酸橙內(nèi)生菌Bacillus thuringiensisBt028 幾丁質(zhì)酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)

徐勤茜，朱國(guó)威，趙梓伶，陶雪婷，李子院,2，郝再彬,2，李海云,2,

（1.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西桂林 541004；2.廣西高校食品安全與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541004）

幾丁質(zhì)是由N-乙酰-D-葡萄糖胺組成的直鏈多聚物[1?3]，在自然界中含量?jī)H次于纖維素[4?5]。由于幾丁質(zhì)與天然物機(jī)體細(xì)胞有良好的生物兼容性[6?8]，因此廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、生物工程、農(nóng)業(yè)等方面[9?11]，但由于自然狀態(tài)下幾丁質(zhì)多以晶體狀態(tài)存在，不溶于水且不易降解，這極大地限制了幾丁質(zhì)的應(yīng)用。目前降解幾丁質(zhì)的方法主要有化學(xué)法、物理法和酶解法[12]。然而化學(xué)法反應(yīng)條件比較嚴(yán)苛，且反應(yīng)產(chǎn)物不均一，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重；物理法由于生產(chǎn)成本比較高，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)；酶解法與物理法和化學(xué)法相比，有降解反應(yīng)專(zhuān)一性強(qiáng)，不產(chǎn)生環(huán)境污染，可控制聚合度而且副反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，是目前最環(huán)保高效的降解幾丁質(zhì)方法[13?15]。幾丁質(zhì)酶（EC3.2.1.14）可以特異性催化幾丁質(zhì)降解，得到N-乙酰氨基葡萄糖和聚合度為2~10 的幾丁寡糖，研究表明這些產(chǎn)物對(duì)人體的生態(tài)調(diào)節(jié)功能具有較好的改善提高作用[16?18]。

近年來(lái)，幾丁質(zhì)酶由于在制備幾丁寡糖、食品保鮮等方面具有巨大的應(yīng)用潛力而備受關(guān)注[19]。微生物來(lái)源的幾丁質(zhì)酶由于生產(chǎn)速度快、產(chǎn)量高且性能穩(wěn)定，目前已成為幾丁質(zhì)酶的主要來(lái)源[20?21]。幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)特性是其應(yīng)用的基礎(chǔ)，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)微生物來(lái)源幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了大量研究，如Du 等[22]從一株分離自土壤樣品的細(xì)菌Paenibacillussp 發(fā)酵液中純化得到一種分子量為30 kDa 的幾丁質(zhì)酶，其最佳pH 為4.5，最佳溫度為50 ℃；Guo 等[23]對(duì)Paenibacillus pasadenensisCS0611 胞外幾丁質(zhì)酶進(jìn)行純化，測(cè)定幾丁質(zhì)酶分子量為69 kDa，最適pH 和最適溫度分別為5.0 和50 ℃；蘇明慧等[24]從安徽西瓜種植地根際土壤分離所到一株短短芽孢桿菌FM4B，對(duì)其發(fā)酵液中的幾丁質(zhì)酶進(jìn)行分離純化，獲得分子質(zhì)量為66 kDa 幾丁質(zhì)酶純品，且酶活力在pH5.0~9.0 穩(wěn)定；劉蒲臨等[25]將土壤中分離出的側(cè)孢短芽孢桿菌CDY64 幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)于大腸桿菌BL21 中，純化后的幾丁質(zhì)酶最適反應(yīng)溫度為60 ℃，在pH6.0~8.0 范圍內(nèi)均表現(xiàn)出良好的活性?？梢?jiàn)，不同微生物來(lái)源的幾丁質(zhì)酶的性質(zhì)可能不同。目前尚未見(jiàn)有酸橙內(nèi)生菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)研究。

本研究以前期篩選獲得的一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性較高的酸橙內(nèi)生菌Bacillus thuringiensisBt028 為研究對(duì)象，對(duì)其發(fā)酵液中的幾丁質(zhì)酶進(jìn)行分離純化，并對(duì)該幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為該酶的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為不同生物來(lái)源的幾丁質(zhì)酶系的性質(zhì)和功能的比較研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸橙 采自桂林永福蘇橋鎮(zhèn)，新鮮酸橙果實(shí)；酸橙內(nèi)生菌Bacillus thuringiensisBt028 分離自酸橙果實(shí)，保存于桂林理工大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室；幾丁質(zhì)、3，5-二硝基水楊酸、β-D-N-乙酰氨基葡萄糖 分析純，購(gòu)于上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；硫酸鎂、硫酸亞鐵 分析純，購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑廠；蛋白胨、酵母粉、瓊脂磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸銨、Tris 分析純，購(gòu)于西隴化工股份有限公司；低分子量蛋白質(zhì)Marker PR1400、葡聚糖凝膠G-100 北京索萊寶科技有限公司；活化培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉5 g/L、瓊脂15 g/L；幾丁質(zhì)酶發(fā)酵培養(yǎng)基 膠體幾丁質(zhì)10 g/L、酵母粉10 g/L、K2HPO40.7 g/L、KH2PO40.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7 H2O 0.01 g/L，pH7.0。

LRH-150-Z 振蕩培養(yǎng)箱 珠江留關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；BX30R 立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；CJ-ISFS 醫(yī)療設(shè)備超工作臺(tái) 天津市泰斯特儀器有限公司；VIS-7220N 可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器有限公司；HH-S2 數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；ZXRD-B5110 鼓風(fēng)干燥箱 上海智城分析儀器制造有限公司；Bio-Rad電泳儀、小型垂直電泳槽 上海孚約商貿(mào)有限公司；BSZ-160 自動(dòng)部分收集器、HL-2B 恒流泵 上海青浦滬西儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 幾丁質(zhì)酶的分離純化

1.2.1.1 幾丁質(zhì)酶粗酶液的制備 參考文獻(xiàn)[24]的方法并加以改進(jìn)，將斜面保存的Bacillus thuringiensisBt028 經(jīng)平板培養(yǎng)活化24 h 后，挑取一環(huán)接入100 mL幾丁質(zhì)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中（250 mL 三角瓶），在溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min 的搖床上振蕩培養(yǎng)24 h，即為種子液。將種子液按照3%的接種量接入到裝有100 mL pH7.0 的幾丁質(zhì)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，在溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min 的搖床上振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液在4 ℃、12000 r/min 條件下離心10 min，收集上清液即為粗酶液，4 ℃冰箱儲(chǔ)存。

1.2.1.2 硫酸銨鹽析 參考劉美艷等[26]的方法并略作修改：分別取10 mL 粗酶液8 份置于燒杯中，加入固體（NH4）2SO4調(diào)節(jié)使各燒杯中酶液的（NH4）2SO4飽和度分別為0%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，4 ℃下靜置過(guò)夜后，10000 r/min 離心，測(cè)定上清液中總蛋白含量及幾丁質(zhì)酶活力，并繪制（NH4）2SO4鹽析曲線。根據(jù)（NH4）2SO4鹽析曲線確定菌株Bt028 幾丁質(zhì)酶的分級(jí)沉淀?xiàng)l件后，對(duì)菌株Bt028 發(fā)酵液進(jìn)行（NH4）2SO4鹽析。鹽析后的沉淀加入適量50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）緩沖液溶解后裝入透析袋內(nèi)，4 ℃下用50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）緩沖液透析除鹽。

1.2.1.3 葡聚糖凝膠Sephadex G-100 層析 在室溫下，將葡聚糖凝膠干粉浸泡于蒸餾水中充分溶脹后裝柱（1 cm×70 cm），并用50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5，含有0.2 mol/L NaCl）緩沖液平衡后，取1.0 mL 經(jīng)透析除鹽的酶液，上樣于層析柱，用相同的緩沖液洗脫，流速為8 mL/h，分管收集洗脫液，每管收集3.5 mL，檢測(cè)并收集有酶活性的洗脫峰。

1.2.1.4 幾丁質(zhì)酶純度和分子量測(cè)定 參考陳茜文等[11]方法用聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定純化前后幾丁質(zhì)酶純度及相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.2 菌株Bt028 幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)

1.2.2.1 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性 分別選取30、40、50、60、70、80 ℃作為酶催化反應(yīng)溫度，測(cè)其酶活，以確定菌株Bt028 幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度。將菌株Bt028 幾丁質(zhì)酶酶液置于35、40、45、50、55、60、65、70 ℃水浴中保溫不同時(shí)間后，取樣測(cè)定酶液的剩余酶活力，考察酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.2.2 最適pH 及pH 穩(wěn)定性 在最適反應(yīng)溫度條件下測(cè)定幾丁質(zhì)酶pH 為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 時(shí)酶活力，確定菌株Bt028 幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)pH。將幾丁質(zhì)酶液pH 調(diào)為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在30 ℃下放置0、1、2、3、4、5、6 h，測(cè)定酶液的剩余酶活力，考察pH 對(duì)菌株Bt028 幾丁質(zhì)酶穩(wěn)定性的影響。

1.2.2.3 金屬離子的影響 在30 ℃條件下，向底物膠體幾丁質(zhì)溶液中分別加入1 mmol/mL 不同的金屬離子如Mg2+（MgSO4·7H2O）、Fe3+（FeCl3·6H2O）、Cu2+（CuSO4·5H2O）等，與酶液混合后反應(yīng)測(cè)定幾丁質(zhì)酶酶活力，以不加金屬離子為對(duì)照，考察不同金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶酶活力的影響。

1.2.2.4 有機(jī)溶劑對(duì)幾丁質(zhì)酶活的影響 選擇甲醇、乙醇、正丙醇、甲醛、丙酮、二甲亞砜為效應(yīng)物，在底物膠體幾丁質(zhì)溶液中加入0%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%、22.5%、25%的效應(yīng)物，調(diào)pH 為6.5，在60 ℃條件下測(cè)定酶的相對(duì)活力，分析研究效應(yīng)物對(duì)Bt028 幾丁質(zhì)酶活力的影響。

1.2.2.5 酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定 分別取含0.2%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%膠體幾丁質(zhì)的磷酸緩沖液與pH 為6.5 幾丁質(zhì)酶液在60 ℃條件下反應(yīng)，根據(jù)底物濃度對(duì)酶催化反應(yīng)速率的影響，采用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法構(gòu)建動(dòng)力學(xué)模型，計(jì)算菌株Bt028 幾丁質(zhì)酶催化膠體幾丁質(zhì)水解的米氏常數(shù)Km、最大速度Vmax 以及轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat。

1.2.3 幾丁質(zhì)酶酶活的測(cè)定 參考戴德慧等方法[27]略作修改：取0.5 mL 粗酶液與0.5 mL 含1.0%膠體幾丁質(zhì)的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH7.0）混合，50 ℃保溫20 min 后，沸水浴10 min，流水冷卻。加入1.0 mL DNS 試劑，沸水浴5 min，流水冷卻后用蒸餾水稀釋至10 mL，12000 r/min 離心5 min，取上清液測(cè)定波長(zhǎng)540 nm 處吸光度（以不含膠體幾丁質(zhì)的磷酸緩沖液為參照）。根據(jù)A540nm在β-D-N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得還原糖的釋放量并計(jì)算酶活力。以每分鐘催化幾丁質(zhì)生成相當(dāng)于l μmolβ-D-N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位。相對(duì)酶活（%）=（實(shí)驗(yàn)組酶活/空白組酶活）×100。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 參考聶昌宏[28]方法，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。相對(duì)蛋白質(zhì)含量（%）=（實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)含量/空白組蛋白質(zhì)含量）×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)三次，采用SPSS 軟件分析數(shù)據(jù)的顯著性，利用Origin 以及Excel 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析并進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾丁質(zhì)酶的分離純化

2.1.1 硫酸銨鹽析 蘇云金芽孢桿菌Bt028 發(fā)酵液經(jīng)過(guò)離心后，取上清液進(jìn)行（NH4）2SO4分級(jí)鹽析，鹽析后的上清液中蛋白質(zhì)濃度和幾丁質(zhì)酶活隨（NH4）2SO4飽和度的變化情況如圖1 所示。由圖1可見(jiàn)，上清液中的幾丁質(zhì)酶活力和總蛋白含量均隨（NH4）2SO4飽和度的增加而降低；當(dāng)（NH4）2SO4飽和度低于20%時(shí)，總蛋白含量下降的趨勢(shì)快于幾丁質(zhì)酶活力下降趨勢(shì)，表明雜蛋白鹽析的速度比幾丁質(zhì)酶快；當(dāng)（NH4）2SO4飽和度大于20%后，上清液中酶活迅速降低，說(shuō)明此時(shí)幾丁質(zhì)酶不斷被沉淀出來(lái)；當(dāng)（NH4）2SO4飽和度達(dá)到70%時(shí)，上清液中幾乎檢測(cè)不到幾丁質(zhì)酶活，說(shuō)明（NH4）2SO4飽和度達(dá)到70%時(shí)幾丁質(zhì)酶已基本沉淀完全。據(jù)上綜合考慮，確定硫酸銨鹽析方案為：20%飽和度的（NH4）2SO4鹽析除雜、70%飽和度的（NH4）2SO4沉淀幾丁質(zhì)酶。當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時(shí)，會(huì)導(dǎo)致水活度降低，進(jìn)而使蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，使蛋白質(zhì)相互結(jié)合聚集形成沉淀析出[29]。本研究所確定的沉淀區(qū)間獲得的酶回收率為61.24%，比郭金玲等[30]以35%~80%硫酸銨飽和區(qū)段對(duì)黑曲霉Aspergillus niger粗酶液進(jìn)行沉淀，酶的回收率為47.26%更高。

圖1 硫酸銨鹽析曲線Fig.1 Salting out curve of ammonium sulfate

2.1.2 Sephadex G-100 葡聚糖凝膠層析 經(jīng)硫酸銨沉淀后的酶液采用Sephadex G-100 凝膠層析，洗脫曲線見(jiàn)圖2。

圖2 Sephadex G-100 葡聚糖凝膠層析洗脫曲線Fig.2 Elution curve of Sephadex G-100 Dextran gel chromatography

圖2 顯示，樣品通過(guò)凝膠層析，共獲得4 個(gè)蛋白峰，其中峰I 具有最高的幾丁質(zhì)酶活力，收集該峰濃縮濃縮后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。

2.1.3 幾丁質(zhì)酶純化結(jié)果分析和純度鑒定 Bt028所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的純化結(jié)果總結(jié)于表1。從表1 可以看出，蘇云金芽孢桿菌Bt028 發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶經(jīng)硫酸銨鹽析和葡聚糖G-100 凝膠層析后，所獲幾丁質(zhì)酶的比活力達(dá)681.78 U/mg，純化倍數(shù)3.21 倍，酶回收率為15.52%。目前已有諸多關(guān)于不同來(lái)源幾丁質(zhì)酶的分離純化報(bào)道，如高兆建等[31]通過(guò)硫酸銨沉淀、DEAE-Cellulose A52 離子交換層析和Sephadex G-100 凝膠過(guò)濾層析純化得到均一的Chi-Pc76，最終純化倍數(shù)為17.1 倍，回收率21.6%；Farag 等[32]對(duì)海洋來(lái)源土曲霉培養(yǎng)液中的幾丁質(zhì)酶通過(guò)硫酸銨沉淀、Sephadex G-100 凝膠過(guò)濾層析以及離子交換色譜進(jìn)行分離純化，純化倍數(shù)5.16，回收率為12%。本文通過(guò)硫酸銨鹽析及Sephadex G-100 凝膠層析即可獲得純度較高的幾丁質(zhì)酶，說(shuō)明本文所采用的Bt028菌株產(chǎn)生的雜蛋白較少，在幾丁質(zhì)酶合成中具有較好的應(yīng)用潛力。

表1 蘇云金芽孢桿菌Bt028 幾丁質(zhì)酶的純化結(jié)果Table 1 Purification results of chitinase produced byBacillusthuringiensisBt028

幾丁質(zhì)酶純化樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳譜圖見(jiàn)圖3。由條帶3 可以看出純化后得到單一蛋白條帶，其相對(duì)分子質(zhì)量約為65 kDa。不同微生物來(lái)源的幾丁質(zhì)酶的分子量差異較大，一般在10~110 kDa之間，如大部分細(xì)菌所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的分子量在60~110 kDa 之間，放線菌的一般不高于30 kDa，而真菌所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的則高于30 kDa[33]。不同來(lái)源的蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶相對(duì)分子量之間也存在較大差異，如劉佳等[34]從Bt HD-73 菌株中克隆、重組的幾丁質(zhì)酶Chi73 分子量為77 kDa。

圖3 菌株Bt028 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE of chitinase fromBacillus thuringiensisBt028注：Marker：標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1：粗酶液；2：20%~70%硫酸銨鹽析酶液；3：葡聚糖凝膠G100 層析酶液。

2.2 幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性 在不同溫度下測(cè)定菌株Bt028 幾丁質(zhì)酶的酶活，結(jié)果如圖4 所示。結(jié)果表明：在60 ℃時(shí)酶活顯著提高（P＜0.05），故該幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，比丁志雯等[35]從Dyadobactersp. CZW019 中得到的幾丁質(zhì)酶反應(yīng)最佳溫度（35 ℃）高。幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性結(jié)果如圖5 所示，在溫度低于60 ℃范圍內(nèi)酶的熱穩(wěn)定性良好，超過(guò)60 ℃后隨著保溫時(shí)間的增加，酶活力迅速下降，熱穩(wěn)定性變差。

圖4 幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度Fig.4 Optimum reaction temperature of chitinase注：不同小寫(xiě)字母代表差異顯著（P＜0.05）；圖6、圖8 同。

圖5 幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermal stability of chitinase

2.2.2 幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)pH 和pH 穩(wěn)定性 pH能顯著影響酶反應(yīng)速率，由圖6 可以看出，當(dāng)pH 為6.5 時(shí)酶活顯著提高（P＜0.05），說(shuō)明蘇云金芽孢桿菌Bt028 最適反應(yīng)pH 為6.5。當(dāng)pH 高于或者低于6.5時(shí)，酶活迅速降低。pH 對(duì)酶活性的影響并不是因?yàn)樽饔糜谡麄€(gè)酶分子，從而影響酶分子的解離狀態(tài)，而是由于酶的活性中心或與之有關(guān)的基團(tuán)的解離狀態(tài)被改變，從而使酶的活性狀態(tài)發(fā)生改變，因此過(guò)酸和過(guò)堿都會(huì)大大降低酶的活性。菌株Bt028 幾丁質(zhì)酶的最適pH 與來(lái)源于其它芽孢桿菌的幾丁質(zhì)酶最適pH 高，如來(lái)源于短短芽孢桿菌的幾丁質(zhì)酶最適pH為6.0[24]，但明顯比蘇云金芽孢桿菌來(lái)源的幾丁質(zhì)酶的最適pH 為7.0 低[34]，說(shuō)明兩者性質(zhì)存在差別，并不是同一種幾丁質(zhì)酶。幾丁質(zhì)酶的pH 穩(wěn)定性結(jié)果如圖7 所示，在pH 5.5~7.5 范圍內(nèi)，該幾丁質(zhì)酶穩(wěn)定性較好，當(dāng)pH 低于5.5 或高于7.5 后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)酶活逐漸降低；當(dāng)pH 為6.5 時(shí)其穩(wěn)定性最好，處理6 h 后相對(duì)酶活力仍在90%以上。

圖6 幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)pH Fig.6 Optimum reaction pH of chitinase

圖7 幾丁質(zhì)酶的pH 穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of chitinase

2.2.3 金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶活性的影響 從圖8 可以看出，與空白相比，Co2+、Mg2+、Ca2+、Hg2+這四種金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶有一定程度的抑制作用，但酶仍具有一定的活性，其中Mg2+的抑制作用最為明顯；Fe3+和Cu2+使酶活力顯著提升（P＜0.05）。金屬離子能夠與酶形成絡(luò)合物，從而維持或破壞其三維結(jié)構(gòu)和構(gòu)型，在生物催化中起重要作用[31]。張瑤心等[36]對(duì)無(wú)色桿菌ZWW8 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Cu2+和Zn2+對(duì)酶活有抑制作用，Hg2+可導(dǎo)致幾丁質(zhì)酶完全失活，說(shuō)明不同來(lái)源幾丁質(zhì)酶性質(zhì)不一定相同。

圖8 金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶活的影響Fig.8 Effect of metal ions on chitinase activity

2.2.4 有機(jī)溶劑對(duì)幾丁質(zhì)酶活的影響 不同有機(jī)溶劑對(duì)幾丁質(zhì)酶活的影響如圖9 所示，甲醇、乙醇、正丙醇和二甲亞砜對(duì)幾丁質(zhì)酶的作用效果為先激活后抑制，當(dāng)甲醇、乙醇和正丙醇的濃度為5.0%，二甲亞砜濃度為2.5%時(shí)，酶活力達(dá)到最高，隨著這幾種有機(jī)物含量的繼續(xù)提高，酶活力下降。當(dāng)正丙醇濃度為25.0%時(shí)，可以使酶活力降低23.9%。故正丙醇對(duì)酶的失活作用比甲醇和乙醇強(qiáng)。而丙酮濃度越高，對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的激活作用越強(qiáng)，在丙酮濃度為0%~10.0%之間，酶活力持續(xù)上升，當(dāng)濃度超過(guò)10.0%，酶活力趨于穩(wěn)定25.0%。隨著甲醛濃度的增大，酶的活力呈直線下降，25.0%的甲醛抑制酶活力58.2%。

圖9 有機(jī)溶劑對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響Fig.9 Effect of different organic solvents on the activity of chitinase

2.2.5 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定 菌株Bt028幾丁質(zhì)酶催化膠體幾丁質(zhì)水解反應(yīng)的Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)圖如圖10 所示，得到的直線回歸方程為：y=0.271x+0.009（R2=0.99807），根據(jù)該直線在x 軸和y 軸上的截距計(jì)算出在pH 為6.5、60 ℃的酶活測(cè)定體系中，菌株Bt028 幾丁質(zhì)酶對(duì)膠體幾丁質(zhì)的米氏常數(shù)Km 為29.533 mg/mL，最大反應(yīng)速率Vmax=108.696 μmol/（L·min），酶的轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat=0.527/min。

圖10 幾丁質(zhì)酶催化動(dòng)力學(xué)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)圖Fig.10 Lineweaver-Burk double reciprocal diagram of chitinase catalytic kinetics

3 結(jié)論

當(dāng)前主要通過(guò)微生物發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)酶制劑，這種方式生產(chǎn)周期短、且不易受外部因素的影響，但由于粗酶活力不高，導(dǎo)致大批工業(yè)用酶制劑的規(guī)?；瘧?yīng)用受到限制。因此，通過(guò)對(duì)粗酶液純化可以提升酶制劑產(chǎn)品質(zhì)量。本文對(duì)蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensisBt028 所產(chǎn)幾丁質(zhì)粗酶液采用20%~70%硫酸銨分段鹽析，純化倍數(shù)為1.16，回收率為61.24%；經(jīng)Sephadex G-150 葡聚糖凝膠柱層析后，得到了4 個(gè)洗脫峰，其中組分峰Ⅰ具有最高的幾丁質(zhì)酶酶活力，比活力可達(dá)681.78 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)3.21 倍。通過(guò)SDS-PAGE 電泳測(cè)定純品酶分子質(zhì)量為65 kDa，與Azizoglu 等[37]已報(bào)道純化的蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生的條帶分別為39.71、41.39、91.66 和110~113 kDa 相比較差異較大。此外，本文對(duì)Bacillus thuringiensisBt028 所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)也進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示該酶最適反應(yīng)溫度為60 ℃，在65 ℃以下保溫6 h 后酶活力剩余84.37%，在70 ℃保溫6 h 是酶活力剩余67.40%，表明該酶的熱穩(wěn)定性較好。該幾丁質(zhì)酶的最適pH 為6.5，Co2+、Mg2+、Ca2+、Hg2+等金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶有一定程度的抑制作用，F(xiàn)e3+和Cu2+對(duì)酶有促進(jìn)作用。低濃度的甲醇、乙醇、正丙醇和二甲亞砜使酶的活性增加，當(dāng)有機(jī)溶劑濃度提升到一定程度時(shí)，酶的活性受到抑制，與邱君志[38]對(duì)幾丁質(zhì)酶的研究結(jié)果相似。丙酮對(duì)幾丁質(zhì)酶有激活作用，而甲醛對(duì)幾丁質(zhì)酶有抑制作用。通過(guò)酶動(dòng)力學(xué)分析可知，以膠體幾丁質(zhì)為底物時(shí)，該酶催化反應(yīng)的米氏常數(shù)Km 為29.533 mg/mL，最大反應(yīng)速率Vmax=108.696 μmoL/（L·min），酶的轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat = 0.527/min。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)研究表明幾丁質(zhì)酶具有較好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。由此可見(jiàn)對(duì)粗酶液進(jìn)行純化可大幅提高幾丁質(zhì)酶穩(wěn)定性，這對(duì)于提高工業(yè)生產(chǎn)中幾丁質(zhì)酶的作用效率具有非常積極的意義，本研究采用的均為傳統(tǒng)的純化方法，但純化后總酶活損失較大，這不利于提高幾丁質(zhì)酶制劑生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益，因此后續(xù)研究中有必要改進(jìn)純化方法，以提升酶的回收率。