葡萄砧木雜種優(yōu)株對南方根結線蟲的抗性表現(xiàn)

葛啟要，張首偉，李西選，張劍俠

（西北農林科技大學園藝學院/旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室/農業(yè)農村部西北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，陜西楊凌 712100）

1889年Neal首次在美國加州的葡萄上發(fā)現(xiàn)根結線蟲（Meloidogyne spp.）[1]。根結線蟲主要有南方根結線蟲、北方根結線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲4種[2]，是世界上危害性最強的植物病原線蟲之一[3]。除了茄科、瓜類植物受害較嚴重外，葡萄也常常受到危害[4]。根結線蟲侵染性二齡幼蟲的侵染會使植株畸形[5]，還會加重枯萎病等土傳病害的發(fā)生[6]。根結線蟲的病癥（根結、根腐）比較隱蔽，不易從地上部判斷是否感病，且容易與缺素癥和病毒病相混淆，因此從植物地上部較難分辨線蟲病，從而加劇了防治困難[7]。防治措施不力以及防治困難使得根結線蟲病害愈發(fā)嚴重[8]，導致許多葡萄園遭受巨大的經濟損失[9]。危害葡萄的根結線蟲主要為南方根結線蟲，在我國由北方傳統(tǒng)葡萄產區(qū)向四周迅速擴散，危害范圍逐年擴大，已經成為重要的土傳病害[9-10]。目前生產上主要采用化學防治、生物防治、輪作等方法進行防治[11]，但栽培抗性品種是最安全、高效、可靠的方式[12]。

我國擁有豐富的野生葡萄資源，抗線蟲類型豐富多樣[13]，加之從國外引入了大量葡萄栽培品種和砧木等資源，其中有很多是抗根結線蟲的資源類型[13-15]。迄今，我國在抗南方根結線蟲的葡萄砧木育種方面研究較少。為解決葡萄生產中南方根結線蟲危害日益嚴重的問題，本團隊前期利用中國野生山葡萄與北美洲野生葡萄（或砧木品種）開展了砧木雜交育種工作，獲得了大量雜種，在此基礎上對篩選的36個雜種優(yōu)株進行南方根結線蟲的抗性評價，以期為進一步選育抗南方根結線蟲特別是多抗性砧木新品種提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源

2021年5月23日，從陜西省楊凌示范區(qū)大寨鄉(xiāng)西小寨村的日光溫室采集一定數(shù)量的帶有根結線蟲的甜瓜根結用于試驗。

1.1.2 葡萄砧木材料

砧木材料為西北農林科技大學葡萄種質資源圃中保存的6個砧木雜交組合的36個雜種優(yōu)株的一年生無性繁殖盆栽植株（表1）。以翟衡等[16]鑒定為免疫的砧木品種‘5BB’作為抗性對照（CK1），劉三軍等[10]鑒定為高感的栽培品種‘夏黑’作為感病對照（CK2）。

1.2 方法

1.2.1 供試根結線蟲的形態(tài)學鑒定方法

供試根結線蟲蟲源種類的確定：參照前人的試驗方法[17]，分離出甜瓜根結中的根結線蟲，觀察卵和二齡幼蟲的形態(tài)特征并拍照。

供試根結線蟲雌蟲會陰花紋的制作與觀察：隨機選取6條病根中的6條雌蟲，先后做成6個臨時裝片[18]，編號，然后將臨時裝片置于SMZ1500連續(xù)變倍實體顯微鏡帶成像系統(tǒng)的載物臺上，觀察、記錄雌蟲的會陰花紋特征并拍照。

1.2.2 供試根結線蟲的分子生物學鑒定方法

（1）供試根結線蟲的DNA提取與PCR擴增。單頭根結線蟲的DNA提取，采用蛋白酶K法[19]，分別獲取6條雌蟲組織的DNA溶液。用移液槍分別取每一樣品的上清液進行PCR擴增，剩余DNA溶液置于-80 ℃冰箱保存，備用。

采用前人設計的根結線蟲ITS擴增通用引物F195和V5367[20]，序列分別為：5'-TCCTCCGCTAAATGATATG -3'和5'-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3'（由楊凌天潤奧科生物科技有限公司合成），分別對獲取的6條根結線蟲DNA的ITS間隔區(qū)進行PCR擴增。PCR產物采用1.5%的瓊脂糖凝膠，1×TBE作為電泳緩沖液，在紫外燈下觀察拍照，剩余的PCR產物于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）PCR產物測序和同源性比較。電泳結束后，回收目標DNA條帶，送楊凌天潤奧科生物科技有限公司測序。將測定的序列在NCBI數(shù)據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中與已報道的南方根結線蟲序列進行同源性比對分析。

1.2.3 葡萄砧木材料的準備

2020年3月底將冬季沙藏的葡萄枝條取出，剪成15 cm左右?guī)?或3個飽滿芽的插條，上端距離芽眼1 cm剪成平口，下端在芽眼對面剪成馬蹄形，每個株系或品種共計30個插條。用1000 mg·L-1的生根粉溶液浸泡葡萄插條的形態(tài)學下端15 s，然后露地覆膜扦插，每株系（品種）掛牌，對扦插苗進行常規(guī)管理，秋季獲得一年生苗。翌年3月初，按照園土∶蛭石∶有機肥＝28∶6∶3的比例配制營養(yǎng)土，裝入外口徑35 cm的花盆，每個品種（株系）栽植4株，掛牌記錄名稱，然后澆一次透水，之后進行正常的盆栽苗栽培管理。

高中化學的主要研究內容是從微觀的角度研究物質的成分、性質及規(guī)律，這在一定程度上決定了化學知識的抽象難懂，導致學生對化學學習充滿畏懼心理，不愿意主動配合教師的教學活動，而對于強調邏輯思維和動手能力的化學實驗更是敬而遠之，導致在化學實驗教學中學生的參與性較低，不利于化學實驗的有效開展，也不能有效提高學生的科學實驗探究能力。

1.2.4 接種

將實驗室鑒定為帶有南方根結線蟲的甜瓜根結，于2021年5月28日對盆栽葡萄砧木雜種優(yōu)株進行接種。首先將甜瓜受害根部剪成0.5 cm的小段，制備成含有南方根結線蟲的根結，每盆稱取5 g接種[13]，每株系（品種）接種4株。接種時先在盆中植株的四周挖深約10 cm的坑，將根結放入并覆土，然后澆透水，之后進行正常的盆栽苗栽培管理。

1.2.5 取樣

接種80 d后，先把盆栽葡萄植株輕輕倒扣出來，盡量不要損傷根系，取出帶有葡萄植株的土團，輕輕觸散土團，然后將仍帶有較多土團的植株放入水桶中浸泡，待土團完全散開時，輕輕沖洗植株根系，盡量保持根系的完整性。洗凈后，晾干根系表面水分，拍照，并調查病情指數(shù)。

1.2.6 調查方法與抗性等級劃分

每個砧木株系及對照‘5BB’‘夏黑’各調查4株，仔細觀察每條根上的根結癥狀。參照孫海生的方法[14]，將根系的感病程度（嚴重度）劃分為5級：0級，根上無根結；1級，根上有少數(shù)根結；2級，根上大部分有根結；3級，根上大部分有根結，并在蟲瘤上再次形成根結；4級，根結互相聯(lián)結成為根結團塊。統(tǒng)計同一株系4株的每一根系感病程度，按公式將嚴重度換算為病情指數(shù)，確定其抗性等級。

病情指數(shù)＝∑(各病級數(shù)×該級根數(shù))/(最高病級數(shù)×調查總根數(shù))×100。

抗性等級劃分標準參照前人的方法[14]，略有改動，將免疫或極抗改為免疫，其它未做改動。免疫（Immune，I），病情指數(shù)為0；高抗（High resistance，HR），0＜病情指數(shù)≤10；抗（Resistance，R），10＜病情指數(shù)≤20；中等（Middle resistance，MR），20＜病情指數(shù)≤40；感（Susceptibility，S），40＜病情指數(shù)≤60；高感（High susceptibility，HS），病情指數(shù)＞60。

2 結果與分析

2.1 供試根結線蟲的鑒定結果

對采集的甜瓜病根中的根結線蟲進行形態(tài)學鑒定，結果（圖1A-D）顯示，其卵為長橢圓形或腎形；2齡幼蟲呈線狀，無色，透明；雌蟲乳白色，呈梨形或檸檬形；雌蟲的會陰花紋背紋緊密，背弓高，背弓頂部圓或平，有時呈梯形，兩側近乎直角，背面和側面線紋呈波浪形或鋸齒狀，有的平滑。觀察結果與前人描述的南方根結線蟲的特征相一致[21]，初步確認為南方根結線蟲（M. incognita）。

2.1.2 供試根結線蟲的分子生物學鑒定結果

進一步的PCR分析結果（圖1E）顯示，供試甜瓜病根中的6條根結線蟲DNA，均能擴增出750 bp左右的目標條帶。經測序所有樣品的ITS序列長度均為703 bp。序列比對結果表明，其與南方根結線蟲的ITS區(qū)編碼序列具高度同源性，達到98.83%，可以確認所獲取的根結線蟲群體是南方根結線蟲群體。

圖1 供試根結線蟲的形態(tài)觀察與PCR擴增結果Figure 1 Morphological observation and PCR amplification results of tested root-knot nematodes

2.2 葡萄砧木雜種優(yōu)株抗南方根結線蟲的鑒定結果

對供試葡萄材料抗南方根結線蟲的鑒定結果（表1）表明，按照病情指數(shù)，對照‘5BB’表現(xiàn)免疫，與翟衡等[16]的結果相一致；對照‘夏黑’表現(xiàn)高感，與劉三軍等[10]的結果相一致。供試砧木材料對南方根結線蟲的抗性表現(xiàn)可分為6種類型：免疫（I）：HS-2、BBS-1、BBS-2、BBS-4、BBS-5、BBS-7、BBS-9、BBS-10、BBS-11、BBS-12、BBS-15、BBS-16、BBS-17、19-4-3；高抗（HR）：HS-5、TH-1；抗（R）：HS-1、TH-18、TS-21、BBS-13、BBS-14；中抗（MR）：HS-4、HS-9、16-2-5；感（S）：HS-3、HS-10、13-5-2、16-2-7；高感（HS）：HS-12、HS-13、TH-5、TH-7、TH-11、TS-3、TS-4、17-2-1。免疫的占39%，高感的占22%，其余類型占比較少。

表1 不同品種或株系對南方根結線蟲的抗性Table 1 Resistance of different varieties or strains to root-knot nematodes

3 討論與結論

3.1 關于根結線蟲的鑒定方法與分級標準

根結線蟲的鑒定方法主要有形態(tài)學和分子生物學鑒定。形態(tài)學鑒定通常以根結線蟲雌蟲會陰花紋形態(tài)特征為依據[22]。本研究對采集的根結線蟲進行了卵、2齡幼蟲、雌蟲及雌蟲會陰花紋形態(tài)鑒定，且雌蟲會陰花紋形態(tài)特征的鑒定結果與前人的鑒定結果相一致[21]，初步確定為南方根結線蟲群體。由于根結線蟲的形態(tài)特征受寄主與環(huán)境等多種因素的影響，僅依靠形態(tài)學鑒定可能會導致鑒定結果有誤。分子生物學鑒定技術因具有高效性、精確性的特點，而被廣泛應用于根結線蟲的鑒定[23]。進一步的rDNA-ITS-PCR鑒定結果表明，本試驗獲取的根結線蟲群體與已發(fā)表的南方根結線蟲的ITS區(qū)編碼序列同源性達98.83%，可確認屬于南方根結線蟲群體。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同葡萄砧木株系或品種感染根結線蟲病后，根系癥狀存在較大的差異，絕大多數(shù)株系受害后，根系形成念珠狀的小根結，而對照‘夏黑’受害后，根系易形成大的根結瘤，這與不同葡萄品種感染根結線蟲病后的表現(xiàn)癥狀差異較大的研究結果相一致[24]。

關于對南方根結線蟲抗性鑒定的分級標準，目前主要有3種。一是根據根結數(shù)量劃分抗性等級[13]，二是根據根的受害率劃分抗性等級[25]；三是根據危害癥狀劃分抗性等級[14]。此外，還有采用多項指標進行綜合評價[26-27]。邵姍姍等[28]認為，根結的形成代表線蟲的成功寄生，根結的發(fā)生程度可作為評價品種之間抗根結線蟲病強弱的依據。本研究也發(fā)現(xiàn)，僅僅根據根結指數(shù)，結果不十分準確，但可初步判斷葡萄材料對南方根結線蟲抗性的強弱。如果以根系受害百分率來劃分抗性等級，雖然也能在一定程度上反映植株整體根系的受害情況，但不能具體反映植株每條根系被危害的嚴重程度，仍較難區(qū)分抗性的強弱。采用綜合評價標準體系，對親緣關系較遠的植株易受自身植物學特性的影響。因此，根據危害癥狀作為劃分抗性等級或者計算病情指數(shù)的評價體系[14]，則比較適合。

此外，與田間自然鑒定法相比，人工接種鑒定可以克服自然條件的不利影響，如董煒博等人[29]發(fā)現(xiàn)在自然病田鑒定中入選的抗性資源，經進一步鑒定后許多被淘汰。因此，盆栽植株接種鑒定的結果更可靠，適宜于抗性品種的篩選。

3.2 關于葡萄種質資源對南方根結線蟲的抗性

美洲野生葡萄資源中，抗根結線蟲的種主要有河岸葡萄、沙地葡萄及香檳尼葡萄等[13,30]。翟衡等[13]將起源中國的14份野生資源劃分為3類：抗南方根結線蟲資源，包括華東葡萄、福建葡萄、毛葡萄、萬縣野葡萄和蛇葡萄屬中的烏頭葉葡萄；中度感病資源，包括大部分常見資源，如山葡萄、燕山葡萄、蘡薁葡萄、華北葡萄、刺葡萄及復葉葡萄；高度感病資源，包括小果野葡萄、葛藟和蛇葡萄屬中的葉蛇葡萄。

葡萄砧木資源對南方根結線蟲的抗性，根據前人的研究結果可分為4類[14,31-33]，即非常敏感：Vinifera（特別是白玉霓、Cot、品麗珠、Aramon Noir、Pinots Silvaner），1202C、AVG、143A、41B、333EM等；敏感：3309C、161-49C、196-17CL、216-3CL等；基本抗：3306C、101-14、Rupestris du Lot、Riparia Glorie、110R等；抗：Beanmont、775A、1103P、VR043-43、99R、140R、VR039-16、420A、SO4、5C、44-53M、1613C、5BB、貝達、狗脊、鹽河、和諧、自由和無毛河岸葡萄等。

在葡萄栽培品種中，山歐雜種‘北紅’‘北醇’‘北全’‘熊岳白’均不抗南方根結線蟲[10]。歐美雜種‘巨峰’‘夏黑’‘陽光玫瑰’及歐亞種品種‘紅地球’‘維多利亞’等全部為高感類型[10,14,24]。

生產上主要采用嫁接栽培的方法解決南方根結線蟲的危害問題，因此選育抗南方根結線蟲的砧木新品種具有重要意義。山葡萄是葡萄屬中最抗寒的種[34]，前人鑒定認為山葡萄為中等感染南方根結線蟲[13]，本研究選用中國野生山葡萄作為親本之一，與起源于北美洲的抗根結線蟲資源[14,16]河岸葡萄、沙地葡萄及砧木‘5BB’‘貝達’進行種間雜交，以期選育抗寒、抗南方根結線蟲的砧木新品種。由于親本的親緣關系較遠，植物學特性特別是對南方根結線蟲的抗性不同[13-14,16]，有可能表現(xiàn)雜種優(yōu)勢。本研究中，5BB×山葡萄黑龍江實生組合后代的抗性都為免疫或抗，說明可能存在母性遺傳。其它組合后代出現(xiàn)了抗性分離的現(xiàn)象，如河岸葡萄（♀）×山葡萄左山75097組合后代的抗性中既有免疫類型HS-2，也有高感類型HS-12和HS-13；山葡萄泰山-11×河岸-2組合、貝達×山葡萄左山75097組合后代的抗性也有類似的分離現(xiàn)象，說明種間雜交是創(chuàng)造抗南方根結線蟲新種質的重要途徑。因此，下一步將對篩選的抗性優(yōu)株進行嫁接試驗，以期選育出抗南方根結線蟲特別是多抗性砧木新品種。

3.3 結論

供試的36個砧木雜種優(yōu)株對抗南方根結線蟲的抗性表現(xiàn)免疫14個株系，高抗2個株系，抗5個株系，中等3個株系，感4個株系，高感8個株系。其中組合5BB×山葡萄黑龍江實生后代中抗性更偏向于免疫或高抗，免疫的比例為86%，抗的比例為14%。篩選獲得的抗南方根結線蟲類型為進一步選育多抗性葡萄砧木新品種奠定了材料基礎。