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    眼庫獲取的角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度變化規(guī)律及影響因素研究△

    2022-05-29 07:22:46龍俊君李蘭曹倩李云川李勇田二苗
    中國眼耳鼻喉科雜志 2022年3期
    關(guān)鍵詞:植片供體內(nèi)皮細(xì)胞

    龍俊君 李蘭 曹倩 李云川 李勇 田二苗

    (昆明市第一人民醫(yī)院眼科 昆明 650000)

    當(dāng)下角膜供體嚴(yán)重缺乏,在我國約400萬等待角膜移植的患者,而每年僅1萬余人進(jìn)行手術(shù)[1]。在角膜供體如此缺乏的情況下,規(guī)范眼庫管理為臨床提供更多優(yōu)質(zhì)的角膜植片尤為重要。2016年,美國從62家眼庫收集了69 049名捐贈(zèng)者捐贈(zèng)的136 318枚眼角膜,卻有近26%的捐贈(zèng)角膜通過評(píng)估后被認(rèn)為不適合移植[2]。

    供體角膜評(píng)估主要包括角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性、微生物污染控制以及免疫原性[3],角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性是評(píng)價(jià)供體質(zhì)量的重要因素。在我們植片獲取和保存過程中易受環(huán)境等因素的制約,因此不同國家和地區(qū)的獲取標(biāo)準(zhǔn)不盡相同[4-6]。關(guān)于供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞影響因素的研究目前仍沒有定論,而角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度隨死亡-獲取時(shí)間、年齡等多種相關(guān)因素的變化規(guī)律有待進(jìn)一步闡明。本文對(duì)116枚供體角膜進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞密度監(jiān)測(cè),探究在獲取過程中影響角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度的因素,以期為優(yōu)化角膜取材及保存的流程提供參考。

    1 資料與方法

    1.1 資料 收集2019年1月~2021年1月于本院獲取的供體角膜植片132枚,符合標(biāo)準(zhǔn)116枚(87.8%),16枚排除(12.1%)。其中8枚(6.0%)因角膜潰瘍排除,6枚(4.5%)因患有傳染性疾病排除,1枚(0.7%)因既往內(nèi)眼手術(shù)史排除,1枚(0.7%)因既往青光眼病史排除,余116枚角膜供體納入研究。

    1.2 試劑與儀器 試劑:Eusol-C中期保存液、Ⅲ型安爾碘溶液。器材:內(nèi)皮顯微鏡(EB-3000 XYZ型,HAI公司,美國)、角膜剪、開瞼器、持針器、手術(shù)刀。分析軟件:內(nèi)皮分析軟件(CASEB 2.20,HAI公司,美國)。

    1.3 研究方法

    1.3.1 獲取角膜組織(原位角膜切除) ①消毒鋪巾,Ⅲ型安爾碘溶液沖洗結(jié)膜囊;②角膜剪沿角鞏膜緣剪開結(jié)膜囊,分離結(jié)膜下組織,手術(shù)刀于角鞏膜緣后3 mm處切開鞏膜,直達(dá)色素膜,角膜剪360°剪開鞏膜,取下角膜植片,保存于4 ℃,Eusol-C中期保存液中,內(nèi)皮面朝上;③置塑料透明角膜片于眼表創(chuàng)面,閉合瞼緣,恢復(fù)儀容。

    1.3.2 檢測(cè)方法 ①參照《眼庫管理中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[3],制訂角膜組織報(bào)告表。記錄供體編號(hào)、性別、年齡、死亡原因、死亡-獲取時(shí)間,取材后立即進(jìn)行保存并由同一名醫(yī)師進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞密度的檢測(cè)。②裂隙燈顯微鏡檢查:角膜上皮層均完整;基質(zhì)層無水腫、瘢痕;后彈力層無褶皺。③內(nèi)皮細(xì)胞密度檢測(cè):將裝有供體角膜植片的保存液瓶裝入內(nèi)皮顯微鏡的固定槽中,調(diào)節(jié)鏡頭的位置找到中央角膜,調(diào)整粗準(zhǔn)焦螺旋找到角膜內(nèi)皮層,進(jìn)一步調(diào)整細(xì)準(zhǔn)焦螺旋使得內(nèi)皮細(xì)胞成像清晰,拍攝內(nèi)皮細(xì)胞圖,選擇其中的50~100個(gè)細(xì)胞,運(yùn)用CASEB 2.20 內(nèi)皮分析軟件對(duì)所拍攝的圖片進(jìn)行內(nèi)皮密度分析,對(duì)同一角膜植片重復(fù)測(cè)量3次取平均值,記錄數(shù)據(jù)。取材及檢測(cè)均由同一醫(yī)師進(jìn)行。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 23.0軟件將所收集數(shù)據(jù)整理后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)或率表示。滿足正態(tài)分布與方差齊性的資料采用單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA),不滿足的資料則采用秩和檢驗(yàn)。運(yùn)用多元線性回歸分析研究死亡-獲取時(shí)間與角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度的變化規(guī)律。以P<0.05判定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 供體年齡與角膜內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)性 116枚角膜供體中,年齡為(35.46±12.55)歲,按年齡將所測(cè)量的供體植片進(jìn)行分組(表1)。其中<30歲組,48例,平均角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為(3 151.770±347.288)個(gè)/mm2;>30歲組,68例,平均角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為(2 846.338±338.867)個(gè)/mm2。不同年齡的供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.395,P<0.001)。

    2.2 供體死亡原因與角膜內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)性 本研究中供體因外傷死亡的有86例,余30例死于心腦血管意外(表1)。2組不同死亡原因的供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.444,P=0.232)。

    2.3 供體死亡-獲取時(shí)間與角膜內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)性

    2.3.1 供體死亡-獲取時(shí)間與角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度 將116例角膜供體按死亡-獲取時(shí)間分組(圖1),0~2 h組,40例,平均角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為(3 179.975±335.365)個(gè)/ mm2;2~4 h組,42例,平均角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為(2 962.595±355.271)個(gè)/ mm2;4~6 h組,34例,平均角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為(2 741.411±295.646)個(gè)/mm2。隨死亡-獲取時(shí)間延長所拍攝圖片角膜內(nèi)皮細(xì)胞清晰程度下降,圖C中因角膜水腫無法拍攝出清晰的圖像,而圖D中出現(xiàn)了無內(nèi)皮細(xì)胞區(qū)。116枚供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度均>2 000個(gè)/mm2。

    圖1 不同死亡-獲取時(shí)間供體植片角膜內(nèi)皮細(xì)胞拍攝圖片 A.死亡-獲取時(shí)間為0.5 h,角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為3 701 個(gè)/mm2;B.死亡-獲取時(shí)間為2.25 h,角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為3 190 個(gè)/mm2;C.死亡-獲取時(shí)間5.2 h,角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為2 806 個(gè)/mm2,角膜植片部分出現(xiàn)水腫,所測(cè)角膜內(nèi)皮細(xì)胞圖像清晰度下降;D.死亡-獲取時(shí)間為5.5 h,角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為2 033 個(gè)/mm2,該植片出現(xiàn)了無內(nèi)皮細(xì)胞區(qū)。D 所拍攝位置非角膜中央,所測(cè)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為中央角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度。

    表1顯示不同供體死亡-獲取時(shí)間的角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度。不同死亡-獲取時(shí)間的角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.078,P=0.005)。運(yùn)用SNK法進(jìn)行事后檢驗(yàn);對(duì)不同死亡-獲取時(shí)間組間供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度差值進(jìn)行兩兩對(duì)比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    表1 角膜植片內(nèi)皮細(xì)胞密度

    2.3.2 供體死亡-獲取時(shí)間與角膜內(nèi)皮細(xì)胞六角形細(xì)胞占比及變異系數(shù) 不同死亡-獲取時(shí)間的供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞六角形細(xì)胞占比及變異系數(shù)見表2。將3組數(shù)據(jù)的六角形細(xì)胞占比進(jìn)行ANOVA,結(jié)果示不同死亡-獲取時(shí)間的六角形細(xì)胞占比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.708,P=0.011)。運(yùn)用LSD法進(jìn)行事后檢驗(yàn):對(duì)不同死亡-獲取時(shí)間組間供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞六角形細(xì)胞占比進(jìn)行兩兩對(duì)比,0~2 h、2~4 h分別與4~6 h組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而0~2 h與2~4 h組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。將3組數(shù)據(jù)的變異系數(shù)進(jìn)行ANOVA,結(jié)果示不同死亡-獲取時(shí)間的變異系數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.495,P=0.563)。

    表2 角膜內(nèi)皮細(xì)胞六角形細(xì)胞占比及變異系數(shù)

    2.4 角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度隨死亡-獲取時(shí)間的變化規(guī)律 通過之前分析進(jìn)行因變量的篩選,發(fā)現(xiàn)供體年齡、不同死亡-獲取時(shí)間對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用多元線性回歸分析,設(shè)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度為因變量Y,自變量分別為年齡X1,死亡-獲取時(shí)間X2。將所得結(jié)果擬合回歸方程:Y=3 711.007-11.073X1-124.098X2,擬合度R=0.64,P<0.05,回歸模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度隨供體年齡、死亡-獲取時(shí)間的變化規(guī)律符合線性趨勢(shì),且呈負(fù)相關(guān)。

    3 討論

    供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度及活性是評(píng)估植片質(zhì)量的重要指標(biāo),亦是穿透性角膜移植手術(shù)成功的保障。角膜內(nèi)皮細(xì)胞是連接角膜與前房的屏障,既能防止房水進(jìn)入基質(zhì)層,也具有鈉泵功能將角膜基質(zhì)內(nèi)的水泵至前房維持角膜透明[7]。然而角膜內(nèi)皮細(xì)胞極易受到損傷,低氧、年齡>65歲、炎癥及內(nèi)眼手術(shù)干擾等多種物理化學(xué)因素[8-10]均可造成角膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷。角膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷或是缺失后依靠相鄰的內(nèi)皮細(xì)胞通過伸展、擴(kuò)大、移行進(jìn)行修復(fù),不僅會(huì)引起數(shù)量減少,而且形態(tài)大小也會(huì)發(fā)生變化,造成六角形細(xì)胞占比減少。由于角膜移植術(shù)后植片曲率變化較大,難以通過非接觸式角膜內(nèi)皮細(xì)胞鏡進(jìn)行術(shù)后早期的角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)進(jìn)行精確檢測(cè),而術(shù)后角膜內(nèi)皮的慢性失代償仍有待進(jìn)一步長時(shí)間的隨訪。

    本研究結(jié)果提示年齡和死亡-獲取時(shí)間對(duì)供體角膜植片內(nèi)皮細(xì)胞密度的影響是相互關(guān)聯(lián)的。供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度與供體年齡、供體死亡-獲取時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。目前已有關(guān)于供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度與年齡、保存時(shí)間及方法、死亡-獲取時(shí)間等諸多因素的研究[11]。Armitage等[12]研究表明供體年齡和組織保存時(shí)間是影響器官培養(yǎng)法保存的角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度的主要因素,較高的供體年齡和較長的保存時(shí)間都會(huì)降低供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度。然而Langenbucher等[13]研究則認(rèn)為儲(chǔ)存時(shí)間延長可能會(huì)增加角膜內(nèi)皮細(xì)胞丟失,但死亡-獲取時(shí)間與角膜內(nèi)皮細(xì)胞丟失無關(guān)。通常認(rèn)為正常人群角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度隨年齡增長而下降,60歲后人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)目與形態(tài)可發(fā)生變化,但對(duì)供體年齡與角膜術(shù)后成功率的研究認(rèn)為角膜移植后的成功率和供體年齡并無關(guān)系[14]。目前這些研究的結(jié)果往往是相互矛盾的。本研究認(rèn)為影響供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞的因素既獨(dú)立存在也相互影響,對(duì)于用作穿透性角膜移植材料的角膜供體,年齡越大則要求死亡-獲取時(shí)間越短。

    本研究所收集資料均用于臨床穿透性角膜移植手術(shù),暫無死亡-獲取時(shí)間>6 h的病例。研究發(fā)現(xiàn),雖然在6 h內(nèi)所獲取的角膜植片的內(nèi)皮細(xì)胞密度均>2 000個(gè)/mm2,但是隨死亡-獲取時(shí)間延長,所測(cè)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度呈線性下降趨勢(shì)。因此在進(jìn)行增視性角膜移植手術(shù),例如圓錐角膜患者的穿透性角膜移植手術(shù)時(shí),不建議使用死亡-獲取時(shí)間>6 h的供體植片。死亡-獲取時(shí)間對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的影響機(jī)制是由于死后生命活動(dòng)停止,使得機(jī)體處于缺氧狀態(tài),房水停止生成,而原本在前房里的房水氧含量隨死亡時(shí)間延長而下降,最終導(dǎo)致角膜內(nèi)皮細(xì)胞丟失[15]。通常認(rèn)為死亡-獲取時(shí)間>12 h,角膜內(nèi)皮細(xì)胞將被滅活,因此國內(nèi)外眼庫多要求供體死亡時(shí)間<6 h[16]。在我國由于供體的稀缺,謝立信等[17]曾將7枚死亡-獲取時(shí)間>12 h的供體植片進(jìn)行移植,監(jiān)測(cè)到受體術(shù)后半年角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)平均為1 230個(gè)/mm2,即供體死亡-獲取時(shí)間>12 h也可用于穿孔感染等治療性角膜移植。國外也報(bào)道了類似研究,Parekh等[18]對(duì)死亡-獲取時(shí)間為0.3~25.6 h的733個(gè)角膜供體進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)在保存過程中,死亡-獲取時(shí)間對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞沒有影響。然而,在對(duì)接受植片死亡-獲取時(shí)間>10 h的患者進(jìn)行隨訪的過程中發(fā)現(xiàn),較長的死亡-獲取時(shí)間會(huì)對(duì)角膜移植患者移植后的內(nèi)皮細(xì)胞丟失有影響,因此,排除手術(shù)創(chuàng)傷外,死亡-獲取時(shí)間也是影響內(nèi)皮細(xì)胞密度的潛在因素之一。目前各國對(duì)死亡-供體保存時(shí)間尚未作嚴(yán)格要求,僅均強(qiáng)調(diào)應(yīng)盡快摘取和保存供體眼組織。

    本研究所監(jiān)測(cè)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度與死亡-獲取時(shí)間和供體年齡相關(guān)性的回歸模型,擬合度僅為0.64,表明除死亡-獲取時(shí)間和供體年齡對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞起主要影響外,仍有其他因素影響著供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度。此前已有研究[19]表明不同溫度對(duì)供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性有影響,溫度越高,角膜內(nèi)皮細(xì)胞存活的時(shí)間越短。此外,供體眼部疾患,如既往白內(nèi)障、青光眼、玻璃體切除等內(nèi)眼手術(shù)史,眼部炎癥史、圓錐角膜及Fuchs角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良等均可引起角膜內(nèi)皮細(xì)胞丟失;供體原發(fā)病如糖尿病、高血壓、慢性腎衰竭及代謝綜合征等,供體死亡前呼吸機(jī)使用時(shí)間等也被認(rèn)為會(huì)引起角膜內(nèi)皮細(xì)胞丟失[20-21]。

    除供體角膜植片在取材及保存過程中有內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,穿透性角膜移植手術(shù)過程也會(huì)造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷。因此,為了提高穿透性角膜手術(shù)的成功率,選用的供體角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度應(yīng)>2 000個(gè)/mm2,無明顯形態(tài)異常,細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[2]。對(duì)臨床供體角膜植片內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測(cè),分析角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度的影響因素并探究其變化規(guī)律,可以為穿透性角膜移植手術(shù)優(yōu)選高質(zhì)量供體材料,從而提高穿透性角膜手術(shù)的成功率。

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