知母多糖復(fù)合酶提取工藝優(yōu)化及其免疫活性

王歆彤，李朋月，吳蘭芳，武英杰，鄭玉光,3，劉叢穎，嚴(yán)玉平, ，景松松,

（1.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北石家莊 050200；2.河北中醫(yī)學(xué)院河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心，河北石家莊 050200；3.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北石家莊 050026）

知母為百合科知母（Anemarrhena asphodeloidesBunge）的干燥根莖，為藥食兩用的藥材，具有清熱瀉火，滋陰潤燥的功效[1]。研究表明其主要含有甾體皂苷類、雙苯吡酮類、木脂素類、黃酮類、多糖類等有效成分，多糖為主要有效成分之一[2?3]。藥理實驗表明，知母多糖具有明顯的降血糖、抗炎和抗氧化等活性[4?7]。尤其是，知母多糖還具有良好的免疫活性，實驗表明熱水提取知母多糖可以促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 釋放NO，促進(jìn)分泌因子IL-1、IL-6、TNF-α、IL-1β和COX-2 的表達(dá)，進(jìn)而增強巨噬細(xì)胞的免疫活性[8?9]。

知母多糖提取主要方法包括熱水提取、超聲波提取[10?11]。熱水提取需要高溫、提取時間長，可能導(dǎo)致非活性成分的共提取，并對活性成分產(chǎn)生不利影響[12]；超聲波提取方法要求設(shè)備復(fù)雜，較難實現(xiàn)工業(yè)化。酶輔助提取具有操作簡單、高效、環(huán)境友好、易于保持多糖結(jié)構(gòu)的優(yōu)點，酶輔助提取多糖已經(jīng)成為研究熱點[13]。由于植物細(xì)胞壁組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，單一酶破解細(xì)胞壁及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)較難，易導(dǎo)致成分溶出不完全。復(fù)合酶解法可針對植物細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)，充分破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，條件溫和，在多糖提取率提高的同時，可有效保護多糖的結(jié)構(gòu)和活性[14]。其中，纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶為常用酶類[15?17]。目前，對知母多糖成分的研究，主要集中在熱水提取知母多糖的結(jié)構(gòu)研究及其藥理活性方面，而針對復(fù)合酶提取知母多糖未見報道，知母多糖的復(fù)合酶提取工藝有待研究。

本研究采用正交試驗確定復(fù)合酶（纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶）配比，通過單因素實驗和響應(yīng)面法優(yōu)化建立一種新的復(fù)合酶法提取知母多糖的工藝，同時采用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 對復(fù)合酶提取知母多糖進(jìn)行初步的免疫活性評價，以期為知母多糖的進(jìn)一步研究開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

知母 采自河北張家口市尚義縣；經(jīng)嚴(yán)玉平教授鑒定為百合科知母Anemarrhena asphodeloidesBunge 的干燥根莖；果膠酶（40 U/mg）、纖維素酶（3 U/mg）、木瓜蛋白酶（80×104U/g）、DEAE-52 纖維素、脂多糖 北京索萊寶科技有限公司。

VICTOR NivoTM酶標(biāo)儀 珀金埃爾默有限公司；EYELA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、EYELA 水浴鍋 上海愛朗儀器有限公司；Eppendorf Centrifuge 5804 R 冷凍型多動能臺式離心機 德國艾本德股份公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復(fù)合酶提取知母粗多糖工藝 知母根莖去除雜質(zhì)，切厚片（0.4 cm），置于50 ℃烘箱烘干，粉碎過40 目篩。預(yù)處理方法：取干燥的知母粉末500.00 g，加10 倍體積80%乙醇進(jìn)行脫脂，干燥濾渣得脫脂知母殘渣，備用。參考復(fù)合酶提取多糖工藝[17?18]，稱取一定量的復(fù)合酶（纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶），加入pH 為5.5 的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖鹽，在一定的溫度下恒溫酶解一定的時間，沸水浴滅酶10 min。酶提液過濾，濃縮，放置室溫。加入4 倍無水乙醇，在4 ℃冰箱放置24 h，4200 r/min 離心10 min，將沉淀用80%的乙醇洗滌3 次，去離子水復(fù)溶，采用3500 Da 透析袋透析，凍干后即得知母粗多糖（APSE）。多糖得率計算公式：多糖得率（%）=（提取得到的知母多糖質(zhì)量/脫脂原料質(zhì)量）×100

1.2.2 復(fù)合酶添加量的優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實驗 a.木瓜蛋白酶輔助提?。喝?.00 g 預(yù)處理的知母粉末，保持液料比15:1（mL/g）、溫度55 ℃和酶解時間1.5 h 不變，以木瓜蛋白酶的添加量（4000、8000、12000、16000、20000 U/g）為自變量，按照 1.2.1 的實驗步驟進(jìn)行操作，測定多糖得率。

b.纖維素酶輔助提?。喝?.00 g 預(yù)處理的知母粉末，保持液料比15:1（mL/g）、溫度55 ℃和酶解時間1.5 h 不變，以纖維素酶的添加量（750、900、1050、1200、1350 U/g）為自變量，按照 1.2.1 的實驗步驟進(jìn)行操作，測定多糖得率。

c.果膠酶輔助提?。喝?.00 g 預(yù)處理的知母粉末，保持液料比15:1（mL/g）、溫度55 ℃和酶解時間1.5 h 不變，以果膠酶的添加量（400、800、1200、1600、2000 U/g）為自變量，按照 1.2.1 的實驗步驟進(jìn)行操作，測定多糖得率。

d.復(fù)合酶輔助提取及單酶對比：取5.00 g 預(yù)處理的知母粉末，保持液料比15:1（mL/g）、溫度55 ℃和酶解時間1.5 h 不變，添加木瓜蛋白酶、纖維素酶和果膠酶（根據(jù)1.2.2.1 中a、b、c 的試驗結(jié)果確定添加量），按照 1.2.1 的實驗步驟進(jìn)行操作，測定多糖得率。對比分析各單酶以及復(fù)合酶對知母多糖的影響。

1.2.2.2 正交試驗設(shè)計復(fù)合酶濃度 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以木瓜蛋白酶（A）、纖維素酶（B）和果膠酶（C）添加量為自變量，以知母多糖得率為因變量，進(jìn)行三因素三水平正交試驗，確定最佳復(fù)合酶配比，試驗設(shè)計見表1。

表1 L9（34）正交試驗因素水平及編碼Table 1 The factors and levels of L9(34) orthogonal experiment

1.2.3 復(fù)合酶提取條件的優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實驗 a.酶解溫度：取5 g 經(jīng)預(yù)處理的知母粉末，固定上述最佳酶配比，液料比為15:1（mL/g），提取時間為2 h。考察酶解溫度（45、50、55、60、65 ℃）對多糖得率的影響。

b.酶解時間：取5 g 經(jīng)預(yù)處理的知母粉末，固定上述最佳酶配比，酶解溫度55 ℃，液料比為15:1（mL/g）?？疾烀柑崛r間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對多糖得率的影響。

c.液料比：取5 g 經(jīng)預(yù)處理的知母粉末，固定上述最佳酶配比，酶解溫度55 ℃，提取時間2 h?？疾煲毫媳龋?0:1、15:1、20:1、25:1、30:1 mL/g）對多糖得率的影響。

1.2.3.2 Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計 在單因素優(yōu)化實驗基礎(chǔ)上，選取液料比（A）、酶解時間（B）和酶解溫度（C）作為Box-Behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計的3 個自變量，通過響應(yīng)面試驗設(shè)計建立知母多糖得率（Y）與自變量之間的函數(shù)關(guān)系[19]。響應(yīng)面試驗因素與水平見表2。

表2 Box-Behnken 試驗設(shè)計因素水平表Table 2 Factor and level table of Box-Behnken experimental design

1.2.4 知母多糖的分離純化 采用DEAE-52 纖維素陰離子交換層析柱對知母粗多糖進(jìn)行初步分離[20]。配制質(zhì)量濃度為20.0 mg/mL 溶液，分別以蒸餾水、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5 和0.8 mol/L NaCl 溶液梯度洗脫，設(shè)置流速為1 mL/min，每管收集10 mL。根據(jù)苯酚-硫酸法[21]檢測總糖含量。

1.2.5 知母多糖對RAW 264.7 巨噬細(xì)胞的免疫活性

1.2.5.1 細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng) 將液氮中凍存的RAW264.7巨噬細(xì)胞，迅速解凍，37 ℃水浴1~2 min 使其融化。細(xì)胞解凍后，用75%酒精擦拭外壁，轉(zhuǎn)移無菌操作臺。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，加入DMEM 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%青-鏈霉素），1000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.5.2 細(xì)胞增殖實驗 采用MTT 法[22]檢測APSE-0、APSE-1、APSE-2 和APSE-3 的細(xì)胞存活率。細(xì)胞以2×105個/mL 接種于96 孔板中，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，棄去上清液。設(shè)置對照組（DMEM 培養(yǎng)基）、脂多糖組（Lipopolysaccharide，LPS，1 μg/mL）和試驗組（APSE-0、APSE-1、APSE-2、APSE-3：1、10、50、100、250、500 μg/mL），每組設(shè)置3 個重復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸取上清液，每孔加入10 μL 5 mg/mL 的噻唑藍(lán)試劑（MTT），在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。去除上清液后，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），充分振蕩3 min，在490 nm波長處測定吸光度。細(xì)胞增殖率（%）=（試驗組OD 值/細(xì)胞對照組OD 值）×100

1.2.5.3 NO 釋放量檢測 采用Griess 法[23]測定上清液中NO 的含量。將RAW264.7 細(xì)胞（5×105個/mL）接種在96 孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對照組、LPS 組（1 μg/mL）和 試 驗 組（APSE-0、APSE-1、APSE-2、APSE-3：1、10、50、100、250、500 μg/mL），每組設(shè)置3 個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集上清液與Griess Ⅰ（5%磷酸中含1%磺胺嘧啶）和GriessⅡ（蒸餾水中含0.1% 1-萘二酰胺二鹽酸鹽）混合。10 min 后，在540 nm 波長下測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲 線（y=0.0165x?0.0226，R2=0.999）計 算 各 組 分NO 的相對釋放量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素實驗和免疫活性試驗分別采用Origin 2021 和GraphPad Prism 8.3.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示；響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)利用Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計及參數(shù)優(yōu)化和統(tǒng)計分析；試驗均重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶添加量配比優(yōu)化

2.1.1 酶添加量對知母多糖得率的影響 纖維素、果膠是植物細(xì)胞壁的主要構(gòu)成物質(zhì)，纖維素酶可以高效地破壞細(xì)胞壁的組織結(jié)構(gòu)，加快知母多糖的溶出[24]；果膠酶更多的是協(xié)同分解果膠為半乳糖醛酸等小分子，破壞知母細(xì)胞壁，分解細(xì)胞壁上的多糖基質(zhì)；木瓜蛋白酶不僅對多糖的提取起輔助作用，還能夠有效酶解與多糖結(jié)合在一起的蛋白質(zhì)，從而將多糖釋放出來，提高多糖得率。纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶添加量對知母多糖提取效果的影響見圖1，不同種類以及不同添加量的酶對知母多糖有明顯的影響，其中，木瓜蛋白酶添加量為8000 U/g 時多糖得率達(dá)到最高，隨著酶濃度的持續(xù)增加，多糖得率逐漸降低；纖維素酶添加量在750~1200 U/g 范圍內(nèi)，多糖得率持續(xù)增加，添加量大于1200 U/g 時多糖得率變化較為平緩；果膠酶添加量在400~1200 U/g 時，多糖得率隨著添加量的增加而增加，繼續(xù)增加后多糖得率略有降低。因此，3 種單一酶的最佳添加量分別為木瓜蛋白酶添加量為8000 U/g，纖維素酶添加量為1200 U/g，果膠酶添加量為1200 U/g。

圖1 酶添加量對知母多糖得率的影響Fig.1 Effect of enzyme addition on the extraction yield ofAnemarrhena asphodeloidesBunge polysaccharide

木瓜蛋白酶、纖維素、果膠酶及復(fù)合酶（木瓜蛋白酶8000 U/g，纖維素酶1200 U/g，果膠酶1200 U/g）分別酶解知母制備知母多糖得率見圖2。實驗結(jié)果表明：3 種酶的復(fù)合酶提取效果最好，知母多糖得率為（9.81%±0.09%），均顯著大于纖維素酶（8.88%±0.10%）、木瓜蛋白酶（5.05%±0.05%）和果膠酶（3.37%±0.11%）（P＜0.05）。從生產(chǎn)效率的角度出發(fā)，選取3 種酶的復(fù)合酶對提取制備知母多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化。

圖2 果膠酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶及復(fù)合酶對知母多糖得率的影響Fig.2 The effect of pectinase, papain, cellulase and compound enzymes added on the extraction yield ofAnemarrhenaasphodeloidesBunge polysaccharide

2.1.2 復(fù)合酶添加量配比對知母多糖得率的影響根據(jù)單因素實驗結(jié)果，對木瓜蛋白酶（A）、纖維素酶（B）和果膠酶（C）3 個因素進(jìn)行正交試驗，以確定最佳酶配比，正交試驗設(shè)計以及結(jié)果見表3。分析可知，影響知母多糖主次因素依次是果膠酶（C）>木瓜蛋白酶（A）>纖維素酶（B）。最佳酶解條件為A3B2C3，因此，確定最佳復(fù)合酶的比例為木瓜蛋白酶16000 U/g，纖維素酶1200 U/g，果膠酶1600 U/g。在此復(fù)合酶比例條件下進(jìn)行驗證試驗，重復(fù)3 次，測得知母多糖得率為（10.19%±0.03%）。

表3 L9（34）正交試驗結(jié)果Table 3 L9(34)orthogonal experiment results

2.2 酶解條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 單因素實驗結(jié)果

2.2.1.1 酶解溫度對知母多糖提取的影響 由圖3可知，多糖的得率在40~55 ℃之間隨溫度的升高而增加，當(dāng)提取溫度為55 ℃時，多糖得率最高，溫度在55~65 ℃時，多糖得率迅速下降。這可能是由于復(fù)合酶在55 ℃時活性最強，分解細(xì)胞壁效果最佳。當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時，酶蛋白開始受熱變性，使得酶活性逐漸降低，導(dǎo)致多糖得率下降[25]。故選擇酶解溫度50~60℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

圖3 酶解溫度對知母多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on the extraction yield ofAnemarrhena asphodeloidesBunge polysaccharide

2.2.1.2 酶解時間對知母多糖提取的影響 時間處理也是提取知母多糖的一個重要因素。文獻(xiàn)研究表明[26]，較長的酶處理時間有利于多糖的產(chǎn)生。由圖4可知，1~2 h 得率隨酶解時間的升高而增加，當(dāng)提取時間持續(xù)增加時，多糖得率有所降低，這可能是由于酶解時間過長，多糖穩(wěn)定性下降，結(jié)構(gòu)部分易被破壞，致使得率降低[27]。故選擇酶解時間1.5~2.5 h 進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

圖4 酶解時間對知母多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on the extraction yield ofAnemarrhena asphodeloidesBunge polysaccharide

2.2.1.3 液料比對知母多糖提取的影響 如圖5 所示，多糖得率最初呈上升趨勢，在15:1 mL/g 時達(dá)到最大值。這可能是因溶劑增多擴大了反應(yīng)體系中知母多糖與復(fù)合酶的接觸面積，隨著液料比的增加，提取液粘度降低，多糖分子更多的被溶出。當(dāng)溶劑用量超過一定范圍時，會使得復(fù)合酶的質(zhì)量濃度明顯降低，進(jìn)而影響到酶的催化效率，這可能是后期隨著溶劑用量不斷增加，知母多糖得率反而降低的原因[28]。故選擇液料比為10:1~20:1 mL/g 進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

圖5 液料比對知母多糖得率的影響Fig.5 Effect of liquid-solid on the extraction yield ofAnemarrhena asphodeloidesBunge polysaccharide

2.2.2 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗結(jié)果 本實驗以多糖酶解時間（A）、液料比（B）、酶解溫度（C）為自變量，以多糖得率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken 試驗設(shè)計原理在三因素三水平上對復(fù)合酶提取知母多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗方案及結(jié)果見表4。

表4 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Experimental design and results

使用軟件進(jìn)行多元回歸擬合，計算回歸系數(shù)，可以得到知母多糖得率對液料比（A）、酶解時間（B）和酶解溫度（C）的多項回歸方程：

Y=10.49?0.29A?0.12B?0.69C+0.09AB?0.22AC+0.38BC?1.41A2?1.84B2?0.58C2

從表5 的模擬方差分析中可知，P=0.001，說明此模型具有顯著性；矢擬項P=0.0550>0.05，表明模型擬合較好，在實際實驗中非正常誤差較??；模型的決定系數(shù)R2=0.95，表明此模型擬合度好，可用于模型分析和預(yù)測各因素對知母多糖得率的影響；變異系數(shù)CV=5.73%，CV 值越大表明該模型的置信度越高[29]。二次項C2對響應(yīng)值多糖得率影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），一次項C、二次項A2、B2對響應(yīng)值多糖得率影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），說明酶解時間、液料比和酶解溫度對響應(yīng)值的影響是非線性的；交互項均為不顯著項，表明交互項對多糖得率影響不明顯。根據(jù)F值，3 個因素對多糖得率影響關(guān)系依次為酶解溫度>液料比>酶解時間。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression models

2.2.2.1 等高線圖和響應(yīng)面圖 三維圖形用于表示變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系及其相互作用，坡度越陡、等高線越密且橢圓程度越高，表明兩因素交互作用對結(jié)果的影響越顯著[30]。通過響應(yīng)面的陡峭程度分析發(fā)現(xiàn)（圖6），3 個因素?zé)o明顯交互作用。

圖6 兩因素交互作用對多糖得率的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of variable parameters on extraction yield of polysaccharide

2.2.2.2 模型準(zhǔn)確性分析 試驗數(shù)據(jù)的殘差和響應(yīng)設(shè)計如圖7 所示，圖7（A）顯示不同水平知母多糖響應(yīng)值的殘差正態(tài)分布曲線圖，17 組響應(yīng)值較為合理分布于一條直線兩側(cè)，無明顯偏差，表明模型擬合效果較好。如圖7（B）所示，實驗值與預(yù)測值相關(guān)性較高，表明本試驗建立的模型成功地加強了三個變量與響應(yīng)值的聯(lián)系。通過建模擬合，對內(nèi)部學(xué)生化殘差與17 組試驗運行數(shù)據(jù)進(jìn)行分析如圖7（C），結(jié)果分析，所有數(shù)據(jù)在-3~3 之間，表明試驗數(shù)據(jù)模型中沒有有效誤差存在。通過以上回歸診斷分析，說明本實驗建立的復(fù)合酶法提取知母多糖工藝模型準(zhǔn)確性較高，可用于知母多糖的提取制備。

圖7 Box-Behnken 模型準(zhǔn)確性診斷圖Fig.7 Diagnostic plots for the Box-Behnken model accuracy

2.2.2.3 模型驗證 通過Design-Expert 8.0.6 軟件分析，得到知母多糖提取的最佳工藝為酶解時間1.95 h，液料比14.72:1 mL/g，酶解溫度51.92 ℃，在此條件下知母多糖預(yù)測得率為10.71%?？紤]到實際操作的便利，最優(yōu)工藝修正為酶解時間2 h，液料比15:1 mL/g，酶解溫度52 ℃，進(jìn)行3 次驗證，知母多糖的得率為（10.58%±0.03%），驗證實驗結(jié)果與預(yù)測值的誤差為1.12%，說明此模型與試驗擬合度較好，對復(fù)合酶提取知母多糖的工藝優(yōu)化合理、有效。

2.3 知母粗多糖的分離純化

知母粗多糖依次用蒸餾水、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、0.8 mol/L NaCl 洗脫后，制圖獲得4 個形態(tài)具有差異的峰，分別收集在蒸餾水、0.05、0.1、0.2 mol/L NaCl 4 處峰內(nèi)溶液，根據(jù)峰合并相應(yīng)管內(nèi)的樣液（圖8），蒸發(fā)濃縮、透析，冷凍干燥得4 種多糖組分，得率分別為56.8%、2.20%、3.92%和2.45%，多糖含量分別88.2%、70.4%、72.9%、80.6%，命名為APSE-0、APSE-1、APSE-2 和APSE-3。

圖8 DEAE-52 纖維素柱洗脫曲線Fig.8 DEAE-52 cellulose column elution curve

2.4 知母多糖對RAW 264.7 巨噬細(xì)胞的免疫活性的影響

2.4.1 細(xì)胞增殖實驗 巨噬細(xì)胞在先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用，活化的巨噬細(xì)胞可以吞噬病原微生物，處理和呈遞抗原，同時合成和分泌趨勢化因子和細(xì)胞因子，以增強機體的免疫防御能力[20]。如圖9 所示，與對照組相比，在100~500 μg/mL 濃度內(nèi)，APSE-0（A）高度顯著促進(jìn)RAW264.7 巨噬細(xì)胞增殖（P＜0.01）；在1~100 μg/mL 濃度內(nèi)，APSE-1（B）和APSE-2（C）極顯著促進(jìn)RAW264.7 巨噬細(xì)胞增殖（P＜0.001）。APSE-3（D）在1 μg/mL 濃度下，增殖率最高為（123.05%±6.05%）（P＜0.001）；與對照組相比，APSE-3 在100、250 和500 μg/mL 下極顯著抑制細(xì)胞增殖（P＜0.001）。因此，對于APSE-3 僅選擇濃度為1、10 和50 μg/mL 進(jìn)行后續(xù)NO 釋放量的檢測。

圖9 不同濃度的APSE-0、APSE-1、APSE-2 和APSE-3 對RAW 264.7 巨噬細(xì)胞存活率的影響Fig.9 Effect of different components of APSE-0、APSE-1、APSE-2 and APSE-3 on the cell viability of RAW 264.7 cells注：與空白對照組相比，顯著*P＜0.05；高度顯著**P＜0.01；極顯著***P＜0.001；ns 無顯著差異P>0,05；圖10 同。

2.4.2 NO 釋放量 NO 是巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答中分泌的炎性介質(zhì)，具有抵抗病原體入侵和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等多種生理功能[31]。在評估多糖的免疫刺激活性時，NO 釋放的增加通常作為巨噬細(xì)胞活化水平的指標(biāo)[32]。如圖10 所示，APSE-1 與對照組相比基本無顯著的差異，表明APSE-1 不能誘導(dǎo)NO 釋放（P>0.05）；與對照組相比，在實驗濃度內(nèi)，APSE-0（A）、APSE-2（C）和APSE-3（D）均極顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞NO 的釋放（P＜0.001）。APSE-2、APSE-3 所有濃度對RAW264.7 巨噬細(xì)胞都有很強的刺激作用。與對照組對比，APSE-2 處理組以濃度依賴性方式極顯著誘導(dǎo)NO 釋放（P＜0.001），其中，高劑量組（500 μg/mL）NO 分泌量為（14.94±0.06）μg/mL，基本與LPS 組（15.49±0.32）相當(dāng)。結(jié)果表明：APSE-0、APSE-2 和APSE-3 可以刺激RAW264.7 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO。NO 是成熟單核細(xì)胞極化為M1 型巨噬細(xì)胞后分泌的主要細(xì)胞因子或信號分子，M1 型巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生活性氮或活性氧，發(fā)揮機體免疫調(diào)節(jié)[33]。由此可見，APSE-0、APSE-2 和APSE-3 可能是通過提高巨噬細(xì)胞對NO 的合成，促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞的成熟，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫能力，這與CAO 等[8]的研究結(jié)果一致。而ZHANG 等[9]分離得到的知母多糖AAP70-1不能誘導(dǎo)NO 的產(chǎn)生，而是通過促進(jìn)細(xì)胞免疫因子IL-6、IL-1β和TNF-α的釋放，從而增強巨噬細(xì)胞免疫功能。而復(fù)合酶提取知母多糖能否通過調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫因子水平而發(fā)揮免疫活性作用，有待進(jìn)一步研究。

圖10 不同濃度的APSE-0、APSE-1、APSE-2、APSE-3 對RAW 264.7 巨噬細(xì)胞分泌NO 的影響Fig.10 Effects of different components of APSE-0、APSE-1、APSE-2 and APSE-3 on nitric oxide (NO) release of RAW 264.7 cells

3 結(jié)論

本研究通過正交試驗確定復(fù)合酶配比為木瓜蛋白酶16000 U/g、纖維素酶1200 U/g、果膠酶1600 U/g。采用響應(yīng)面Box-Behnken 法優(yōu)化復(fù)合酶提取知母多糖最佳工藝為酶解時間2 h，液料比15:1 mL/g，酶解溫度52 ℃，在此條件下得率為（10.58%±0.03%）。本實驗所采用的復(fù)合酶法提取知母多糖工藝具有總操作時間短、條件溫和、耗能低等優(yōu)點，可用于知母多糖的實際生產(chǎn)中。

體外免疫實驗證明4 種知母多糖組分均能促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且APSE-0、APSE-2 和APSE-3 均能極顯著誘導(dǎo)NO 的釋放，表明APSE-0、APSE-2 和APSE-3 對RAW264.7 細(xì)胞的有較好的增強免疫活性。其中，APSE-2 對RAW264.7 細(xì)胞的免疫效果最好，可作為潛在的功能性食品或作為免疫力低下人群的膳食補充劑。研究表明不同提取方法可能對多糖的結(jié)構(gòu)和免疫活性有顯著的影響[34?35]，本文初步證實復(fù)合酶提法所得知母多糖對RAW264.7 細(xì)胞有較好的增強免疫活性，后續(xù)將對不同提取方法所得知母多糖的結(jié)構(gòu)特征、免疫活性及其作用機制做進(jìn)一步研究。