蓮原花青素對華夫餅AGEs 的抑制及感官品質(zhì)的影響

談江瑩，陳紫婷，秦佳斌，王伊琳，吳 茜

（湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北武漢 430068）

食品加工中發(fā)生美拉德反應所形成的潛在危害安全物質(zhì)如丙烯酰胺（acrylamide, AA）、雜環(huán)胺（heterocyclic amines, HAs）和晚期糖化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products, AGEs）等[1]已受到廣泛關(guān)注。AGEs 是經(jīng)過美拉德反應中期、后期階段形成的一類復雜化合物的總稱，其形成和積累與衰老和糖尿病等多種疾病的發(fā)病機制有關(guān)。如AGEs與糖化終產(chǎn)物受體結(jié)合，誘導機體發(fā)生氧化應激與炎癥反應[2]；KATARíNA 等[3]已發(fā)現(xiàn)，過多地攝入熱加工的食品會導致糖尿病，并誘發(fā)炎癥，增強氧化應激，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生。此外，一系列的動物研究發(fā)現(xiàn)，老鼠食用富含AGEs 的食物會引起尿蛋白增加[4]和腎臟損傷等一系列問題。這些發(fā)現(xiàn)表明，飲食中AGEs 可能被認為是威脅人類健康的慢性危險因素。因此，有必要了解食物中飲食AGEs 的情況。

調(diào)控烘焙食品中美拉德反應產(chǎn)物AGEs 的傳統(tǒng)方法非常依賴于產(chǎn)品及加工參數(shù)（如溫度）、成分（如前體含量、pH 和含水量）等，這些因素的變化或抑制劑的添加都會影響食品的質(zhì)量[5]。然而，近幾年發(fā)現(xiàn)一種潛在的治療方法，通過使用各種天然抗氧化劑，清除美拉德反應中形成AGEs 的自由基，達到抑制AGEs 生成的目的。目前發(fā)現(xiàn)可用于食品加工的AGEs抑制劑主要包括黃酮類、酚酸等多酚類物質(zhì)[6]。許多酚類化合物在模擬生理條件下具有抗糖化作用，如蓮原花青素（LSPC）。蓮原花青素是從蓮科植物蓮的成熟花托中分離的天然多酚類化合物，主要由（+）-兒茶素、（?）-表兒茶素和B 型原花青素二聚體、三聚體、四聚體組成[7]。LSPC 是國際公認的最有效的天然抗氧化劑，分子結(jié)構(gòu)中的多元羥基賦予蓮原花青素優(yōu)良的抗氧化活性和與酶的結(jié)合能力[8]，并使其在體內(nèi)發(fā)揮降血糖[9]、抗腫瘤[10]、抗炎[11]、抗衰老[12]、預防心血管疾病[13]和抑制AGEs 的生成[14]的作用。

迄今為止，很少有研究全面評價酚類化合物與AGEs 之間的抑制關(guān)系及感官品質(zhì)的影響。華夫餅作為一種熱加工食品，其中含有大量的糖類、蛋白質(zhì)及脂類，在熱加工過程中會發(fā)生劇烈的美拉德反應從而生成AGEs。因此，本研究以添加不同LSPC 濃度的華夫餅為研究對象，探究LSPC 對華夫餅中AGEs 抑制和感官品質(zhì)的影響，為深入研究LSPC 對食品熱加工過程中AGEs 抑制作用及感官品質(zhì)影響提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蓮原花青素粗提物 華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院天然產(chǎn)物實驗室提供，經(jīng)AB-8 大孔吸附樹脂進一步純化后，以葡萄籽原花青素為對照，采用鹽酸-正丁醇法測得其原花青素含量為98.87%（w/w）；面粉、白砂糖、黃油、玉米淀粉 安琪酵母股份有限公司；雞蛋 正大集團；德亞全脂純牛奶 品渥食品股份有限公司；甲醇 色譜純，瑞典Oceanpak 試劑公司；甲酸 色譜純，阿拉丁試劑（上海）有限公司；其他試劑均為分析純或色譜純，均來自上海麥克林生化科技有限公司。

ME3002/02 電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CT15RE 離心機、F7000 熒光酶標儀 日本日立公司；XW-80A 微型渦旋混合儀 上海瀘西分析儀器廠有限公司；UV-1601 紫外可分光光度計 北京瑞麗分析儀器有限公司；RF5301 熒光分光光度計 日本島津公司；HH-8CJ 數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋 常州市金壇友聯(lián)儀器研究所；FE20 型pH 計 瑞士Mettler-Toledo；RE-111 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀瑞士Buchi 公司；1260 型高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司；LSPCX 固體萃取柱、Eclipse Plus C18色譜柱 Agela 科技公司；PEN3 便攜式電子鼻系統(tǒng) 德國Airsense 公司；7890A/5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；SPME 手動進樣萃取頭 美國Supelco 公司；TA-XY2i 型質(zhì)構(gòu)儀 美國Stable Micro System 有限公司；CM3500d反射分光光度計 日本大阪的柯尼卡美能達傳感公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 華夫餅的制備 根據(jù)楊軍等[15]的方法略有改動。所有華夫餅都用相同的原料制備。首先，分離兩個雞蛋的蛋清蛋黃，在蛋黃中加入65 g 面粉，40 g 黃油，90 mL 牛奶，5 g 玉米淀粉后混合成蛋黃漿液；在蛋清中分三次加入25 g 白砂糖，攪拌至硬性發(fā)泡。將攪拌好的蛋白霜分兩次加入蛋黃漿液，以切拌方式攪拌均勻，在模具中分別倒入20 g 華夫餅漿液。按表1 分別將不同濃度LSPC 溶于1.5 mL 去離子水中攪拌均勻。然后將樣品在170 ℃下烘焙20 min。

表1 LSPC 添加量Table 1 Content of LSPC

1.2.2 熒光AGEs 抑制率的測定 根據(jù)ZHANG 等[16]的方法略有改動，用去離子水提取模型華夫餅（250 mg），并用4.75 mL Carrez 溶液澄清（吐溫?20，0.05% v/v；SDS，1% w/v；β-巰基乙醇，5% v/v；Tris-HCl，50 mmol/L，pH7.4），超聲（300 W，37 ℃，30 min），離心（3000 r/min，10 min，25 ℃）并過濾（100 μL）。使用酶標儀在355/405 nm 的激發(fā)/發(fā)射波長下測定熒光AGEs。不包含LSPC 的反應溶液用作對照組。抑制率的計算公式為：

式中，F(xiàn)對照表示對照組熒光AGEs 強度，F(xiàn)樣品表示樣品組熒光AGEs 強度。

1.2.3 羧甲基賴氨酸含量（Nε-（Carboxymethyl）lysine，CML）的測定

1.2.3.1 樣品處理 根據(jù)GENGJU 等[17]的方法略有改動。在4 ℃下，將2 mL 0.2 mol/L 硼氫化鈉（pH13~14）添加到模型華夫餅樣品（500 mg）中12 h。使用4 mL 氯仿/甲醇（2:1，v/v）溶液對反應溶液進行脫脂，然后離心（在?4 ℃下15000 r/min）1 h。隨后，將鹽酸混合至終濃度為6 mol/L，并將樣品在110 ℃下水解24 h。將最終的CML 萃取液濃縮，直到用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥，然后溶解在4 mL 硼酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH9.4）中，然后進行最終的膜過濾（尼龍，0.45 mL）。根據(jù)SUN 等[18]的方法，對CML 處理測量方法進行了適當修改，將樣品（15 μL）注入Eclipse Plus C18色譜柱。

1.2.3.2 液相條件 流動相A：含0.2%甲酸的水溶液。流動相B：純甲醇，流速0.2 mL/min。梯度洗脫條件為0~0.5 min 10%B，0.5~4.0 min 10%~60%B。特征離子碎片m/z 84 和m/z 130 處的片段用于定性CML（m/z 205）。用CML 標準品外標曲線對樣品中CML 含量定量。通過MassHunter Data 和MassHunter Qualitative 對數(shù)據(jù)進行分析。

1.2.3.3 CML 抑制率計算 CML 的標準曲線方程為：y=2×106x+56683，R2=0.9928。

式中，x 表示CML 濃度，μg/mL；y 表示CML 的峰面積。

式中，X樣品表示LSPC-1、LSPC-2、LSPC-3、LSPC-4 樣品組CML 濃度，μg/mL；X對照表示LSPC-0 樣品組CML 濃度，μg/mL。

1.2.4 總酚含量的測定 參照LI 等[19]的方法略有改動，提取華夫餅中總酚。樣品溶于50%乙醇溶液（1:1，v/v），超聲溶解（37 ℃，1 h），離心（25 ℃，3000 r/min，5 min），分離固液相，保留上清液，取樣液（1.5 mL）與福林酚試劑（1.5 mL）混合靜置3 min，再加入碳酸鈉溶液（15%，1 mL），靜置30 min，離心后（25 ℃，3500 r/min，3 min），收集上清液，以15%碳酸鈉溶液為空白，測定760 nm 處的吸光度。標準曲線：y=0.0336x+0.0901，R2=0.9288。

式中，x 表示總酚含量（mg），y 表示760 nm 下測得的吸光值。

1.2.5 正丁醇-鹽酸法測定蓮原花青素消耗率 將華夫餅粉末（500 mg）與25 mL 甲醇混合，超聲處理（37 ℃，30 min），離心后（3000 r/min，5 min，25 ℃）過濾（1 mL）。取上清液，將其轉(zhuǎn)移至帶塞子的10 mL試管中，依次添加0.2 mL 硫酸鐵銨溶液和6 mL 正丁醇-鹽酸溶液，并充分搖勻。將反應溶液在95~97 ℃的水浴中濃縮回流40 min 后，迅速用冷水冷卻，并在546 nm 波長處測量吸光度?；谖舛群蜐舛戎g的關(guān)系繪制標準曲線，以計算殘留的LSPC的量。用甲醇代替樣品作為空白對照。消耗率的計算公式為：

式中，F(xiàn)對照表示對照組LSPC 含量（mg），F(xiàn)樣品表示樣品組LSPC 含量（mg）。

1.2.6 抗氧化活性測定

1.2.6.1 DPPH 自由基清除率 根據(jù)SING 等[20]的方法略有修改，估算了每種華夫餅提取物的DPPH自由基清除能力。將華夫餅粉末（200 mg）與10 mL去離子水混合，超聲處理（37 ℃，60 min），離心（3000 r/min，5 min，25 ℃）并過濾（1 mL）。在試管中將酚提取物樣品（0.2 mL）或0.2 mL 去離子水（空白）與3.8 mL 0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合。將DPPH-乙醇溶液替換為乙醇溶液作為對照或調(diào)零。將樣品在室溫下黑暗中靜置2 h 后在517 nm 下測量吸光度。

式中，A樣品表示樣品組吸光值，A對照表示對照組吸光值，A空白表示空白組吸光值。

1.2.6.2 ABTS 自由基清除率 根據(jù)THAIPONG 等[21]的方法略有修改。將華夫餅粉末（200 mg）與10 mL去離子水混合，超聲（37 ℃，60 min），離心（3000 r/min，5 min，25 ℃）并過濾。儲備溶液包括2.6 mmol/L 過硫酸鉀溶液和7.4 mmol/L ABTS 溶液。然后通過將兩種儲備溶液等量混合并在室溫下于黑暗中反應12 h 來制備工作溶液。通過使用分光光度計將21 mL去離子水與1 mL ABTS+溶液混合來稀釋溶液，以在734 nm 處獲得0.70±0.02 單位的吸光度。每次測定前制備新鮮的ABTS+溶液。使酚提取物（100 μL）與400 μL 的ABTS+溶液反應。用乙醇溶液代替酚提取物樣品作為空白。然后使用酶標儀在734 nm處測定吸光度。

式中，A樣品表示樣品組吸光值，A空白表示空白組吸光值。

1.2.6.3 FRAP 鐵離子還原能力 使用ERDOGANORHAN 等[22]的方法略有修改測試了還原鐵的能力。將華夫餅粉末（200 mg）與10 mL 去離子水混合，超聲（37 ℃，60 min），離心（3000 r/min，5 min，25 ℃）并過濾（1 mL）。在試管中將酚提取物樣品（100 μL）與300 μL 去離子水混合。然后加入3 mL 工作液（100 mL 乙酸鈉緩沖液，10 mL 10 mmol/L TPTZ溶液和10 mL 20 mmol/L FeCl3溶液）。用去離子水代替工作液作為對照。用去離子水代替酚提取物樣品作為空白。劇烈搖動混合物后，將樣品在37 ℃水浴鍋中加熱4 min。將200 μL 反應溶液加入到酶標儀中，并在593 nm 處測量吸光度。

式中，A樣品表示樣品組吸光值，A對照表示對照組吸光值，A空白表示空白組吸光值。

1.2.6.4 羥自由基清除率 根據(jù)LI 等[23]的方法略有修改，對每種華夫餅提取物的羥自由基清除能力進行了估算。將模型華夫餅（200 mg）與10 mL 去離子水混合，超聲（37 ℃，60 min），離心（3000 r/min，5 min，25 ℃）并過濾（2 mL）。在試管中將酚提取物樣品（1.5 mL）或1.5 mL 去離子水（空白）與1.5 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液混合。然后，加入1.5 mL H2O2（8.8 mmol/L）和1.5 mL FeSO4（9 mmol/L）。用去離子水代替FeSO4溶液作為對照。去離子水用于調(diào)零。充分混合后，將樣品在37 ℃的水浴箱中加熱10 min。將200 μL 反應溶液加入到酶標儀中，并在510 nm處測量吸光度。

式中，A樣品表示樣品組吸光值，A對照表示對照組吸光值，A空白表示空白組吸光值。

1.2.7 水分的測定

1.2.7.1 水分含量的測定 使用水分含量儀（200 mg，105 ℃）測定樣品的水分含量。

1.2.7.2 水分活度的測定 使用便攜式水分活度儀在25 ℃下測定水分活度。

1.2.7.3 低場核磁的測定 根據(jù)CAO 等[24]描述的方法稍作調(diào)整進行 NMR 測量。將樣品放入15 mm×200 mm 的核磁管中，并置于LF-NMR 分析儀中。該測試是在100 kHz 的諧振頻率下進行的。橫向（T2）弛豫是通過Carr-Purcell-Meiboom-Gill 脈沖序列獲得的，該序列具有4 個掃描和12000 個回波。兩次連續(xù)掃描之間的重復時間為3 s，脈沖之間的τ 值為250 μs，分別為90°和180°。T2 分布是通過MultiExp Inv 分析軟件獲得的。整個過程在20 ℃下進行三次重復。

1.2.8 pH 測定 將華夫餅粉末（250 mg）與25 mL水混合并渦旋3 min。將混合物在室溫下保持1 h 以分離固相和液相。小心除去上清液層后，使用pH 計測定pH。

1.2.9 華夫餅質(zhì)構(gòu)分析 根據(jù)王麗莎等[25]的方法稍加改動，測量華夫餅質(zhì)構(gòu)。采用紋理分析儀的P/36R圓柱探頭，按樣品標記順序進行測量。測量前探針離樣品越近越好。壓縮實驗參數(shù)設置如下：工作模式為TPA 方案；探針誘導5 g；測量前后中速度為5 mm/s；目標模式應變?yōu)?0%；數(shù)據(jù)采集點為500 pps，記錄硬度、彈性、凝聚力、膠粘性、咀嚼性和回彈性等紋理參數(shù)。

1.2.10 色度測定 根據(jù)谷滿屯等[26]的方法稍加改進測量華夫餅色度。華夫餅的顏色用CM-3500d 反射分光光度計進行測量，結(jié)果用CIE Lab 色彩系統(tǒng)表示。在華夫餅表面的不同區(qū)域?qū)*（紅色），b*（黃色）和L*（亮度）參數(shù)進行了三個獨立的測量。根據(jù)等式計算E值。用標準校準白板CRA43（L*=93.80；a*=0.3156；b*=0.3319）校準設備。

1.2.11 電子鼻分析 根據(jù)賈洪鋒等[27]的方法稍作調(diào)整，測量華夫餅電子鼻。稱量1 g 華夫餅粉末，將其放入20 mL 樣品瓶中，添加適量10%生理鹽水以完全潤濕樣品，密封樣品瓶，在37 ℃水浴中加熱30 min。使用PEN3 電子鼻進行風味檢測。電子鼻測試條件：樣品測試時間200 s，采樣間隔1 s，清潔時間120 s，復位時間10 s，內(nèi)部流速300 mL/min，樣品流速300 mL/min。對所有樣品重復測量3 次。使用PEN3 電子鼻頭隨附的數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)執(zhí)行主成分分析。

1.2.12 華夫餅揮發(fā)性成分GC-MS 測定

1.2.12.1 樣品預處理 根據(jù)LU 等[28]的方法稍加改進測量華夫餅氣質(zhì)。稱量1 g 華夫餅粉末到20 mL頂空微萃取樣品瓶中，放入轉(zhuǎn)子中，添加1 g 氯化鈉粉末以促進風味成分揮發(fā)，蓋上蓋子，插入萃取頭以固定。在磁力攪拌下于60 ℃的恒溫水浴中平衡30 min 后，向下推光纖頭繼續(xù)萃取10 min，清理光纖頭，拔下萃取頭的插頭，然后插入氣相色譜儀的入口。

1.2.12.2 GC 條 件 HP-5MS 毛 細 管 柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣（He）流速1.0 mL/min；不分流進樣；入口溫度250 ℃；升溫程序：柱初始溫度在40 ℃保持2 min，以4 ℃/min 升至160 ℃，保持1 min，然后以10 ℃/min 升至250 ℃，保持5 min。

1.2.12.3 MS 條件 電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；GC-MS 界面溫度280 ℃；四極溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 30~550。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用IBM SPSS Statistics 21 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以±s 表示，通過一元方差分析（One-Way ANOVA）進行多個組間平均數(shù)的比較，如果組間存在顯著性差異（P＜0.05），則采用Duncan 檢驗進行組間多重比較。利用Origin 8.0 軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮原花青素對華夫餅熒光AGEs 抑制率和CML抑制率的影響

目前已發(fā)現(xiàn)的AGEs 有20 種，依據(jù)熒光特性可分為熒光AGEs 和非熒光AGEs，其中，CML 是非熒光AGEs 的重要代表[29]。一方面CML 能與蛋白質(zhì)產(chǎn)生交聯(lián)，進而改變一些基質(zhì)蛋白分子的正常功能，另一方面，CML 還能與特異受體結(jié)合，通過生理反應來改變蛋白質(zhì)和細胞功能，從而導致機體的病理變化[30]。由圖1a 二級質(zhì)譜圖所示，84 m/z 的主離子碎片可以確定LSPC-3 華夫餅樣品中存在確定CML，由圖1b 提取離子流色譜圖所示，可以定量LSPC-3 華夫餅樣品中CML 峰面積，從而計算CML 含量。

圖1 LSPC-3 華夫餅的二級質(zhì)譜圖和提取離子流色譜圖Fig.1 Secondary mass spectrometry and extract ion chromatograpy of LSPC-3 waffle

如圖2 所示，添加不同濃度LSPC 華夫餅中，熒光AGEs 抑制率和CML 抑制率都隨LSPC 濃度的增加而呈上升趨勢，呈現(xiàn)劑量依賴性（熒光AGEs 抑制率的R2=0.993，CML 抑制率的R2=0.997）且有顯著性影響（P＜0.05）。其中，LSPC-4 樣品的熒光AGEs抑制率和CML 抑制率最高，分別為（40.53%±1.43%）、（72.08%±0.79%）。這表明隨華夫餅中LSPC 濃度的增加，LSPC 與華夫餅中蛋白質(zhì)、糖類等發(fā)生作用，因此，美拉德反應物一定程度上有所減少，生成的熒光AGEs 含量和CML 含量都相應減少，熒光AGEs 抑制率和CML 抑制率增高。同時，LSPC 作為天然抗氧化劑具有抗氧化作用，可以有效抑制美拉德反應中的氧化反應，從而抑制美拉德反應中有害AGEs 的生成。由此可見，在一定濃度范圍內(nèi)，LSPC 濃度越高，其對熒光AGEs 和CML 抑制作用越強，在食品中添加一定濃度的LSPC 可以有效抑制AGEs 的生成。

圖2 不同濃度LSPC 對華夫餅中AGEs 及CML 的抑制率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of LSPC on inhibition rate of AGEs and CML in waffles注：不同小寫字母代表AGEs 抑制率差異顯著（P＜0.05）；不同大寫字母表示CML 抑制率差異顯著（P＜0.05）。

2.2 蓮原花青素對華夫餅總酚含量的影響

LSPC 是植物中廣泛存在的一大類多酚類化合物的總稱[31]。如圖3 所示，添加不同濃度LSPC 華夫餅的總酚含量范圍為9.21~13.23 mg/g。在沒有添加LSPC 的LSPC-0 樣品中仍含有總酚，即華夫餅其本身含有某些種類的酚類物質(zhì)。在加入4.0 mg/g 的LSPC 后，總酚含量出現(xiàn)顯著性增加（P＜0.05）?？偡雍康脑黾又饕鞘Ｓ郘SPC 的量，盡管LSPC 絕大部分被消耗，但是存在一定的剩余。

圖3 不同濃度LSPC 對華夫餅中總酚含量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of LSPC on total phenol content in waffles注：不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）；圖4、圖8 同。

2.3 蓮原花青素對華夫餅蓮原花青素消耗率的影響

如圖4 所示，添加不同濃度LSPC 華夫餅中，LSPC 消耗率隨LSPC 濃度增加而呈上升趨勢，呈現(xiàn)劑量依賴性（R2=0.998）且有顯著影響（P＜0.05）。其中，LSPC-4 樣品的消耗率為（88.82%±0.05%），表現(xiàn)最高。結(jié)合圖2 結(jié)論：LSPC 濃度增加，其對美拉德反應產(chǎn)物AGEs 和CML 的抑制效果增強，推測隨LSPC 濃度的增加，與美拉德反應物作用的LSPC和抑制美拉德反應中氧化反應的LSPC 逐漸增加，因此，抑制美拉德反應產(chǎn)物AGEs 和CML 生成的能力越強。但同時溫度對LSPC 影響較大，隨加熱時間的延長，LSPC 含量在不同程度上有所降低[32]。因此，LSPC 消耗的原因既可能是由于抑制美拉德反應消耗，也可能是由于加熱過程中自身消耗或與其它組分相互作用。

圖4 不同濃度LSPC 對華夫餅中LSPC 消耗率的影響Fig.4 Effect of different concentrations of LSPC on consumption ratio of LSPC in waffles

2.4 蓮原花青素對華夫餅抗氧化活性的影響

糖化過程易產(chǎn)生AGEs，而自由基及氧化應激能加速糖基化的進程，因此，研究LSPC 對華夫餅中DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、FRAP 鐵離子還原能力以及羥自由基清除能力的影響。

如圖5 所示，在添加一定濃度范圍的LSPC 華夫餅中，DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、FRAP 鐵離子還原能力以及羥自由基清除能力基本呈上升趨勢。其中，最顯著的是DPPH 自由基清除能力，隨LSPC 濃度增加，其顯著增加（P＜0.05）。添加LSPC 后華夫餅的FRAP 鐵離子還原能力以及羥自由基清除能力與未添加LSPC 的華夫餅相比也有顯著差異（P＜0.05）。

圖5 不同濃度LSPC 對華夫餅中抗氧化性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of LSPC on antioxidant properties in waffles注：HRSA 指羥自由基清除率；不同小寫字母表示組間（同一抗氧化指標）差異顯著（P＜0.05）。

綜上，抗氧化能力最強的為LSPC-4 樣品組，其總酚含量對應也是最高的。這表明，總酚含量與抗氧化能力存在一定的關(guān)系且在本實驗研究呈現(xiàn)出正相關(guān)[33]。這也與其它研究結(jié)果一致：樣品中的DPPH 自由基的清除率與多酚含量呈正相關(guān)關(guān)系，而且關(guān)系極顯著。盡管多酚類物質(zhì)可能與蛋白質(zhì)消化產(chǎn)生肽相互作用，但仍具有較高的清除自由基的能力[34]。因此，多酚物質(zhì)的存在在一定程度上有利于提高華夫餅的抗氧化能力。

同時，抗氧化能力直接影響美拉德反應中的氧化反應。在實驗濃度范圍內(nèi)，LSPC 濃度越高，其抗氧化能力越強，從而抑制美拉德反應中氧化反應能力越強，抑制AGEs 生成的能力越強，即AGEs 抑制率越高，與上述實驗結(jié)論也相符。因此，可推測LSPC抑制AGEs 生成的部分機理可能與酚類物質(zhì)的抗氧化活性提高食品的抗氧化性有關(guān)。

2.5 蓮原花青素對華夫餅水分變化的影響

美拉德反應是生成AGEs 的重要途徑，而水分含量、水分活度以及水分存在形式都有可能影響到美拉德反應。因而，研究LSPC 的加入對華夫餅體系中水分含量、水分活度以及水分存在形式的影響。

如圖6 所示，添加不同濃度LSPC 后各華夫餅樣品組的水分活度無顯著差異（P>0.05）。這表明在實驗濃度范圍中，LSPC 不影響華夫餅中水分活度。其次，添加高濃度LSPC 的華夫餅樣品LSPC-3和LSPC-4，相較于未添加LSPC 或添加低濃度LSPC 的華夫餅，其水分含量有顯著性下降（P＜0.05）。由此推測，添加LSPC 后，水更易與小分子多酚類物質(zhì)結(jié)合，從而降低水分含量[35]。

圖6 不同濃度LSPC 對華夫餅中水分含量及水分活度的影響Fig.6 Effects of different concentrations of LSPC on water content and water activity in waffles注：不同小寫字母代表水分含量差異顯著（P＜0.05）；不同大寫字母表示水分活度差異顯著（P＜0.05）。

由NMR 原理可知，質(zhì)子所處的化學環(huán)境不同，其弛豫時間T2的長短便不相同，水分的自由度也不同[36?37]。弛豫時間T2越短表明水與物質(zhì)結(jié)合越緊密，說明質(zhì)子自由度越低，越難排出；弛豫時間T2越長說明質(zhì)子自由度越高，越容易排出，因此，弛豫時間T2可以間接反映水分的相態(tài)特征[38?39]。不同弛豫時間T2波峰所覆蓋的信號幅值，即弛豫時間T2區(qū)間的積分面積可表示各個區(qū)間氫質(zhì)子的相對含量，實現(xiàn)對不同相態(tài)水分的定量測定。弛豫時間T2的變化能夠反映水分子的流動性，因此可以了解添加不同含量LSPC 華夫餅中水分的遷移規(guī)律。

如圖7 所示，華夫餅的T2圖譜中包含多個峰，即說明華夫餅內(nèi)部含有多組分水，其中，0.1~10 ms區(qū)間內(nèi)的峰表示華夫餅中流動性最差的結(jié)合水，10~100 ms 區(qū)間內(nèi)的峰表示華夫餅中的不易流動水，而100~1000 ms 范圍內(nèi)的峰表示華夫餅中可以自由流動的自由水[40]。而且，不易流動水對應的信號增幅最大，在實驗濃度范圍，其隨LSPC 濃度增加逐漸下降。這表明，在實驗濃度范圍內(nèi)，不易流動水含量隨LSPC 濃度增大而減少，這與圖6 所示高濃度LSPC華夫餅中水分含量有所下降相吻合。

圖7 不同濃度LSPC 對華夫餅弛豫時間的影響Fig.7 Effects of different concentrations of LSPC on low field NMR in waffles

由上述結(jié)果可知，添加LSPC 對華夫餅中水分活度并無影響，但華夫餅中不易流動水含量有所減少，同時水分含量也相應減少。推測LSPC 可能通過影響華夫餅中水分的分布和遷移來影響水分含量，從而影響美拉德反應過程以抑制AGEs 的生成。

2.6 蓮原花青素對華夫餅pH 的影響

pH 是美拉德反應中的重要影響因素。如圖8所示，添加不同濃度LSPC 的華夫餅中，其pH 無顯著差異（P>0.05），均在7.95~8.00 之間，這與NAVARRO等[41]的研究結(jié)果一致。這表明，添加LSPC 并不影響華夫餅的pH，并非通過改變pH 來抑制美拉德反應生成的AGEs。

圖8 不同濃度LSPC 對華夫餅pH 的影響Fig.8 Effects of different concentrations of LSPC on pH in waffles

2.7 蓮原花青素對華夫餅色度的影響

添加LSPC 后的華夫餅肉眼可見顏色有所變化，因此采用色度儀對其進行更客觀測量。色度儀中L*表示華夫餅的明暗，L*越小，華夫餅越暗；a*表示華夫餅的紅綠，a*越大，華夫餅紅色越多；b*表示華夫餅的黃藍，b*越小，華夫餅越藍。如圖9 所示，在實驗濃度范圍內(nèi)，隨LSPC 的增加，華夫餅顏色更暗、更紅[42]、更藍，且顏色有顯著差異性（P＜0.05）。這種現(xiàn)象推測是LSPC 雖然會影響美拉德反應所產(chǎn)生的褐變產(chǎn)物，從而對華夫餅外觀顏色有一定影響，但LSPC 本身顏色為紅褐色，顏色較深，加入后使華夫餅外觀顏色更偏紅，顏色加深，亮度減暗。

圖9 不同濃度LSPC 對華夫餅色度的影響Fig.9 Effects of different concentrations of LSPC on chroma in waffles注：不同小寫字母表示組間（同一色度指標）差異顯著（P＜0.05）。

2.8 蓮原花青素對華夫餅質(zhì)構(gòu)的影響

如表2 所示，對硬度，添加1 mg/g 以上濃度LSPC 華夫餅硬度較未添加和添加0.50 mg/g 濃度LSPC 華夫餅有顯著性降低（P＜0.05），這表明添加較高濃度LSPC 能有效增加華夫餅的柔軟性；對彈性和凝聚性，添加4 mg/g 濃度LSPC 華夫餅有顯著性增加（P＜0.05），這表明高濃度LSPC 華夫餅彈性和凝聚性更好；對膠粘性、咀嚼性、回復性，添加LSPC 與未添加LSPC華夫餅無顯著性差異（P>0.05），這表明LSPC 對華夫餅的膠粘性、咀嚼性、回復性無影響。綜上，高濃度華夫餅硬度更小更柔軟，彈性和凝聚性更好，可以認為高濃度LSPC 華夫餅品質(zhì)更好。

表2 不同濃度LSPC 華夫餅質(zhì)構(gòu)分析Table 2 Texture analysis of waffles with different concentrations of LSPC

2.9 蓮原花青素對華夫餅電子鼻PCA 的影響分析

電子鼻是一種利用傳感器對樣品中不同氣體成分進行分析，能夠感知和識別氣味，進行氣味檢測的智能系統(tǒng)，具有類似鼻子的功能[43]。本研究采用的PEN3 型電子鼻是一種金屬氧化物傳感器型的電子鼻，具有10 個金屬氧化物氣體傳感器陣列，如表3所示。

表3 PEN3 型電子鼻傳感器敏感物質(zhì)Table 3 Sensitive substances of PEN3 electronic nose sensor

主成分分析（principal component analysis，PCA）是將研究對象的復雜多指標問題通過特定方式的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)化為簡單且較少數(shù)量綜合指標的一種重要統(tǒng)計方法，這些綜合指標之間既互不相關(guān)又能最大化提供研究對象原有指標所反映的絕大部分信息，并能快速實現(xiàn)模式或關(guān)系的可視化識別。

如圖10 所示，PC1貢獻率為76.93%，PC2貢獻率為21.41%，總貢獻率達到98.34%，說明PCA 可用于區(qū)分不同含量LSPC 華夫餅的揮發(fā)性氣味。在相同的實驗條件下，不同添加量的LSPC 華夫餅區(qū)分度較明顯，0.5、1.0、2.0 和4.0 mg/g LSPC 華夫餅的氣味呈現(xiàn)一定的聚類現(xiàn)象，但仍能夠有效區(qū)分，且不同含量均在各自區(qū)域，不發(fā)生重疊，說明各組華夫餅之間均存在差異，具有一定的研究價值。電子鼻是一種快速區(qū)分不同揮發(fā)組分風味差異的有效工具，但對于不同華夫餅之間風味差異物質(zhì)的表征還有待通過固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進一步研究[44]。

圖10 不同濃度LSPC 對華夫餅電子鼻PCA 分析Fig.10 PCA analysis of waffle electronic nose with different concentrations of LSPC

2.10 蓮原花青素對華夫餅揮發(fā)成分氣質(zhì)的GC-MS影響分析

利用GC-MS 在添加不同LSPC 濃度華夫餅中共檢測出36 種揮發(fā)性化合物。如表4 所示，LSPC-0 樣品檢測出12 種揮發(fā)性化合物，其中，酚類物質(zhì)1 種，相對含量為42.66%；醛類物質(zhì)1 種，相對含量為6.86%。LSPC-1、LSPC-2、LSPC-3 和LSPC-4 分別檢測出15 種、7 種、8 種和15 種，均無酚類物質(zhì)和醛類物質(zhì)。這表明，隨LSPC 的添加，使酚類消耗更多，醛類相對含量減少。而醛類物質(zhì)是產(chǎn)生AGEs的前體物質(zhì)，間接說明華夫餅中AGEs 的減少，提高了華夫餅的質(zhì)量安全[45]。酯類化合物是酸、醇在高溫作用下生成的產(chǎn)物, 為華夫餅帶來果香氣和奶氣[46]，添加LSPC 后，酯類含量有一定程度地增加，提高了華夫餅的感官品質(zhì)。

表4 GC-MS 分析風味物質(zhì)種類Table 4 Flavor substances analysis by GC-MS

3 結(jié)論

本研究通過添加不同濃度的LSPC 研究LSPC對華夫餅烘焙過程中美拉德反應AGEs 的抑制作用及感官品質(zhì)的影響。實驗濃度范圍內(nèi)，隨LSPC 濃度增加，華夫餅中AGEs 的抑制作用及抗氧化作用呈增加趨勢，這表明LSPC 能有效抑制華夫餅中AGEs的形成。感官品質(zhì)上，隨LSPC 濃度的增加，華夫餅色澤逐漸呈棕色，提高食欲。質(zhì)構(gòu)分析表明華夫餅添加LSPC 后硬度下降，彈性和凝聚性增強，口感上更為軟綿香甜。電子鼻PCA 分析和GC-MS 分析結(jié)果顯示，不同LSPC 濃度華夫餅的風味存在明顯差異，隨LSPC 濃度增加，酚類、醛類物質(zhì)含量減少，酯類物質(zhì)含量增加。綜上，將LSPC 添加至華夫餅中，不僅提高了華夫餅的抗氧化活性，抑制了美拉德反應有害物質(zhì)AGEs 的生成，同時其感官品質(zhì)也有一定程度的提升，這使其可能成為一種未來大眾膳食中的營養(yǎng)選擇。