青海管花肉蓯蓉不同部位的功能性成分及其抗氧化活性

趙 巖，于鑫淼，魏玉萍，白冰瑤，張 麗，張 斌，潘磊慶，宋麗軍,

（1.塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾 843300；2.蚌埠學院食品與生物工程學院，安徽蚌埠 233030；3.南京農業(yè)大學食品科技學院，江蘇南京 210095）

管花肉蓯蓉（Cistanche tubulosa），也稱之為南疆大蕓、紅柳大蕓、硬大蕓[1]，主要分布在我國新疆南疆[2]，寄生于檉柳（紅柳）屬植物的根部，柴性較大，木質纖維比重較高。由于肉蓯蓉屬為寄生植物，其有效成分的種類和含量與寄主的存活能力以及獲取養(yǎng)分的能力密切相關[3]。管花肉蓯蓉的宿主植物紅柳根系深廣，能夠為其提供更多的營養(yǎng)成分，故管花肉蓯蓉中生物活性物質種類豐富，如松果菊苷、毛蕊花糖苷和多糖等[4?5]。研究發(fā)現，肉蓯蓉具有抗氧化、護肝、潤腸通便、降血糖、降血脂、緩解疲勞等生理活性[6?11]。其中松果菊苷和毛蕊花糖苷等苯乙醇苷類化合物為補腎陽、抗衰老、抗疲勞主要藥效物質[12]，同時能夠增殖成骨細胞并促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化[13?14]。2020 版《中國藥典》規(guī)定管花肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的總量不得少于1.5%[15]。

隨著肉蓯蓉需求量的增加，野生資源的逐漸匱乏，人工種植管花肉蓯蓉已成為市場上的主流品種[16]。青海省位于我國的西北地區(qū)，與甘肅、新疆相鄰，其中柴達木盆地降水量低，氣候干旱，適合荒漠植物的生長。目前在青海地區(qū)已成功實現肉蓯蓉仿野生栽培，產量日益增加。肉蓯蓉具有“性從地變，質與物遷”的特性，栽培環(huán)境對其品質具有顯著影響，目前我國對管花肉蓯蓉的研究產地多為新疆南疆地區(qū)，關于其它地區(qū)管花肉蓯蓉品質的研究不夠深入。

因管花肉蓯蓉各部位的有效成分含量差異懸殊[1]，為更加合理的進行品質評價，本文以青海地區(qū)栽培的管花肉蓯蓉為原料，對其不同部位生物活性成分及抗氧化活性進行系統測定，為青海管花肉蓯蓉的質量評價及其加工產品的標準化提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

肉蓯蓉樣品 青海柴達木地區(qū)管花肉蓯蓉干燥肉質莖。取1 kg 樣品（15~20 cm），根據已報道[17?18]的取樣方法，將每個樣品平均分成3 份，分別命名為根部、中部、頂部（圖1），樣品粉碎后過50 目篩，真空密封包裝備用。乙腈、甲酸 色譜純，德國Merck公司；毛蕊花糖苷、松果菊苷標準品 色譜純，安倍爾（上海）有限公司；其他試劑 均為國產分析純。

圖1 不同部位肉蓯蓉劃分示意圖Fig.1 Schematic diagram of different parts ofCistanchetubulosa

FA2204B 電子天平 歐萊博光電技術（北京）有限公司；FW-135 超微粉碎機 北京永光明醫(yī)療器械有限公司；DHG-9030A 電熱鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；HC-1016 離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；752G 紫外可見分光光度計、LC-210 高效液相色譜儀 上海精密科學儀器有限公司；BK-EL10C 多功能酶標儀 博騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總多酚含量測定 采用福林酚法測定，參照LI 等[19]的方法稍作修改。

樣液的制備：準確稱取樣品粉末0.50 g，按料液比1:40（70%乙醇），于60 ℃條件下超聲輔助提取40 min，冷卻后離心10 min（4500 r/min），取上清液定容至50 mL 備用。

取樣品溶液1 mL，加入5 mL 福林酚溶液（10%），混勻，靜置15 min，加入4 mL Na2CO3溶液（7.5%），漩渦振蕩搖勻，于室溫條件下避光靜置40 min，用紫外-可見分光光度計于765 nm 處測定吸光度。以沒食子酸配制標準溶液繪制標準曲線方程為y=0.0505x+0.0347，R2=0.9991，樣品測定結果以沒食子酸當量表示（mg Gallic acid equivalent，GAE/g DW）。

1.2.2 總多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法測定，參照Dubois 等[20]的方法稍作修改。

樣液的制備：精確稱取樣品粉末1.00 g，按料液比1:30（去離子水），于50 ℃條件下超聲輔助提取60 min，冷卻后離心10 min（4500 r/min），取上清液，緩慢加入95%乙醇至乙醇終濃度為80%，4 ℃條件下靜置12 h 后，4500 r/min 離心處理，棄去上清液，將沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚清洗，反復清洗兩次后，加入去離子水復溶，用sevage 溶液（氯仿:正丁醇=4:1）脫去蛋白，定容后待測。

取1 mL 樣液加入600 μL 苯酚溶液（6%）、3 mL濃硫酸，渦旋混合60 s 后，沸水浴10 min，冷卻至室溫后于490 nm 處測定吸光度。以葡萄糖配制標準溶液繪制標準曲線方程為y=0.0146x?0.015，R2=0.9998，樣品測定結果以葡萄糖當量表示（mg dextrose equivalent，DE/g DW）。

1.2.3 總三萜含量測定 參照何策等[21]的方法稍作修改。

樣液制備方法同1.2.1。取0.4 mL 樣液水浴揮干，加入0.4 mL 1.5%香草醛-冰乙酸溶液（現用現配），再加入1.6 mL 高氯酸，70 ℃水浴15 min，取出后快速冷卻，加入5 mL 乙酸乙酯，靜置5 min 后于560 nm 處測定吸光度。以齊墩果酸配制標準溶液繪制標準曲線方程為y=16.005x?0.0256，R2=0.9987，樣品測定結果以齊墩果酸當量表示（mg Oleanolic acid equivalent，OAE/g DW）。

1.2.4 總原花青素含量測定 采用香草醛-鹽酸法測定，參照呂筱等[22]的方法稍作修改。

樣液的制備：精確稱取樣品粉末0.50 g，按料液比1:30（80%乙醇），于50 ℃條件下超聲輔助提取40 min，冷卻后離心10 min（4500 r/min），取上清液定容至50 mL 備用。取干凈試管加入0.5 mL 樣液、3 mL 香草醛-甲醇溶液（4%），混勻，再加入1.5 mL濃鹽酸，混勻后于室溫條件下顯色20 min，于500 nm處測定吸光度。以原花青素配制標準溶液繪制標準曲線方程為y=2.1709x?0.0036，R2=0.9979，樣品測定結果以原花青素當量表示（mg Proanthocyanidin equivalent，PCE/g DW）。

1.2.5 毛蕊花糖苷與松果菊苷含量測定 參照許明君等[23]的實驗方法并略加修改。

樣液的制備：精確稱取樣品粉末1.00 g，按料液比1:30（80%乙醇），于60 ℃條件下超聲輔助提取40 min，冷卻后離心10 min（4500 r/min），取上清液定容至50 mL 備用。

色譜柱：Alltima C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.4%甲酸溶液（A）-乙腈（B）；洗脫程序為0~10 min，90%（A）；10~20 min，90%~80%（A）；20~30 min，80%~75%（A）；30~40 min，75%~80%（A）；40~50 min，80%~90%（A），柱溫25 ℃，流速1.00 mL/min；檢測波長：330 nm；進樣量10 μL。以濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標，繪制松果菊苷標準曲線y=15311296.40x?119140.61，R2=0.9996，線性范圍0.04~0.48 mg/mL；毛蕊花糖苷標準曲線y=21780400.45x?121356.95，R2=0.9994，線性范圍0.04~0.08 mg/mL。松果菊苷與毛蕊花糖苷標準品HPLC 色譜圖見圖2和圖3。

圖2 松果菊苷標準品HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of echinoside standard

圖3 毛蕊花糖苷標準品HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of verbascoside standard

1.2.6 體外抗氧化活性測定 樣液制備：稱取1.20 g樣品粉末，加入30 mL 乙醇（60%），于60 ℃條件下超聲輔助提取40 min，冷卻后離心10 min（4500 r/min），取上清溶液，加入乙醇（60%）稀釋，使樣液濃度分別為1、3、5、10、20、30、40 mg/mL，待測。

1.2.6.1 ABTS 自由基清除能力 參照Roberta 等[24]的實驗方法稍作修改：用去離子水配制ABTS 終濃度為7 mmol/L 與過硫酸鉀終濃度為2.45 mmol/L的混合溶液，于25 ℃避光靜置12 h。使用前用去離子水稀釋，使其在734 nm 處的吸光度為（0.70±0.05），即得ABTS 工作液。取10 μL 樣液加入酶標板中，再加入200 μL ABTS 工作液，室溫避光反應30 min后，于734 nm 處測定吸光度，以60%乙醇為對照。按照公式（1）計算ABTS 自由基清除率。

其中：A0：空白對照（60%乙醇代替樣品）的吸光值；A1：ABTS 溶液與樣品的吸光值；A2：去離子水代替ABTS 溶液的吸光值。

1.2.6.2 DPPH 自由基清除能力 參照Kirigaya 等[25]的實驗方法稍作修改：將10 μL 樣液與250 μL 新配制的DPPH 溶液加入酶標板充分混勻，室溫避光條件下反應30 min，以60%的乙醇為對照，在517 nm 處測定吸光度。按照公式（2）計算DPPH 自由基清除率。

其中：A0：空白對照（60%乙醇代替樣品）的吸光值；A1：DPPH 溶液與樣品的吸光值；A2：無水乙醇代替DPPH 溶液的吸光值。

1.3 數據處理

所有數據平行測定三次，結果以平均值±標準偏差（SD）的表示。利用SPSS Statistics 26.0 軟件對數據進行相關性分析、方差分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 管花肉蓯蓉不同部位的生物活性物質含量

圖4 為管花肉蓯蓉不同部位總多酚含量。由圖4可知：根部的總多酚含量顯著高于中部和頂部（P＜0.05）。根部含量為36.62 mg GAE/g DW，中部和頂部分別為20.10 mg GAE/g DW 和12.13 mg GAE/g DW。根部總多酚含量分別為中部、頂部的1.82 倍和3.02 倍。包斌等[26]通過用不同溶劑提取管花肉蓯蓉中的總多酚，結果顯示甲醇、乙醇提取物中總多酚含量分別為32.65±6.22 和31.45±3.54 mg GAE/g DW，與本文根部總多酚含量較接近。

圖4 肉蓯蓉不同部位總多酚含量Fig.4 Total polyphenol content in different parts ofCistanche tubulosa注：圖中不同字母表示組間差異顯著（P＜0.05）；圖4~圖9 同。

圖5 為管花肉蓯蓉不同部位總多糖含量。由圖5可知：根部的總多糖含量顯著高于中部和頂部（P＜0.05），根部含量（28.06 mg DE/g DW）分別為中部含量（18.71 mg DE/g DW）和頂部含量（13.15 mg DE/g DW）的1.50 倍、2.13 倍。楊太新等[27]通過對華北平原管花肉蓯蓉不同部位的多糖含量進行研究，發(fā)現多糖含量根部>中部>頂部，與本文研究結果一致。

圖5 肉蓯蓉不同部位總多糖含量Fig.5 Total polysaccharide content in different parts ofCistanche tubulosa

原花青素廣泛存在于植物中，有著較強的清除自由基和抗氧化能力，具有抗腫瘤、抗衰老、防治糖尿病的功效，具有極高的食用、藥用價值[28]。三萜類化合物具有抗腫瘤、抗炎、保肝保腎以及調節(jié)免疫系統等作用[29]。

本文研究了管花肉蓯蓉不同部位的總三萜含量（圖6）和總原花青素含量（圖7）。由圖6 可知：根部的總三萜含量較高，為10.52 mg OAE/g DW，其次為中部（8.02 mg OAE/g DW）和頂部（6.44 mg OAE/g DW）。由圖7 可知：三部位之間的總原花青素含量無明顯差異（P>0.05），其根部、中部和頂部的含量分別為2.76、2.59、2.88 mg PCE/g DW。與其他富含色素的植物相比，管花肉蓯蓉中原花青素含量較低。

圖6 肉蓯蓉不同部位總三萜含量Fig.6 Total triterpenoid content in different parts ofCistanche tubulosa

圖7 肉蓯蓉不同部位總原花青素含量Fig.7 Total procyanidin content in different parts ofCistanche tubulosa

松果菊苷和毛蕊花糖苷是肉蓯蓉中主要的生物活性物質。圖8 為肉蓯蓉不同部位松果菊苷含量。由圖8 可知：根部的松果菊苷含量最高，含量為79.12 mg/g DW，中部和頂部含量分別為27.53、11.73 mg/g DW，根部含量分別為中部和頂部的2.87 倍、6.75 倍。

圖8 管花肉蓯蓉不同部位松果菊苷含量Fig.8 Echinoside content in different parts ofCistanche tubulosa

圖9 為肉蓯蓉不同部位毛蕊花糖苷含量。由圖9 可知：根部的含量為13.31 mg/g DW，中部和頂部的含量分別為4.84、3.48 mg/g DW；根部含量分別為中部、頂部的2.75 倍、3.82 倍。郭雄飛[1]、楊太新[17]通過對管花肉蓯蓉不同部位的松果菊苷與毛蕊花糖苷進行測定比較，發(fā)現根部的含量顯著高于其他部位，與本文測定結果一致。本文中青海管花肉蓯蓉三個部位松果菊苷的平均含量為39.46 mg/g DW，毛蕊花糖苷的平均含量為7.21 mg/g DW，兩種有效成分總含量為46.67 mg/g DW（4.67%），滿足《中國藥典》對其規(guī)定的不少于1.5%的含量要求。而蔡鴻等[16]測定60 批新疆地區(qū)產管花肉蓯蓉，其中松果菊苷含量為3.39~86.64 mg/g DW，平均含量29.24 mg/g DW，毛蕊花糖苷含量為0.70~12.89 mg/g DW，平均含量為5.43 mg/g DW。由此表明，本文中青海管花肉蓯蓉樣品根部的松果菊苷與毛蕊花糖苷含量較高，且三部位的平均值也高于新疆地區(qū)60 批樣品的平均值。

圖9 管花肉蓯蓉不同部位毛蕊花糖苷含量Fig.9 Verbascoside content in different parts ofCistanche tubulosa

綜上所述，本文所研究的管花肉蓯蓉樣品三個部位中，除總原花青素無顯著差異性，其它有效成分含量均為根部>中部>頂部。這一結果與同為肉蓯蓉基源植物的荒漠肉蓯蓉表現一致，姬曉慧等[30]通過對荒漠肉蓯蓉不同部位的功效物質含量差異進行比較，發(fā)現根部的多種功效物質要高于其他部位，分析產生這一現象可能與其生殖生長及營養(yǎng)成分的運輸有關。

2.2 管花肉蓯蓉不同部位的抗氧化活性

肉蓯蓉富含多種抗氧化活性成分，其總抗氧化活性與不同活性成分之間的協同作用密切相關[26]。圖10 和圖11 分別為管花肉蓯蓉不同部位對ABTS和DPPH 自由基的清除能力。由圖10 可知：隨著樣品濃度的增加，對ABTS 自由基的清除能力逐漸增強。根部對ABTS 自由基的清除能力最強，其次為中部和頂部。當濃度為5 mg/mL 時，根部、中部和頂部的清除率分別為96.75%、93.82%和81.03%；當樣品濃度為10 mg/mL 時，根部和中部對ABTS自由基的清除率達到99%以上，接近抗壞血酸的清除能力。根部、中部和頂部對ABTS 自由基清除能力的IC50值分別為0.91、1.59 和2.32 mg/mL（表1）。

圖10 管花肉蓯蓉不同部位ABTS 自由基清除能力Fig.10 ABTS free radical scavenging ability in different parts ofCistanche tubulosa

圖11 管花肉蓯蓉不同部位DPPH 自由基清除能力Fig.11 DPPH free radical scavenging ability in different parts ofCistanche tubulosa

如圖11 所示，隨著樣品濃度的增加，對DPPH自由基的清除能力也逐漸增強。根部對DPPH 自由基的清除能力最強，其次為中部和頂部。當樣品濃度為10 mg/mL 時，根部、中部和頂部的清除率分別為76.31%、64.75%和54.54%，當樣品濃度大于10 mg/mL時，濃度的增加并沒有對DPPH 自由基的清除帶來明顯的效果，雖然未達到抗壞血酸的清除效果，但也表現出較好的自由基清除能力。根部、中部和頂部對DPPH 自由基清除能力的IC50值分別為0.77、5.16、10.66 mg/mL（表1）。*相關性顯著（P＜0.05），**相關性極顯著（P＜0.01）。

表1 不同部位自由基清除能力的IC50值（mg/mL）Table 1 IC50values of free radical scavenging ability of different parts (mg/mL)

包斌等[26]分別研究了管花肉蓯蓉甲醇和乙醇提取物的抗氧化活性，結果顯示兩種提取物均可有效清除DPPH 自由基，甲醇和乙醇提取物的DPPH IC50值分別為0.142、0.175 mg/mL；何夢夢等[31]通過研究發(fā)現，肉蓯蓉水提物對DPPH 和ABTS 自由基具有較強的清除能力。上述研究結果均表明肉蓯蓉提取物均有較好的自由基清除能力。

綜上所述，青海省管花肉蓯蓉對ABTS 和DPPH自由基均有較好的清除能力，且不同部位的抗氧化能力順序均為：根部>中部>頂部。

2.3 相關性分析

表2 為不同指標之間的相關性，由表2 可知，總多酚含量與總多糖、總三萜以及松果菊苷含量之間呈顯著正相關（P＜0.05）；總多糖與總三萜含量呈極顯著正相關（P＜0.01），與松果菊苷含量呈顯著正相關（P＜0.05）；松果菊苷與毛蕊花糖苷含量呈顯著正相關（P＜0.05）；ABTS IC50值與總三萜含量呈顯著負相關（P＜0.05）；ABTS IC50值及DPPH IC50值與總多酚、總三萜、總多糖、松果菊苷、毛蕊花糖苷含量呈負相關，說明青海管花肉蓯蓉的DPPH 和ABTS 自由基清除能力與總多酚、總三萜、總多糖、松果菊苷以及毛蕊花糖苷含量密切相關；ABTS IC50值及DPPH IC50值與總原花青素含量呈正相關關系，可能是由于三個部位的總原花青素含量差異不顯著導致，并不能說明總原花青素無抗氧化能力。

表2 不同測定指標相關性分析Table 2 Correlation analysis of different measured indexes

3 結論

本文對青海管花肉蓯蓉根、中、頂三部位生物活性成分含量及其抗氧化活性進行了比較研究。研究表明，青海管花肉蓯蓉中含有豐富的多酚、三萜、多糖、苯乙醇苷類等生物活性物質。除總原花青素在不同部位的含量差異不顯著外，總多酚、總三萜、總多糖、松果菊苷及毛蕊花糖苷含量均表現為根部>中部>頂部。其中的松果菊苷與毛蕊花糖苷平均含量分別為39.46、7.21 mg/g DW，滿足2020 版《中國藥典》規(guī)定的標準。管花肉蓯蓉對ABTS 和DPPH 自由基均有較強的清除能力，且不同部位的抗氧化能力強弱順序均為根部>中部>頂部。其根部、中部和頂部對ABTS 自由基清除能力的IC50值分別為0.91、1.59、2.32 mg/mL，對DPPH 自由基清除能力的IC50值分別為0.77、5.16、10.66 mg/mL。管花肉蓯蓉醇提物對ABTS 自由基與DPPH 自由基的具有較強的清除能力。本研究為青海管花肉蓯蓉的精深加工提供了基礎數據。