，DNA 模板2 μL，上、下游引物各2 μL，ddHO 補(bǔ)足至50 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將獲得的ITS 基因序列在NCBI 中比對(duì)，從GenBank 下載相關(guān)序列，用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行親緣關(guān)系分析，在8 株病原菌中隨機(jī)選擇3 株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 蘆筍莖枯病病原菌致病性測(cè)定 按照柯赫氏法則，選取盆栽半年生蘆筍幼苗，對(duì)分離出的15株病原菌進(jìn)行接種驗(yàn)證及致病性測(cè)定，每處理15株。將純化培養(yǎng)后的分生孢子濃度調(diào)整為1 × 10個(gè) ·mL（楊迎青 等，2012），在蘆筍苗期，刺傷莖部進(jìn)行噴霧接種，每處理噴施30 mL，以噴施清水為空白對(duì)照。待接種部位發(fā)病后，對(duì)發(fā)病部位的病斑再次進(jìn)行病原菌分離、純化，觀察菌落、分生孢子器和分生孢子特征，如果與最初分離出的病原菌一致，則可確定為該病原菌。

接種14 d 后，對(duì)接種幼苗進(jìn)行病情調(diào)查，計(jì)算其病情指數(shù)。

按照楊迎青等（2012）的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病情分級(jí)：0 級(jí)，全株無(wú)病斑；1 級(jí)，發(fā)病面積占總面積6%以下；2 級(jí)，發(fā)病面積占總面積的6%～10%；3 級(jí)，發(fā)病面積占總面積的11%～20%；4 級(jí)：發(fā)病面積占總面積的21%～30%；5 級(jí)：發(fā)病面積占總面積的30%以上。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù) × 該級(jí)代表值）/（調(diào)查總株數(shù) ×最高級(jí)代表值）× 100

1.2.5 不同藥劑對(duì)蘆筍莖枯病病原菌的室內(nèi)生物活性測(cè)定 以菌株LS18102108 為試材，其致病性在15 株病原菌中最強(qiáng)。將該菌株置于PDA 培養(yǎng)基平板上，27 ℃恒溫培養(yǎng)5 d 后，在菌落邊緣打取直徑5 mm 的菌餅。含藥培養(yǎng)基的制備：將供試藥劑（表1）配制成母液，然后按照濃度梯度，用加熱融化后約55 ℃的液體PDA 培養(yǎng)基稀釋，各藥劑在PDA培養(yǎng)基中的終濃度分別為0（對(duì)照）、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg·mL，將直徑5 mm 的菌餅接種于不同濃度含藥培養(yǎng)基平板中心，有菌絲一側(cè)向上，每處理重復(fù)3 次。接菌后25 ℃黑暗培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿含0 μg·mL藥劑的培養(yǎng)基平板時(shí)，采用“十”字交叉法測(cè)量每處理的菌絲直徑，計(jì)算抑制率。

表1 蘆筍莖枯病病原菌室內(nèi)生物活性測(cè)定供試藥劑

抑制率=（對(duì)照菌落直徑 -處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑 -0.5 cm）× 100%

采用Microsoft Excel 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理；采用IBM SPSS Statistics 20.0 軟件，以防治藥劑濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以抑制率的生物幾率值為縱坐標(biāo)，計(jì)算各藥劑的毒力回歸方程和有效中濃度（EC）。

1.2.6 不同藥劑對(duì)蘆筍莖枯病活體盆栽藥效評(píng)價(jià) 以菌株LS18102108 為試材，參試藥劑及試驗(yàn)濃度詳見(jiàn)表2。分別將5 種稀釋后的藥劑均勻噴施于半年生盆栽蘆筍幼苗上，每種藥劑噴施30 mL，2 h 后待藥液完全被蘆筍吸收后接種病原菌，方法同1.2.4，設(shè)置清水對(duì)照。每個(gè)處理3 次重復(fù)，共30 株。待對(duì)照植株發(fā)病后，計(jì)算病情指數(shù)和防效。

表2 蘆筍莖枯病活體盆栽藥效評(píng)價(jià)供試藥劑

防效=（對(duì)照病情指數(shù) -處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù) × 100%

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆筍莖枯病田間發(fā)病癥狀

在浙江杭州佳慧蘆筍種植基地發(fā)現(xiàn)的蘆筍莖枯病主要為害植株莖部，嫩莖和嫩枝最易感?。▓D1-A）。典型癥狀為：初期，莖稈上出現(xiàn)外緣呈水漬狀的橢圓形小斑；之后病斑逐漸擴(kuò)大，中間呈灰褐色大斑（圖1-B）；后期，病斑上出現(xiàn)許多散生或呈輪紋狀排列的黑色小粒點(diǎn)（圖1-C）；病斑持續(xù)擴(kuò)展并環(huán)繞莖部約一周后，植株莖葉迅速變黃枯死，直至整株死亡（圖1-D）。

圖1 蘆筍莖枯病田間癥狀

2.2 蘆筍莖枯病病原菌形態(tài)特征

將獲得的純化菌株在PDA 培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d 后，觀察菌落形態(tài)。該病原菌菌落平坦，初期為白色，氣生菌絲平鋪（圖2-A）；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌落呈灰白色或淡黃綠色（圖2-B、C）；分生孢子器形成于子座中，子座黑色，常數(shù)個(gè)集結(jié)成塊，呈球形，成熟后外露于菌絲層，培養(yǎng)后期子實(shí)體分泌橘黃色液狀物（圖2-D、E）；分生孢子呈長(zhǎng)橢圓形或卵圓形，少數(shù)呈梭形，無(wú)色，單孢，內(nèi)有2 個(gè)油球（圖2-F）。

圖2 蘆筍莖枯病病原菌形態(tài)特征

2.3 蘆筍莖枯病病原菌分子生物學(xué)鑒定

采用通用引物ITS1/ITS4 和特異性引物SF/SR 對(duì)病原菌DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，分別獲得長(zhǎng)度為650 bp 和401 bp 的目標(biāo)片段（圖3），獲得的ITS 基因序列在NCBI 上的比對(duì)結(jié)果與天門冬擬莖點(diǎn)霉（KJ801804.1）的序列同源性為100%。

圖3 蘆筍莖枯病病原菌ITS1/ITS4 和SF/SR 引物擴(kuò)增結(jié)果

將該序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，菌株LS18102101、LS18102108 和LS18102110與世界不同地區(qū)的擬莖點(diǎn)霉（）（LC203583.1、LC203582.1、LC333579.1、KJ801804.1、KC456277.1、AB247166.1 和HQ832822.1）遺傳距離接近，均屬于同一分支（圖4）。綜合形態(tài)學(xué)特征，確定其為天門冬擬莖點(diǎn)霉〔（Sacc.）Bubak〕。

圖4 根據(jù)ITS 基因同源性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 蘆筍莖枯病病原菌致病性測(cè)定

盆栽試驗(yàn)中，接種病原菌的蘆筍莖葉在接種8 d 后開(kāi)始發(fā)病。發(fā)病初期莖稈開(kāi)始出現(xiàn)病斑，嫩莖上逐漸出現(xiàn)小黑點(diǎn)，之后由于上部缺水葉部變黃，與田間癥狀一致（圖5）。將接種后發(fā)病的蘆筍莖部進(jìn)行組織分離，鏡檢分離出的病原菌與接種的病原菌形態(tài)一致，表明分離獲得的病原菌為蘆筍莖枯病致病菌。接種病原菌的植株發(fā)病率均為100%，病情指數(shù)在34～63 之間，編號(hào)LS18102108 的菌株致病性最強(qiáng)，清水對(duì)照未發(fā)病。

圖5 蘆筍接種莖枯病病原菌發(fā)病結(jié)果

2.5 不同藥劑對(duì)蘆筍莖枯病病原菌的室內(nèi)生物活性測(cè)定

從表3 可以看出，在供試藥劑中，25%吡唑醚菌酯懸浮劑對(duì)蘆筍莖枯病病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)，在供試濃度下對(duì)菌絲完全抑制；75%百菌清可濕性粉劑、22.5%啶氧菌酯懸浮劑、70%丙森鋅可濕性粉劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和50%異菌脲可濕性粉劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用均較強(qiáng)，EC值分別為0.13、0.19、2.04、2.24 μg ·mL和2.25 μg·mL。

表3 不同藥劑對(duì)蘆筍莖枯病病原菌的室內(nèi)生物活性測(cè)定

2.6 不同藥劑對(duì)蘆筍莖枯病活體盆栽藥效評(píng)價(jià)

從表4 可以看出，25%吡唑醚菌酯懸浮劑的防效最好，達(dá)94.56%，與室內(nèi)生物活性測(cè)定結(jié)果相符；10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、75%百菌清可濕性粉劑、50%異菌脲可濕性粉劑、22.5%啶氧菌酯懸浮劑均有不同程度的防治效果，防效分別為59.78%、58.15%、47.82%、44.56%。

表4 不同藥劑對(duì)蘆筍莖枯病病原菌的藥效評(píng)價(jià)

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)蘆筍發(fā)病植株分離得到的病原菌進(jìn)行顯微形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定、接種驗(yàn)證和致病性測(cè)定，明確該蘆筍莖枯病病原菌為天門冬擬莖點(diǎn)霉，這與該病害的病原菌已有報(bào)道相符（劉克均 等，1991；陳建 等，2020）。

蘆筍莖枯病是蘆筍主要病害，用于防治該病害的化學(xué)藥劑較多，僅在我國(guó)登記的就有嘧菌酯、代森鋅、苯醚甲環(huán)唑、福美雙、苯菌靈等10 種殺菌劑和1 種誘導(dǎo)抗病激活劑氨基寡糖素（中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)，http：//www.chinapesticide.org.cn/fwb/index.jhtml），也有報(bào)道表明吡唑醚菌酯、醚菌酯等殺菌劑（董克鋒 等，2015；劉美玲 等，2019；宋化穩(wěn) 等，2019）和春雷霉素、多抗霉素等抗生素（楊迎春等，2018；楊帥 等，2021）對(duì)蘆筍莖枯病也有較好的防治效果。為篩選出更多對(duì)蘆筍莖枯病具有較好防治效果的殺菌劑，本試驗(yàn)選取了部分與已經(jīng)登記防治該病害的藥劑具有相同作用機(jī)理的殺菌劑，如代森鋅與丙森鋅，均屬于二硫代氨基甲酸鹽類殺菌劑；嘧菌酯與醚菌酯、吡唑醚菌酯、啶氧菌酯均為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，其中吡唑醚菌酯和啶氧菌酯均為甲氧基丙烯酸酯類較新的殺菌劑，且活性較高。本試驗(yàn)對(duì)11 種藥劑進(jìn)行了生物活性測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吡唑醚菌酯可以完全抑制蘆筍莖枯病菌菌絲的生長(zhǎng)；之后在對(duì)5 種殺菌劑防治蘆筍莖枯病的盆栽試驗(yàn)效果評(píng)價(jià)時(shí)也發(fā)現(xiàn)，吡唑醚菌酯表現(xiàn)最佳，防效可達(dá)到94.56%，該殺菌劑在我國(guó)登記可用于防治蘆筍褐斑?。⊿acc.）（中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)）。因此，在蘆筍發(fā)生莖枯病或者褐斑病時(shí)選用吡唑醚菌酯進(jìn)行防治，具有兼防（預(yù)防）兩種病害的作用，提高了殺菌劑的使用效率，降低了用藥量，具有節(jié)本增效的意義。

為降低田間頻繁用藥可能導(dǎo)致的抗藥性問(wèn)題，增加交替用藥的選擇范圍。本試驗(yàn)在生物活性測(cè)定中選擇了具有不同作用機(jī)理的殺菌劑，如二甲酰亞胺類觸殺性、保護(hù)性殺菌劑異菌脲和腐霉利，應(yīng)用范圍和殺菌譜較廣的琥珀酸脫氫酶抑制劑氟吡菌酰胺，以及廣譜、保護(hù)性殺菌劑百菌清，測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)異菌脲和百菌清對(duì)蘆筍莖枯病病原菌均表現(xiàn)較好的生物活性，EC值分別為2.25 μg·mL和0.13 μg·mL，可作為田間防治蘆筍莖枯病的替換用藥。

本試驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)登記用于防治蘆筍莖枯病的殺菌劑嘧菌酯的生物活性較差，其EC值高達(dá)48.70 μg·mL。嘧菌酯在杭州市佳慧蘆筍種植基地屬于防治蘆筍莖枯病的常用藥劑，推測(cè)可能是由于該藥劑在田間應(yīng)用頻繁，導(dǎo)致當(dāng)?shù)靥J筍莖枯病病原菌菌株存在一定程度的抗藥性，因此活性降低。生產(chǎn)中建議合理用藥，多種作用機(jī)理殺菌劑輪換使用以減少抗藥性發(fā)生。

盆栽藥效評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，選擇先施藥后接種的預(yù)防用藥措施，篩選出了對(duì)莖枯病防治效果較好的吡唑醚菌酯。建議在田間蘆筍莖枯病易發(fā)病季節(jié)，提前選擇吡唑醚菌酯進(jìn)行1～2 次預(yù)防用藥，不但可以預(yù)防莖枯病的發(fā)生，也可以兼防褐斑病。但由于吡唑醚菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，國(guó)際殺菌劑抗性行動(dòng)委員會(huì)將該類殺菌劑定義為高風(fēng)險(xiǎn)抗藥性類別（FRAC，2021），應(yīng)用時(shí)需要與其他殺菌劑輪換使用，且單個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)不要超過(guò)3 次用藥。同時(shí)也需要重視新型殺菌劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用（王建國(guó) 等，2002），為更好地防控蘆筍莖枯病提供資源儲(chǔ)備。