茯苓多糖對(duì)雙岐桿菌BB-12 關(guān)鍵代謝產(chǎn)物的影響

張?zhí)礻枺瑥埿皴?，王丹萍，許曉曦,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.教育部乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030）

茯苓（Poria cocos）是一種我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，也是重要的藥食同源功能性食材，具有益脾和胃、寧心安神的功效。它來自于多孔菌科茯苓屬真菌茯苓的干燥菌核，多糖為茯苓的主要化學(xué)成分之一[1]，具有抗炎、抗癌、調(diào)節(jié)免疫、降血糖等功效[2]。KHAN 等[3]對(duì)小鼠的腸道菌群分析發(fā)現(xiàn)，飼喂茯苓的小鼠腸道內(nèi)可產(chǎn)生乳酸、短鏈脂肪酸的菌群以及具有分解多糖、改善肥胖能力的菌群。GAO 等[4]證明了茯苓多糖作為一種益生元可以促進(jìn)雙歧桿菌的增殖并產(chǎn)生了大量以乙酸為主的短鏈脂肪酸。JIANG 等[5]的研究表明，茯苓提取物可以在動(dòng)物體內(nèi)促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)，并抑制沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等有害菌的生長(zhǎng)。此外，還有一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示[6]，高劑量的茯苓能顯著提高小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌的水平，并具有良好的腸道菌群調(diào)節(jié)效果，且其藥效和劑量有關(guān)，提示茯苓有可能作為微生態(tài)調(diào)節(jié)劑或添加劑，用于腸道菌群調(diào)節(jié)和相關(guān)預(yù)防治療。

動(dòng)物雙歧桿菌乳雙歧亞種（Bifidobacterium animalisspp.lactisBB-12，下文簡(jiǎn)稱雙歧桿菌BB-12）是迄今為止世界上臨床研究最為充分的雙歧桿菌菌株[7]。研究證明，雙歧桿菌BB-12 能夠改善腸道功能[8?9]、防止腹瀉[10]、并能減少抗生素治療帶來的副作用[11]。在免疫功能方面，臨床研究表明雙歧桿菌BB-12 會(huì)提高機(jī)體對(duì)常見呼吸道感染的抵抗力，同時(shí)降低急性呼吸道感染的發(fā)病率。雙歧桿菌BB-12 還可通過其代謝物來防止腸道上皮屏障功能受到破壞[12]。此外，雙歧桿菌BB-12 還有著優(yōu)良的抑菌性。研究表明，雙歧桿菌BB-12 對(duì)蠟狀芽孢桿菌、艱難梭菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、大腸桿菌和糞腸球菌等表現(xiàn)出明顯的抑菌作用[13]。目前，雙歧桿菌BB-12 已在食品、保健等多個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

現(xiàn)有文獻(xiàn)中大多將茯苓多糖通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床數(shù)據(jù)證實(shí)茯苓多糖具有重要的生物活性，通過促進(jìn)腸道有益菌（雙歧桿菌等）增殖，進(jìn)而對(duì)疾病進(jìn)行調(diào)控。由于腸道菌群宏基因組測(cè)序技術(shù)的局限性，目前的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅能反映出體內(nèi)雙歧桿菌等益生菌的豐度和比例上調(diào)，很難從益生菌種的水平或株的水平來證明茯苓多糖對(duì)其有明顯的促進(jìn)作用，并且這些研究結(jié)果具體影響的是哪些種類的雙歧桿菌以及產(chǎn)生的具體代謝產(chǎn)物、與免疫等調(diào)控相關(guān)的代謝途徑等機(jī)理研究尚未見報(bào)道。由此，本研究以茯苓多糖為例，基于非靶向代謝組學(xué)技術(shù)探究動(dòng)物雙岐桿菌乳雙歧亞種BB-12 發(fā)酵茯苓多糖和葡萄糖代謝產(chǎn)物的差異。擬通過小分子代謝水平解釋茯苓多糖在體內(nèi)分解產(chǎn)生的關(guān)鍵產(chǎn)物及其發(fā)揮的生理活性，探究雙歧桿菌與益生元復(fù)配的條件下發(fā)揮益生功效的關(guān)鍵產(chǎn)物及相關(guān)潛在機(jī)理，為日后深入研究茯苓多糖的生理活性及雙歧桿菌的益生機(jī)制提供新的科學(xué)思路和研究模式。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

動(dòng)物雙歧桿菌乳雙歧亞種BB-12 由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳成分功能與營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室保存；MRS 肉湯培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；無糖MRS 培養(yǎng)基 上海瑞永生物科技有限公司；茯苓多糖（50%） 西安圣青生物科技有限公司；甲醇、乙腈、甲酸HPLC 級(jí)，賽默飛世爾科技公司。

UHPLC 液相色譜系統(tǒng)、Q-Exactive HF-X 質(zhì)譜儀 賽默飛世爾科技公司；Wonbio-96c 多樣品冷凍研磨儀 上海萬柏生物科技有限公司；Centrifuge 5430 R 高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 公司；JXDC-20 氮?dú)獯祾邇x 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；SBL-10 TD 控溫超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Anaero Pack TM-Anaero 厭氧產(chǎn)氣袋 日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備 向無糖MRS 培養(yǎng)基中加入2%的茯苓多糖作為雙歧桿菌BB-12 發(fā)酵的唯一碳源，然后將MRS 肉湯培養(yǎng)基、加入2%茯苓多糖的無糖MRS 培養(yǎng)基分別裝入5 mL 潔凈試管中，121 ℃高壓滅菌15 min 備用。

1.2.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定與擬合 ?80 ℃保存的動(dòng)物雙歧桿菌乳雙歧亞種BB-12 使用前均按照2%的比例接種于MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，經(jīng)2 次傳代后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液分別接種至普通MRS 肉湯培養(yǎng)基和加入2%茯苓多糖的無糖MRS培養(yǎng)基中，利用第三代菌種的發(fā)酵液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。菌種在37 ℃下恒溫厭氧發(fā)酵48 h，每4 h 在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定一次發(fā)酵液的吸光度及pH，每個(gè)樣品做4 個(gè)重復(fù)。

常用的微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型有：Gompertz 模型、Logistic 模型、Richards 模型等[14]。本實(shí)驗(yàn)采用Origin Pro 2019 b 軟件中的SGompertz 模型，迭代算法為L(zhǎng)evernberg-Marquardt 優(yōu)化算法，表達(dá)式如下：

式中，A、xc、k 為參數(shù)[15]，A 為模型所預(yù)測(cè)的生長(zhǎng)最大值；xc為拐點(diǎn)時(shí)間，代表在此時(shí)生長(zhǎng)速率最大；k 為生長(zhǎng)速率系數(shù)，曲線在過點(diǎn)（xc，a/e）時(shí)擁有最大斜率，即最大的生長(zhǎng)速度，為A ×k/e。

1.2.3 發(fā)酵液代謝物前處理 精確移取100 μL 發(fā)酵液至1.5 mL 離心管中，加入400 μL 提取液（甲醇:乙腈=1:1（v:v）），含0.02 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)（L-2-氯苯丙氨酸）；渦旋混勻30 s 后，低溫超聲提取30 min（5 ℃， 40 kHz），將樣品靜置于?20 ℃，30 min；離心15 min（13000 g，4 ℃），移取上清液，氮?dú)獯蹈?；加?00 μL 復(fù)溶液（乙腈:水=1:1）復(fù)溶；渦旋混勻30 s，低溫超聲萃取5 min（5 ℃，40 kHz）；離心10 min（13000 g，4 ℃），移取上清液至帶內(nèi)插管的進(jìn)樣小瓶中進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。另外，每個(gè)樣本分別移取20 μL 上清液混合后作為質(zhì)控樣本。

1.2.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱為 ACQUITY UPLC HSS T3（ 100 mm×2.1 mm,1.8 μm; Waters, Milford, USA）；流動(dòng)相A 為95%水+5%乙腈（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B 為47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水（含0.1%甲酸），進(jìn)樣量為2 μL，柱溫為40 ℃，流速0.4 mL/min，梯度洗脫程序：0~3.5 min，0%~24.5%B；3.5~5.5 min，24.5%~65%B；5.5~7.4 min，65%~100%B；7.4~7.6 min，100%~51.5%B；7.6~7.8 min，51.5%~0%B；7.8~10 min，0%B。

樣品經(jīng)電噴霧電離，分別采用正、負(fù)離子掃描模式采集質(zhì)譜信號(hào)。質(zhì)譜條件如下：掃描質(zhì)荷比范圍70~1050，鞘氣流速50 L/min，輔助氣流速13 L/min，加熱溫度425 ℃，毛細(xì)管溫度325 ℃，噴霧電壓±3500 V，碰撞能40 eV。

1.2.5 非靶向代謝組學(xué)表達(dá)量數(shù)據(jù)預(yù)處理 根據(jù)樣本或分組內(nèi)缺失值的比例，進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，去除每一組內(nèi)>20%的缺失值；并用極小值方法對(duì)原始數(shù)據(jù)中的缺失值進(jìn)行模擬填充；數(shù)據(jù)歸一化方法為總和；設(shè)置質(zhì)控樣本（Quality Control, QC）中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值≤30%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用IBM SPSS Statistics 26 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析等處理，使用Origin Pro 2019 b 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合和作圖，利用美吉生物生信云平臺(tái)對(duì)非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析。

利用scipy （Python）進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）代謝通路富集、相關(guān)性分析、聚類分析、Vip 分析；利用ropls （R packages）進(jìn)行PCA 分析及OPLS-DA 分析，分析數(shù)據(jù)均使用均值中心化方法進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，差異檢驗(yàn)方法為Student'st-test，除特殊說明外文中置信度均為0.95。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙歧桿菌BB12 代謝茯苓多糖的生長(zhǎng)曲線模型及評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)以葡萄糖為唯一碳源的正常MRS 肉湯培養(yǎng)基作為對(duì)照，用以比較雙歧桿菌BB-12 以茯苓多糖為唯一碳源時(shí)的生長(zhǎng)曲線及發(fā)酵液的pH 變化情況。雙歧桿菌BB-12 發(fā)酵葡萄糖的組合用Con表示（對(duì)照組，下同），雙歧桿菌BB-12 發(fā)酵茯苓多糖的組合用PPC 表示（實(shí)驗(yàn)組，下同）。雙歧桿菌BB-12 隨時(shí)間發(fā)酵葡萄糖和茯苓多糖的生長(zhǎng)變化狀況及pH 變化如圖1 所示。表1 給出了擬合模型的相關(guān)參數(shù)，模型擬合的決定系數(shù)R2均大于0.9，表明模型擬合效果較好。

圖1 雙歧桿菌BB-12 發(fā)酵葡萄糖和茯苓多糖的生長(zhǎng)擬合曲線及pH 變化曲線Fig.1 Growth fitting curve and pH change curve of glucose and polysaccharides ofPoria cocosfermented byBifidobacteriumBB-12

表1 生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程非線性擬合相關(guān)參數(shù)Table 1 Parameters related to nonlinear fitting of growth dynamics equation

結(jié)合圖1 和表1 可知，雙歧桿菌BB-12 在以茯苓多糖為碳源的培養(yǎng)基中增殖迅速，細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間快于對(duì)照組（實(shí)驗(yàn)組xc值小于對(duì)照組xc），且進(jìn)入穩(wěn)定期后期望最大生長(zhǎng)數(shù)量大于對(duì)照組（實(shí)驗(yàn)組A 值大于對(duì)照組）。由此表明，實(shí)驗(yàn)組所添加的茯苓多糖相比對(duì)照組可有效增強(qiáng)雙歧桿菌BB-12 的代謝速率，并促進(jìn)其增殖。

2.2 非靶向代謝組學(xué)樣本相關(guān)性分析

非靶向代謝組學(xué)樣本相關(guān)性熱圖如圖2 所示。由圖可知同組內(nèi)樣本相關(guān)性較高，即組內(nèi)差異較小，反映樣本之間存在的誤差較小。圖3 分別為正、負(fù)離子模式下樣本的PCA 得分圖。R2X（cum）表示累積的差異解釋性，數(shù)值越接近1 說明模型越好。圖中正離子模式PC1 的R2X（cum）為0.709，PC2 的R2X（cum）為0.894，PC1 與PC2 對(duì)模型的貢獻(xiàn)率為89.40%；負(fù)離子模式PC1 的R2X（cum）為0.756，PC2 的R2X（cum）為0.915，PC1 與PC2 對(duì)模型的貢098765獻(xiàn)率為91.50%，主成分對(duì)模型貢獻(xiàn)率較高，累積的差異解釋性較好。

圖2 非靶向代謝組學(xué)樣本相關(guān)性熱圖Fig.2 Correlation heat map of non-targeted metabolomics samples注：圖中的右側(cè)和下側(cè)為樣本名，圖中每個(gè)格子表示兩個(gè)樣之間的相關(guān)性，不同顏色代表樣本間相關(guān)系數(shù)的相對(duì)大小，聚類樹枝的長(zhǎng)度表示樣本間相對(duì)距離的遠(yuǎn)近，同一枝上的樣本中比較相似。

圖3 樣本PCA 得分圖Fig.3 PCA score of samples

根據(jù)圖中結(jié)果可知，各組樣本在圖中位置分布相對(duì)集中，QC 樣本分布效果良好，即組內(nèi)各樣本差異不大，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，隨機(jī)誤差較小，且模型對(duì)實(shí)際樣本分布的解釋性與準(zhǔn)確性較好，可進(jìn)一步對(duì)樣本進(jìn)行差異性分析。

2.3 差異代謝物的篩選與分析

對(duì)于不同分組的組間差異比較，采用有監(jiān)督的正交偏最小二乘回歸模型的判別分析方法（Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis,OPLS-DA），并采用置換檢驗(yàn)來標(biāo)識(shí)監(jiān)督性學(xué)習(xí)方法獲得分類不是偶然的。通過這種方式，可以更好地區(qū)分組間差異，提高模型的有效性和解析能力。此外，采用OPLS-DA 模型的VIP>1，P＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)初步篩選出各組的差異代謝物進(jìn)行下一步分析，并用S-plot 與火山圖對(duì)結(jié)果分布進(jìn)行展示。

圖4 與圖5 分別為OPLS-DA 模型建立結(jié)果的正離子模式和負(fù)離子模式展示圖。結(jié)合圖4、圖5及表2 數(shù)據(jù)，可見模型穩(wěn)定可靠且預(yù)測(cè)能力較好。正、負(fù)離子模型的置換檢驗(yàn)結(jié)果Q2（cum）截距值小于0.05，說明本實(shí)驗(yàn)建立的OPLS-DA 模型未發(fā)生過擬合。結(jié)合數(shù)據(jù)庫比對(duì)，共篩選出101 個(gè)陽離子差異代謝物，80 個(gè)陰離子差異代謝物。其中，有93 個(gè)代謝物顯著下調(diào)，88 個(gè)代謝物顯著上調(diào)。圖6 展示了VIP 值前50 的差異代謝物。

表2 模型對(duì)X 和Y 矩陣的解釋率及預(yù)測(cè)能力參數(shù)表Table 2 Parameters of the model's explanatory rate and predictive power for X and Y matrices

圖4 差異代謝物的篩選（陽離子模式）Fig.4 Screening of differential metabolites (positive mode)

圖5 差異代謝物的篩選（陰離子模式）Fig.5 Screening of differential metabolites (negative mode)

圖6 雙歧桿菌BB-12 發(fā)酵葡萄糖和茯苓多糖的差異代謝物（Top50）Fig.6 Differential metabolites of fermented glucose and polysaccharides ofPoria cocosbyBifidobacteriumBB-12 (Top50)注：左側(cè)為代謝物聚類樹狀圖，分支越近，說明樣本內(nèi)所有代謝物的表達(dá)模式越接近；每列表示一個(gè)樣本，下方為樣本名稱；每行表示一個(gè)代謝物，顏色表示該代謝物在該組樣本中相對(duì)表達(dá)量的大小，顏色梯度與數(shù)值大小的對(duì)應(yīng)關(guān)系見梯度色塊。右側(cè)為代謝物VIP 條形圖，條形長(zhǎng)度表示該代謝物對(duì)兩組差異的貢獻(xiàn)值，默認(rèn)不小于1，值越大表示該代謝物在兩組間差異越大。條形顏色表示代謝物在兩組樣本中差異顯著性，即P_value 值，P_value 越小，-log10（P-value） 越大，顏色越深。右側(cè)*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001。

上述結(jié)果顯示，雙歧桿菌BB-12 代謝茯苓多糖產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中，上調(diào)最顯著的是一種異喹啉生物堿（Oxoglaucine），報(bào)道[16]稱該物質(zhì)具有較強(qiáng)的藥理活性，有抗菌、抗炎、抗癌、修復(fù)免疫系統(tǒng)等諸多功能[17]，CHEN 等[18]實(shí)驗(yàn)證明它是一類可有效治療乳腺癌的功能成分。其次上調(diào)的還有丹芝酸、芒柄花素、黃藤素、羥基積雪草酸（Madecassic acid）以及三萜類化合物等成分；羥基積雪草酸是積雪草中有效活性物質(zhì)，已有的報(bào)道證明其具有抗氧化、抗抑郁、抗菌、調(diào)節(jié)免疫等生物活性功能[19]，ZHANG 等[20]將CT26 結(jié)腸癌細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)并用不同劑量的羥基積雪草酸進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)羥基積雪草酸在體內(nèi)可通過促使腫瘤細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)免疫來抑制腫瘤生長(zhǎng)；WON 等[21]通過研究其對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7 的作用發(fā)現(xiàn)，羥基積雪草酸可通過調(diào)節(jié)NF-κB 信號(hào)通路進(jìn)而影響腫瘤壞死因子TNF-α、白細(xì)胞介素IL-1β、IL-6 等物質(zhì)的分泌，從而在體內(nèi)達(dá)到抗炎的效果。黃藤素（Palmatine）同樣具有抗炎、抗菌、提高免疫能力等作用[22]，并且對(duì)多種癌細(xì)胞系具有抗癌活性[23]，它還可通過誘導(dǎo)胰島素的分泌來達(dá)到降低血糖的效果[24]，并降低血液中總膽固醇和甘油三酯含量，提高高密度脂蛋白的含量[25]。TAKAYAMA 等[26]及PARK 等[25]分別通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了雙歧桿菌可以調(diào)節(jié)血脂代謝、治療糖尿病等潛在功效，該代謝物的產(chǎn)生可能是雙歧桿菌發(fā)揮上述功效的原因之一。芒柄花素（Formononetin）是一種異黃酮類化合物，近年來因其抗氧化、抗癌、抗炎等生物學(xué)特性而廣受關(guān)注[27]。許多研究表明刺芒柄花素具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的潛力，如通過多種信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等[28?29]，此外，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，這種活性化合物在預(yù)防和治療多種疾病方面顯示出潛力，包括肥胖和神經(jīng)神經(jīng)退化性疾病性疾病等[18]。三萜類化合物（（3beta,17alpha,23R）-17,23-Epoxy-3,29-dihydroxy-27-norlanost-8-ene-15,24-dione）是由數(shù)個(gè)異戊二烯去掉羥基后首尾相連構(gòu)成的具有多種生物活性的物質(zhì)，如靈芝三萜有抗氧化、抗菌、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)活性等[30]；此外在差異代謝物中差異含量較大的還有丹芝酸E（Ganolucidic acid E）、丹芝酸B（Ganolucidic acid B）和丹芝酸C（Ganolucidic acid C），丹芝酸類也是一種具有較強(qiáng)生理功效的三萜類化合物，有研究證明丹芝酸具有保護(hù)肝臟活性[31]和治療HIV-1 的潛在功能[32]；上述分析結(jié)果顯示，這些代謝產(chǎn)物可能是茯苓在人體內(nèi)發(fā)揮功效的關(guān)鍵因素之一，而腸道內(nèi)的菌群尤其是雙歧桿菌對(duì)其代謝可能是該物質(zhì)生成的關(guān)鍵前提。

顯著下調(diào)的代謝物有同型胱氨酸、酒石酸、千里光寧堿、膽酸和葡萄糖基胺等。其中，同型胱氨酸和同型半胱氨酸的升高被認(rèn)為是冠狀動(dòng)脈、腦動(dòng)脈和周圍血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[33]。張麗杰等[34]也通過臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)口服雙歧桿菌可以降低膽固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白膽固醇的含量，對(duì)治療動(dòng)脈粥樣硬化和心腦血管疾病有一定意義。該代謝物的顯著下調(diào)說明茯苓多糖可以更加充分的發(fā)揮雙歧桿菌對(duì)這些疾病的預(yù)防作用。酒石酸是一種具有肌肉毒性的物質(zhì)，它可以抑制細(xì)胞中蘋果酸的生產(chǎn)，而蘋果酸是有氧代謝的重要中間產(chǎn)物；千里光寧堿（Senecionine），是一種有毒的生物堿，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的分布從而表達(dá)肝臟毒性[35]。這一結(jié)果表明，下調(diào)這些代謝產(chǎn)物可能與雙歧桿菌BB-12 發(fā)酵茯苓多糖比發(fā)酵葡萄糖表現(xiàn)出更好的生長(zhǎng)性能及減少體內(nèi)炎癥等有關(guān)。

2.4 KEGG 差異代謝通路的富集

KEGG 代謝通路圖表示物種代謝的反應(yīng)、相互作用網(wǎng)絡(luò)以及遺傳、環(huán)境信息處理和其他細(xì)胞過程等。這些通路不僅提供生化物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化所有可能的代謝途徑，還包含對(duì)催化各步反應(yīng)的酶的全面注解等[36]。

通過與KEGG 數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)差異代謝物共富集到61 條代謝通路，其中，顯著富集17 條（圖7）。富集最顯著的前三個(gè)通路為ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路、亞油酸代謝、半乳糖代謝。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP—binding cassette transpoter）是一類龐大而古老的跨膜運(yùn)輸?shù)鞍准易?，在生物體內(nèi)參與多種物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)積累、有害物質(zhì)解毒、氣孔調(diào)節(jié)、植物防御等生理活動(dòng)。亞油酸是一種人體必需的不飽和脂肪酸，能降低血液膽固醇，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化。許多文獻(xiàn)如[37?38]都表明一些雙歧桿菌可以產(chǎn)生亞油酸，RHEE 等[39]的研究也證實(shí)雙歧桿菌在預(yù)防動(dòng)脈硬化方面有一定作用。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中富集到該通路的代謝物均有顯著上調(diào)，這表明茯苓多糖可能促進(jìn)雙歧桿菌產(chǎn)生亞油酸及相關(guān)衍生物，這條通路可能也是雙歧桿菌改善體內(nèi)血脂代謝的潛在機(jī)制之一。對(duì)半乳糖的代謝是雙歧桿菌較其他微生物所表現(xiàn)出較強(qiáng)的代謝功能之一，該代謝通路的顯著富集也印證了這一點(diǎn)。

圖7 KEGG 差異代謝通路氣泡圖Fig.7 KEGG differential metabolic pathway bubble diagram注：橫坐標(biāo)為富集率；縱坐標(biāo)為KEGG 通路。圖中氣泡的大小代表該通路中富集到代謝集中代謝物數(shù)量的多少，氣泡的顏色表示不同富集顯著性P值的大小。

富集因子最高的通路為膽堿能藥物和抗膽堿能藥物途徑（Cholinergic and anticholinergic drugs，Pathway ID：map07220），富集因子達(dá)到0.5。該通路中鑒定到了一個(gè)關(guān)鍵代謝物安普托品（Amprotropine），在該代謝通路中安普托品的前體物質(zhì)是阿托品，阿托品在膽堿能神經(jīng)節(jié)后纖維效應(yīng)器處，可與遞質(zhì)的乙酰膽堿爭(zhēng)奪受體，主流研究認(rèn)為乙酰膽堿含量增多與阿爾茲海默病的癥狀改善顯著相關(guān)。在該條通路中也顯示，這一物質(zhì)是抗帕金森藥物的主要原料之一。現(xiàn)有的研究結(jié)果也報(bào)道了雙歧桿菌對(duì)帕金森病[40]以及阿爾茲海默癥[41]的治療有促進(jìn)作用。因此，這條通路可能是雙歧桿菌在腸道內(nèi)發(fā)揮腦-腸軸功效的關(guān)鍵通路之一。此外，在該通路中安普托品是治療腸穩(wěn)態(tài)失衡的前體物質(zhì)，該代謝物在實(shí)驗(yàn)組中較對(duì)照組顯著上調(diào)，表明茯苓多糖較葡萄糖可以更好地發(fā)揮雙歧桿菌在維持腸穩(wěn)態(tài)中的重要益生功能。

本研究結(jié)合OPLS-DA 差異代謝物模型及KEGG差異代謝通路，共篩選出一種三萜類化合物（（3beta,17alpha,23R）-17,23-Epoxy-3,29-dihydroxy-27-norlanost-8-ene-15,24-dione）、芒柄花素、安普托品、同型胱氨酸、酒石酸、丹芝酸E、丹芝酸B、丹芝酸C、異喹啉生物堿、黃藤素、千里光寧堿、羥基積雪草酸共12 種具有相關(guān)生理活性的關(guān)鍵差異代謝物，并以箱體圖形式（圖8）展現(xiàn)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間含量豐度差異。

圖8 12 種關(guān)鍵差異代謝物箱體圖Fig.8 Box plot of 12 key differential metabolites

通過對(duì)差異代謝物的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌BB-12 代謝茯苓多糖產(chǎn)生了許多三萜類、黃酮類物質(zhì)，且這些物質(zhì)大多具有較強(qiáng)的生物活性，如抗炎、抗癌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等。而這些活性恰好是茯苓多糖在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中顯示的結(jié)果。由此提示，上述代謝產(chǎn)物可能是茯苓發(fā)揮與疾病調(diào)控相關(guān)功能的原因之一。此外，通過對(duì)差異代謝物的富集得到了幾條重要的代謝通路，這些代謝通路也可能是雙歧桿菌與茯苓多糖在體內(nèi)發(fā)揮相關(guān)益生功效的關(guān)鍵途徑。

3 結(jié)論

本文通過非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，從小分子代謝物層面比較分析了動(dòng)物雙歧桿菌乳雙歧亞種BB-12 發(fā)酵茯苓多糖和葡萄糖的代謝產(chǎn)物之間的差異，這些代謝物以及所對(duì)應(yīng)的代謝通路不僅與茯苓多糖和雙歧桿菌的抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、改善腸道菌群等益生功能密切相關(guān)，且與腸道菌群與機(jī)體各部位之間如腸-腦軸、腸-肝軸等的平衡與調(diào)節(jié)有關(guān)。由此，從科學(xué)的角度進(jìn)一步證實(shí)了我國(guó)傳統(tǒng)中藥材茯苓多糖發(fā)揮益生功效的部分機(jī)制，也為今后探究雙歧桿菌與益生元之間相關(guān)性研究建立一種科學(xué)有效的模型，并為未來疾病的靶向預(yù)防與調(diào)控，以及個(gè)性化飲食營(yíng)養(yǎng)干預(yù)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。