人參提取物脅迫培養(yǎng)對(duì)副干酪乳桿菌JLUs66 菌株生長(zhǎng)特性及耐受性的影響

董舒月，朱梓燚，楊 濤，冀瑤瑤，刁夢(mèng)雪，葉海青，張鐵華

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062）

乳酸菌在提升發(fā)酵食品的風(fēng)味、改善機(jī)體胃腸道生態(tài)環(huán)境、提高宿主免疫力等方面具有顯著的功效[1?3]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、藥品、飼料等領(lǐng)域[4?5]。人參作為百草之王，其抗腫瘤、抗氧化、降血糖等作用已被充分挖掘，尤其在提高人體抗應(yīng)激能力方面具有重要的調(diào)節(jié)作用[6?9]。乳酸菌存在著保藏周期短、環(huán)境耐受性不強(qiáng)等缺點(diǎn)，限制了應(yīng)用效果和應(yīng)用范圍，因此，提高乳酸菌環(huán)境耐受性成為了當(dāng)下的研究熱點(diǎn)，特別是低溫、高溫、低pH、高膽鹽及高鹽條件對(duì)乳酸菌存活率的影響。前期研究表明，人參提取物在酸奶發(fā)酵過程中對(duì)乳酸菌的發(fā)酵特性存在一定的影響[10]，但人參提取物對(duì)乳酸菌的生存能力及抗應(yīng)激性的影響并未有研究報(bào)道。

乳酸菌在其生長(zhǎng)環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，細(xì)胞本身會(huì)通過多種適應(yīng)機(jī)制對(duì)脅迫信號(hào)做出反應(yīng)，如胞外多糖合成量的改變、多種脅迫相關(guān)基因的表達(dá)[11]，從而發(fā)生一定的應(yīng)激能力，保護(hù)細(xì)胞免受外界環(huán)境的刺激[12]，而產(chǎn)生的這種應(yīng)激能力又影響著乳酸菌對(duì)其他不良環(huán)境的抵抗能力，出現(xiàn)交叉保護(hù)的現(xiàn)象[13]。通過利用乳酸菌的交叉保護(hù)現(xiàn)象，可以影響其菌株生長(zhǎng)特性及環(huán)境耐受性等生存能力。

副干酪乳桿菌JLUs66 具有顯著的降膽固醇功能[14]，良好的菌株特性及環(huán)境耐受性是其發(fā)揮活性的重要前提。本研究以副干酪乳桿菌JLUs66 為研究對(duì)象，考察了在培養(yǎng)基中添加不同濃度的人參提取物脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66 的生長(zhǎng)曲線、活菌數(shù)、產(chǎn)酸能力、產(chǎn)胞外多糖能力及其低溫耐受性、高溫耐受性、低pH 耐受性、膽鹽耐受性和NaCl 耐受性，探究了在培養(yǎng)基中添加不同濃度的人參提取物對(duì)脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66 的菌株生長(zhǎng)特性及耐受性的影響。本研究闡述了人參提取物對(duì)乳酸菌環(huán)境適應(yīng)性的變化規(guī)律，為提高乳酸菌菌株耐受性提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副干酪乳桿菌JLUs66 吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏；人參提取物（人參多糖含量51%，人參皂苷含量40%） 人參研究院；MRS 肉湯培養(yǎng)基、瓊脂 青島海博生物技術(shù)有限公司；脫脂乳粉 新西蘭恒天然乳業(yè)集團(tuán)；胃蛋白酶（豬胃黏膜）3000 U/g，上海源葉生物科技有限公司；鹽酸、牛膽鹽、氯化鈉 分析純，南京建成科技有限公司。

BSD-25 恒溫培養(yǎng)箱 常州杰博森儀器公司；MDF-382E（N）超低溫冰箱 日本三洋公司；BSC-1000IIA2 生物安全柜 蘇凈科學(xué)器材公司；AvantiJE 離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；Bio-Rad Universal Hood II 凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad 公司；SlgP033RB 0.22 μm/0.45 μm 過濾器 美國(guó)Millipore公司；pHS-3C pH 計(jì) 上海精密科學(xué)儀器公司；BioTek Synergy HT 多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 添加人參提取物培養(yǎng)基的制備 將人參提取物按2%（w/v）的比例溶于水，用0.45 μm 濾膜過濾，得到人參提取物母液。將母液按一定比例添加到脫脂乳培養(yǎng)基中，配制得到終濃度（w/v）分別為0‰、1‰、3‰、5‰、8‰和10‰的脫脂乳-人參提取物培養(yǎng)基。

1.2.2 菌株的處理 用脫脂乳培養(yǎng)基活化副干酪乳桿菌JLUs66，以2%的接種量在37 ℃下培養(yǎng)12 h，活化3 次以備實(shí)驗(yàn)使用。將活化好的副干酪乳桿菌JLUs66 以2%的接種量分別接種于不同濃度的脫脂乳-人參提取物培養(yǎng)基中，37 ℃連續(xù)培養(yǎng)3 代，每次培養(yǎng)12 h，得到處理后的副干酪乳桿菌菌株，分別記為JLUs66-0、JLUs66-1、JLUs66-3、JLUs66-5、JLUs66-8 和JLUs66-10。將處理后的菌株在4 ℃，8000×g 的條件下離心10 min，棄上清，用0.9%的生理鹽水洗滌沉淀，離心后得到菌泥。

1.2.3 菌株生長(zhǎng)特性

1.2.3.1 菌株的生長(zhǎng)曲線 將1.2.2 中得到的菌泥重懸于0.9%的生理鹽水中，并將菌體濃度調(diào)整為109CFU/mL。以2%的接種量接入到脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃下連續(xù)培養(yǎng)24 h，每隔2 h 取樣，測(cè)定OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3.2 菌株的活菌數(shù) 采用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)，對(duì)1.2.3.1 中培養(yǎng)24 h 后的副干酪乳桿菌菌株進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并使用凝膠成像儀對(duì)平板進(jìn)行拍照。

1.2.3.3 菌株的產(chǎn)酸能力 方法同1.2.3.1，每隔2 h取樣，測(cè)定發(fā)酵液的pH。

1.2.3.4 菌株代謝過程中胞外多糖產(chǎn)量的測(cè)定 胞外多糖粗品的提取制備根據(jù)前人的方法略做調(diào)整[15]。將1.2.2 中得到的菌泥重懸于0.9%的生理鹽水中，并將菌體濃度調(diào)整為109CFU/mL。以2%的接種量接入到脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃下連續(xù)培養(yǎng)24 h，將待測(cè)菌液在90 ℃下水浴加熱15 min，4 ℃下10000 r/min 離心20 min 去除細(xì)胞。在上清液中添加4%（w/v）的三氯乙酸，4 ℃下放置12 h 沉淀蛋白質(zhì)，離心后取上清液，添加3 倍體積的冷乙醇，4 ℃下放置過夜。離心后取下層沉淀，即為胞外多糖粗品。將粗品溶解在去離子水中，10000 Da 膜透析。通過苯酚-硫酸法，依據(jù)葡萄糖濃度與吸光度的線性關(guān)系（y=1.3478x+0.0486，R2=0.9998），計(jì)算得出胞外多糖含量。

1.2.4 乳酸菌耐受性測(cè)定

1.2.4.1 耐低溫能力的測(cè)定 將1.2.2 中得到的菌泥分別重懸于脫脂乳培養(yǎng)基中，并將菌體濃度調(diào)整為109CFU/mL。將其分裝后置于4 ℃冷藏，?18 ℃緩凍，?80 ℃超低溫環(huán)境下儲(chǔ)存，在第0.5、1、2、7、15、30 d 分別取出，測(cè)定低溫處理前后的活菌數(shù)，計(jì)算存活率。

式（1）中：N1為低溫培養(yǎng)后的活菌數(shù)，CFU/mL；N0為低溫培養(yǎng)前的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.4.2 耐熱能力的測(cè)定 菌株的耐受性評(píng)價(jià)溫度及其耐熱性實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)安璟[13]的方法調(diào)整，副干酪乳桿菌JLUs66 的耐熱性評(píng)價(jià)溫度為55 ℃。將1.2.2 中得到的菌泥分別重懸于脫脂乳培養(yǎng)基中，并將菌體濃度調(diào)整為109CFU/mL。將其分裝后置于耐受性評(píng)價(jià)溫度下水浴處理10 min，測(cè)定耐熱性評(píng)價(jià)溫度下處理前后的活菌數(shù)，計(jì)算存活率。

式（2）中：N2為耐熱性評(píng)價(jià)溫度下培養(yǎng)后的活菌數(shù)，CFU/mL；N0為耐熱性評(píng)價(jià)溫度下培養(yǎng)前的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.4.3 耐低pH 能力的測(cè)定 菌株的低pH 耐受性是通過菌株在人工胃液環(huán)境下的存活率所測(cè)得的[16]。人工胃液的配置：氯化鈉0.2%，胃蛋白酶0.3%，用1 mol/L 鹽酸調(diào)整pH 至2.5 后，過0.22 μm 濾器后除菌備用。將1.2.2 中得到的菌泥重懸于0.9%的生理鹽水中，并將菌體濃度調(diào)整為109CFU/mL。將其分裝后置于人工胃液中37 ℃孵育。測(cè)定人工胃液環(huán)境下1 h 的活菌數(shù)，計(jì)算存活率。

式（3）中：N3為人工胃液孵育后的活菌數(shù)，CFU/mL；N0為人工胃液孵育前的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.4.4 耐膽鹽能力的測(cè)定 菌株的膽鹽耐受性根據(jù)Argyri[17]和Wang[18]的試驗(yàn)方法測(cè)得。將1.2.2中得到的菌泥分別重懸于含有0.3%、0.5%（w/v）膽鹽的脫脂乳培養(yǎng)基中，測(cè)定其在0、4 h 的活菌數(shù)，計(jì)算存活率。

式（4）中：N4為含膽鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h 后的活菌數(shù)，CFU/mL；N0為含膽鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)0 h 時(shí)的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.4.5 耐NaCl 能力的測(cè)定 菌株的耐NaCl 能力的測(cè)定參考了熊蝶等[19]的方法。將1.2.2 中得到的菌泥分別重懸于含有20、40、60、80 g/L NaCl 的MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，測(cè)定其在24 h的OD600值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用單因素ANOVA方差分析進(jìn)行組間比較，使用GraphPad prism 8.0 軟件及Origin 8.0 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參提取物對(duì)菌株生長(zhǎng)特性的影響

2.1.1 人參提取物對(duì)菌株生長(zhǎng)曲線的影響 如圖1所示，由人參提取物脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66 的生長(zhǎng)曲線可知，菌株經(jīng)人參提取物脅迫培養(yǎng)對(duì)其進(jìn)入不同的生長(zhǎng)階段的時(shí)間造成無(wú)顯著性影響（P>0.05）。經(jīng)不同濃度人參提取物脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66 均在2 h 進(jìn)入對(duì)數(shù)期，12 h 進(jìn)入穩(wěn)定期。JLUs66-0 的OD600值在進(jìn)入穩(wěn)定期后一直保持最高的趨勢(shì)，而高濃度人參提取物脅迫培養(yǎng)的菌株JLUs66-8 及JLUs66-10 在穩(wěn)定期的OD600值顯著低于其他組別（P＜0.05）。16 h 后，JLUs66-8 及JLUs66-10 的OD600值出現(xiàn)了更為明顯的下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)镴LUs66-8 及JLUs66-10 中出現(xiàn)了菌體自溶的現(xiàn)象[20]。

圖1 人參提取物脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves ofLactobacillus paracaseiJLUs66cultured under stress by ginseng extract

2.1.2 人參提取物對(duì)菌株活菌數(shù)的影響 如表1、圖2 所示，添加不同濃度的人參提取物脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66 在24 h 后的生長(zhǎng)會(huì)受到顯著的抑制（P＜0.05），人參提取物的濃度越高，抑制程度越大，菌株的活菌數(shù)越少。

表1 人參提取物脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66的活菌數(shù)Table 1 Viable counts ofLactobacillus paracaseiJLUs66cultured under stress by ginseng extract

圖2 人參提取物脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66 平板圖Fig.2 Plate ofLactobacillus paracaseiJLUs66 cultured under stress by ginseng extract

2.1.3 人參提取物對(duì)菌株產(chǎn)酸能力的影響 在培養(yǎng)基中添加不同濃度的人參提取物脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66 的發(fā)酵液pH 變化曲線見圖3，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，發(fā)酵液pH 不斷降低。其中，JLUs66-3 的pH 與JLUs66-0 的無(wú)顯著差異（P>0.05），其余組別pH 下降的幅度小于JLUs66-3 和JLUs66-0 組。且呈現(xiàn)出隨著培養(yǎng)基中人參提取物濃度的增加，菌株產(chǎn)酸越慢，菌液的pH 越高的規(guī)律。培養(yǎng)24 h時(shí)，JLUs66-0 菌液的pH 最低，降至4.91±0.06，而JLUs66-10 的pH 僅降至5.29±0.07。

圖3 人參提取物脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66 的發(fā)酵液pH 變化曲線Fig.3 pH change curves of fermentation broth ofLactobacillusparacaseiJLUs66 cultured under stress by ginseng extract

2.1.4 人參提取物對(duì)菌株產(chǎn)胞外多糖能力的影響經(jīng)不同濃度的人參提取物脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66 在培養(yǎng)24 h 后胞外多糖的含量如圖4 所示。副干酪乳桿菌JLUs66 在經(jīng)較低濃度的人參提取物脅迫培養(yǎng)后，其胞外多糖的合成量也顯著增加（P＜0.05），這可能是因?yàn)樵诰晏幚磉^程中，人參提取物中含有的某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠提高乳酸菌菌株合成多糖類物質(zhì)的能力[21]。但是菌株的利用能力有限，故而當(dāng)人參提取物脅迫培養(yǎng)的濃度高于一定值時(shí)，菌株的胞外多糖合成量不再發(fā)生顯著的變化（P>0.05）。其中，當(dāng)人參提取物脅迫培養(yǎng)的濃度為5‰時(shí)，JLUs66-5 的胞外多糖的合成能力達(dá)到拐點(diǎn)，其胞外多糖的含量為0.80±0.04 mg/mL。

圖4 人參提取物脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66 的胞外多糖含量Fig.4 Extracellular polysaccharide content ofLactobacillus paracaseiJLUs66 cultured under stress by ginseng extract注：不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），圖6~圖8 同。

2.2 人參提取物對(duì)菌株耐受性的影響

2.2.1 人參提取物對(duì)菌株耐低溫能力的影響 本試驗(yàn)測(cè)試了在培養(yǎng)基中添加不同濃度的人參提取物脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66 在4 ℃冷藏、?18 ℃緩凍、?80 ℃超低溫的環(huán)境下的耐低溫能力。

如圖5a 所示，在4 ℃的儲(chǔ)存條件下，副干酪乳桿菌JLUs66 的存活率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并在儲(chǔ)存2 d 時(shí)出現(xiàn)最大值。當(dāng)儲(chǔ)存時(shí)間較短時(shí)，添加人參提取物脅迫培養(yǎng)在不同程度上可以抑制菌株的耐低溫能力。隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，JLUs66-1 和JLUs66-3 的存活率略高于JLUs66-0，但在儲(chǔ)存30 d時(shí)，菌株的存活率均降低至11%左右。

圖5 人參提取物脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66 在不同低溫條件下存活率的變化Fig.5 Changes in the survival rate ofLactobacillus paracaseiJLUs66 cultured under stress by ginseng extract at low temperatures注：a 為4 ℃冷藏；b 為?18 ℃緩凍；c 為?80 ℃超低溫環(huán)境下儲(chǔ)存。

如圖5b，未經(jīng)脅迫培養(yǎng)的JLUs66-0 在儲(chǔ)存時(shí)間較短時(shí)，存活率高于其他菌株，經(jīng)脅迫培養(yǎng)的菌株則隨著脅迫培養(yǎng)濃度的不同呈現(xiàn)不同程度的差異。但從2 d 開始，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，JLUs66-0 的存活率逐漸低于經(jīng)脅迫培養(yǎng)的菌株。當(dāng)儲(chǔ)存時(shí)間在7 d及更久時(shí)，菌株存活率呈現(xiàn)出和脅迫培養(yǎng)的濃度成正相關(guān)的趨勢(shì)。添加人參提取物脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66 的耐低溫能力在不同程度上有所提高。

菌株儲(chǔ)存于-80 ℃條件下時(shí)，由于速凍，細(xì)胞膜損失較小，故在同樣儲(chǔ)存時(shí)間下的存活率高于?18 ℃。如圖5c，當(dāng)儲(chǔ)存時(shí)間為24 h 時(shí)，副干酪乳桿菌JLUs66 的存活率均在50%以上，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，存活率整體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。其中，高濃度人參提取物的脅迫培養(yǎng)使其低溫存活率升高，JLUs66-10 在30 d 時(shí)的存活率比未經(jīng)脅迫的JLUs66-0高26%。

低溫條件下，菌體細(xì)胞可能同時(shí)面臨著低溫所形成的冰晶及細(xì)胞內(nèi)部高滲透壓改變所帶來的危害[22]。菌體的低溫條件下的存活率的變化可能與人參提取物脅迫培養(yǎng)下菌體的胞外多糖合成量有一定的關(guān)系，在代謝過程中胞外多糖合成量增多，分泌到細(xì)胞壁外的胞外多糖對(duì)菌體形成包裹，防止低溫條件下細(xì)胞膜的破裂造成的存活率降低。

2.2.2 人參提取物對(duì)菌株耐高溫能力的影響 在培養(yǎng)基中添加不同濃度的人參提取物脅迫培養(yǎng)的乳酸菌耐熱性存活率如表2。55 ℃水浴加熱10 min 后，副干酪乳桿菌JLUs66 的存活率均下降至40%以下，隨著人參提取物濃度的增加，菌株的存活率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，且整體都處于未經(jīng)脅迫培養(yǎng)的JLUs66-0 以下。培養(yǎng)受到高濃度人參提取物的脅迫后，JLUs66-10 的高溫存活率僅為未經(jīng)脅迫的JLUs66-0 的存活率的43.93%。

表2 人參提取物脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66 的耐高溫能力的變化Table 2 Changes in the heat tolerance ofLactobacillus paracaseiJLUs66 cultured under stress by ginseng extract

乳酸菌的耐熱性主要由其細(xì)胞熱休克蛋白的水平、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及生物膜的流動(dòng)性決定[23]。培養(yǎng)基中添加不同濃度的人參提取物脅迫培養(yǎng)的乳酸菌耐熱性存活率發(fā)生變化可能是由于脅迫培養(yǎng)時(shí)，菌株產(chǎn)生了DnaK、DnaJ 等熱應(yīng)激蛋白和蛋白酶[24]。也有研究將植物乳桿菌分為高產(chǎn)胞外多糖組和中產(chǎn)胞外多糖組進(jìn)行耐熱性試驗(yàn)，結(jié)果表明菌株的胞外多糖產(chǎn)生量越高，其耐熱能力越低[15]，這與本研究的胞外多糖含量的結(jié)果有一定的相似性，故脅迫培養(yǎng)后的乳酸菌的耐熱性的改變也有可能與胞外多糖的含量有關(guān)。

2.2.3 人參提取物對(duì)菌株耐低pH 能力的影響 乳酸菌在抵達(dá)人體消化道發(fā)揮益生功能之前，需要通過胃部的低pH 環(huán)境，對(duì)低pH 條件的耐受性是衡量益生菌的重要指標(biāo)[25]。

將處理后的菌株在pH2.5 的環(huán)境下37 ℃培養(yǎng)1 h，菌株的存活率如圖6 所示。在培養(yǎng)基中添加人參提取物脅迫培養(yǎng)對(duì)JLUs66 的耐低pH 能力有一定的影響，整體呈現(xiàn)出低濃度人參提取物脅迫培養(yǎng)提高其低pH 耐受性，高濃度人參提取物脅迫培養(yǎng)降低其低pH 耐受性。其中，未經(jīng)脅迫培養(yǎng)的JLUs66-0 的存活率為6.47%±0.30%，而經(jīng)3‰濃度人參提取物脅迫培養(yǎng)的JLUs66-3 的存活率為25.67%±0.82%，高于高濃度人參提取物脅迫培養(yǎng)的JLUs66-10，約21.32 倍。

圖6 人參提取物脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66 在低pH 條件下存活率的變化Fig.6 Variation in the survival rate ofLactobacillus paracaseiJLUs66 cultured under stress by ginseng extract at low pH conditions

Nguyen 等[26]認(rèn)為，乳酸菌可以產(chǎn)生特定的胞外多糖來抵抗外界的酸脅迫。本研究中的較低濃度人參提取物脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66 存活率隨著人參提取物脅迫培養(yǎng)的濃度的上升有著不同程度的上升，推測(cè)可能是因?yàn)槊{迫培養(yǎng)后的菌株胞外多糖含量上升，其生成的特定種類的胞外多糖，在細(xì)胞表面產(chǎn)生了負(fù)電荷，防止了低pH 環(huán)境下質(zhì)子擴(kuò)散到細(xì)胞中對(duì)菌體造成危害。但當(dāng)人參提取物脅迫培養(yǎng)濃度超過一定值時(shí)，耐酸性結(jié)果與已有研究并未表現(xiàn)出完全的一致性，這需要進(jìn)一步的試驗(yàn)探究。

2.2.4 人參提取物對(duì)菌株耐膽鹽能力的影響 腸道是乳酸菌在機(jī)體內(nèi)定殖的最終部位，而腸道內(nèi)的膽鹽殘留量約為0.05%~2.0%[27]，膽鹽條件下的高存活率是乳酸菌發(fā)揮益生功能的重要前提[28]。如圖7 所示，在0.3%和0.5%的膽鹽環(huán)境下，不同濃度的人參提取物脅迫培養(yǎng)的JLUs66 的存活率呈現(xiàn)出隨人參提取物濃度的增高而升高，最終趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。其中，JLUs66-10 在0.3%膽鹽環(huán)境下表現(xiàn)出最優(yōu)的存活率，為62.68%±0.67%，而在0.5%膽鹽環(huán)境下，JLUs66-8 存活率最高，為18.43%。菌株的膽鹽耐受性規(guī)律與其產(chǎn)胞外多糖能力變化趨勢(shì)相似，推測(cè)其膽鹽耐受能力受胞外多糖含量的影響。

圖7 人參提取物脅迫的副干酪乳桿菌JLUs66 的膽鹽耐受性變化Fig.7 Changes of bile salt tolerance ofLactobacillus paracaseiJLUs66 cultured under stress by ginseng extract

2.2.5 人參提取物對(duì)菌株耐NaCl 能力的影響 乳酸菌時(shí)常應(yīng)用于高鹽環(huán)境中，如發(fā)酵泡菜等，因此其具有一定的耐NaCl 能力也至關(guān)重要[29]。

由圖8 可知，在20~80 g/L NaCl 培養(yǎng)基中，副干酪乳桿菌JLUs66 均可以生長(zhǎng)。在含有20 g/L NaCl的培養(yǎng)基中，菌株的OD600值均能達(dá)到1.4 以上，但經(jīng)人參提取物脅迫培養(yǎng)的菌株的OD600值顯著低于未經(jīng)脅迫培養(yǎng)的JLUs66-0 的OD600值（P＜0.05）。培養(yǎng)基中NaCl 濃度升高至40 g/L 時(shí)，菌株的OD600值降低，且部分經(jīng)人參提取物脅迫培養(yǎng)的菌株耐NaCl 能力有所提高，其中，JLUs66-3 的OD600值最高，為1.06，顯著高于該濃度下未經(jīng)脅迫的JLUs66-0的OD600值（P＜0.05）。培養(yǎng)基中NaCl 濃度升高至60 g/L 時(shí)，菌株的OD600值降低，且部分經(jīng)人參提取物脅迫培養(yǎng)的菌株耐NaCl 能力均有所提高，其OD600值顯著高于該濃度下未經(jīng)脅迫的JLUs66-0（P＜0.05），且整體呈現(xiàn)出人參提取物脅迫培養(yǎng)的濃度越高，菌株的耐NaCl 能力越強(qiáng)的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl 濃度升高至80 g/L 時(shí)，副干酪乳桿菌的OD600值均在0.13 左右，無(wú)顯著差異（P>0.05）。

圖8 人參提取物脅迫培養(yǎng)的副干酪乳桿菌JLUs66 在不同質(zhì)量濃度NaCl 中的生長(zhǎng)Fig.8 Growth ofLactobacillus paracaseiJLUs66 cultured under stress by ginseng extract in different mass concentrations of NaCl

乳酸菌的耐NaCl 能力主要受其高滲環(huán)境的影響，目前的研究表明，乳酸菌調(diào)節(jié)胞內(nèi)滲透壓機(jī)制主要與相容性溶質(zhì)調(diào)控系統(tǒng)、熱休克蛋白調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)[30?31]。本研究中人參提取物脅迫培養(yǎng)的菌株的耐NaCl 能力整體處于增強(qiáng)的趨勢(shì)，這可能與在脅迫過程中，LuxS/AI-2等基因的轉(zhuǎn)錄水平隨著人參提取物的濃度的提高而上升，從而其耐NaCl 能力得以提高[32]。

3 結(jié)論

研究可知，人參提取物脅迫處理對(duì)副干酪乳桿菌JLUs66 的生長(zhǎng)速率、活菌數(shù)、產(chǎn)酸速率及耐熱性的影響是負(fù)向的，人參提取物的濃度越低，乳酸菌的生長(zhǎng)特性及耐受性越好；人參提取物的脅迫培養(yǎng)對(duì)菌株的胞外多糖產(chǎn)量、低溫耐受性及膽鹽耐受性的影響是正向的，但是，當(dāng)人參提取物濃度超過5‰時(shí)，這些變化并不明顯；菌株的耐低pH 能力隨人參提取物濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的變化，尤其在3‰濃度時(shí)，耐低pH 能力最高；菌株的耐鹽能力與耐低pH 能力的趨勢(shì)有相似性，而當(dāng)NaCl 濃度足夠高時(shí)，菌株的耐鹽能力差別不大。綜合比較，人參提取物脅迫培養(yǎng)濃度為3‰時(shí)，副干酪乳桿菌JLUs66 的菌株特性及其耐受性最優(yōu)。本研究為人參提取物對(duì)乳酸菌菌株生長(zhǎng)特性的改變及菌株耐受性的提高提供科學(xué)依據(jù)，在實(shí)際生產(chǎn)過程中，可根據(jù)工業(yè)應(yīng)用的需要，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的人參提取物脅迫處理乳酸菌，有選擇性地改變其菌株生長(zhǎng)特性及耐受性，從而提高乳酸菌的環(huán)境適應(yīng)性。