六個葡萄砧木品種（系）的抗寒性評價

郭艷蘭，牟德生，趙連鑫，王鑫，馬宗桓，張兆銘，張利年

（1. 武威市林業(yè)科學研究院，甘肅武威 733000；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學園藝學院，甘肅蘭州 730070）

武威市地處河西走廊東端，其獨特的地理位置和氣候條件，為釀制優(yōu)質葡萄酒提供了絕佳的先天環(huán)境，使得武威成為全國釀酒葡萄九大產(chǎn)區(qū)之一。但武威產(chǎn)區(qū)冬季寒冷干燥，低溫凍害發(fā)生頻繁，葡萄需要下架埋土才能越冬，增加生產(chǎn)成本的同時也限制了該區(qū)域釀酒葡萄產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。因此，探索提高葡萄抗寒能力的行之有效的措施成為當前武威地區(qū)釀酒葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展急需解決的關鍵問題。

葡萄砧木的抗寒性是其實現(xiàn)利用價值的關鍵之一，采用抗寒砧木進行嫁接不僅能提高葡萄的抗寒能力，還可以提高樹體營養(yǎng)、改善果實品質，對產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的促進作用[1-3]。目前，有關釀酒葡萄砧木的抗寒性已開展了較多的研究，如牛鐵荃等[4]以不同葡萄砧木的實生苗葉片為研究對象，測定了相對電導率及相關生理生化指標，并利用灰色關聯(lián)分析、隸屬函數(shù)、聚類分析等方法對其耐寒性開展了評價；李妍琪等[5]對葡萄砧木的4個雜交組合的親本及后代開展了抗寒性鑒定；李鵬程等[6]以8種葡萄砧木為試材，研究了低溫脅迫下的失水速率、萌芽率等，并比較了LT50與隸屬函數(shù)法綜合評價結果的一致性；鐘海霞等[7]對7個葡萄砧木根系的抗寒性進行了研究。而武威產(chǎn)區(qū)有關葡萄砧木抗寒性的綜合分析及評價較少。本文以從法國和意大利引入的6個釀酒葡萄砧木品種（系）為材料，在人工模擬低溫條件下，測定其相對電導率、丙二醛（MDA）等相關生理生化指標，并采用隸屬函數(shù)法對其抗寒性進行綜合分析及評價，以期篩選出抗寒性強的砧木品種（系），為該地區(qū)葡萄抗寒砧木的選擇及利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試砧木品種（系）為SO4-762、SO4-102、CFS57-34、P40-151、101-141、1103P-113，均采自武威市民勤縣甘肅夏博嵐葡萄種植基地，2015年從法國和意大利引入。樹體5年生，栽植密度0.5 m×3 m，廠字形架式， 田間管理水平一致，植株生長良好。2020年10月冬剪時采集粗度1 cm、生長健壯的一年生成熟枝條，帶回武威市林業(yè)科學研究院恒溫庫沙藏備用。

1.2 試驗處理

將沙藏枝條取出沖洗干凈，剪成10 cm左右小段，分別裝入自封袋中并做好標記，置于高低溫試驗箱（型號：LRHS-101A-LJ）中進行低溫處理，先以4 ℃·h-1的速率緩慢降至目的溫度，保持24 h后再以相同速率升至4 ℃，取出置于4 ℃冰箱保存待測。共設置-14、-18、-22、-26、-30 ℃ 5個低溫處理，以4 ℃為對照。

1.3 測定指標及方法

相對電導率：用修枝剪將低溫處理過的枝條避開芽眼剪成約1 mm厚的薄片，混合均勻后稱取1 g置于25 mL試管中，加入20 mL蒸餾水，加蓋于室溫靜置4 h，用DDSJ-308A型電導率儀測定初始電導率，測前搖勻；于沸水中煮30 min，冷卻至室溫后測定終電導率，計算相對電導率（相對電導率＝初始電導率/終電導率×100%）和低溫半致死溫度（LT50）[8]，并進行曲線擬合，擬合方程如下：

其中，Y代表相對電導率，a、b為方程參數(shù)，K為常數(shù)，代表最大電解質滲出率，由于Y是累積頻率，此處K取100，LT50即方程拐點，計算方式為：

生理生化指標：將各處理枝條剪成2～3 mm薄片，用液氮冷凍后迅速將枝條粉碎，置于-80℃冰箱保存用于測定生理生化指標。MDA、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量及過氧化氫酶（CAT）活性均采用武漢純度生物酶聯(lián)免疫分析試劑盒（ELISA）進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Microsoft Office進行數(shù)據(jù)整理和制圖、SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)分析。

抗寒性的綜合分析與評價采用隸屬函數(shù)法[9-10]進行，計算公式如下：

式中，U(Xij)為測定i品種j指標的抗寒隸屬函數(shù)值，Xij為i品種j指標的測定值，Xjmin為j指標的最小值，Xjmax為j指標的最大值，i表示品種，j表示抗寒指標。

2 結果與分析

2.1 低溫處理對葡萄砧木枝條相對電導率的影響

低溫處理后各砧木品種（系）的相對電導率變化如圖1所示，隨著溫度的降低，各砧木枝條的相對電導率均呈上升趨勢，且升高趨勢各有不同。在-18～4 ℃時，各品種（系）相對電導率隨處理溫度的降低表現(xiàn)緩慢上升，其中，101-141上升幅度最小，1103P-113次之，P40-151上升幅度最大；隨著溫度的繼續(xù)降低，各品種（系）的相對電導率上升幅度增加，-22 ℃時變化最為明顯；-30～-26 ℃溫度處理時，各品種（系）相對電導率隨溫度降低繼續(xù)升高但幅度變緩；在低溫處理過程中，P40-151的相對電導率隨溫度降低的增幅最大，CFS57-34的相對電導率隨溫度降低的增幅最小，且-30 ℃溫度處理后，101-141的相對電導率最大，P40-151次之，而CFS57-34的相對電導率最小。

圖1 低溫處理下不同砧木品種枝條的相對電導率Figure 1 Relative conductivity in branches of different rootstock under low temperature treatments

2.2 Logistic模型建立及低溫半致死溫度

根據(jù)試驗溫度范圍內各砧木的相對電導率建立Logistic方程，并根據(jù)方程計算半致死溫度LT50，如表1所示。各砧木Logistic方程擬合度R2在0.7272～0.8961，表明所擬合方程具有較高的可靠性，由此計算的LT50真實可用。各砧木的LT50在-25.86～-21.85℃，LT50值越小，說明抗寒性越強。

表1 低溫處理下不同砧木品種枝條的低溫半致死溫度和擬合方程Table 1 LT50 and fitting equation in branches of different rootstock varieties under low temperature treatments

2.3 低溫處理對葡萄砧木枝條生理指標的影響

2.3.1 低溫處理對MDA的影響

低溫處理后各砧木品種（系）枝條的MDA含量變化如圖 2所示，隨著溫度的降低，各砧木枝條的MDA含量均呈上升趨勢。-30～4 ℃低溫處理過程中，P40-151枝條MDA含量升高幅度最快，而CFS57-34枝條MDA含量升高幅度最慢，其余4個品種（系）枝條的MDA含量變化介于二者之間；-30 ℃低溫處理后，P40-151枝條的MDA含量顯著高于其他品種（系），而CFS57-34枝條的MDA含量顯著低于其他品種（系）。

圖2 低溫處理下不同砧木品種枝條的MDA含量Figure 2 MDA content in branches of different rootstock under low temperature treatments

2.3.2 低溫處理對游離脯氨酸影響

如圖3所示，隨著溫度的降低，各砧木品種（系）枝條的游離脯氨酸含量均呈先上升后下降的趨勢，但變化幅度各不相同。4 ℃時1103P-113枝條的游離脯氨酸含量最高，而SO4-762枝條的游離脯氨酸含量最低；當處理溫度降至-22 ℃，101-141、CFS57-34枝條的游離脯氨酸急劇升高且達到最高，而其余各品種（系）枝條的游離脯氨酸隨著溫度的繼續(xù)降低持續(xù)增加，至-26 ℃時，SO4-762、SO4-102、P40-151、1103P-113枝條的游離脯氨酸含量達到最高，后隨溫度的繼續(xù)降低，各砧木的游離脯氨酸含量持續(xù)降低。低溫處理過程中，101-141、CFS57-34枝條游離脯氨酸含量隨溫度降低的增幅較大，SO4-102、P40-151枝條游離脯氨酸含量隨溫度降低的增幅較小。

圖3 低溫處理下不同砧木品種枝條的游離脯氨酸Figure 3 Freee proline content in branches of different rootstocks under low temperature treatments

2.3.3 低溫處理對可溶性糖的影響

由圖4可知，不同砧木枝條的可溶性糖含量隨著處理溫度的降低持續(xù)增加。4 ℃時CFS57-34枝條的可溶性糖含量最低，其次為1103P-113，而P40-151枝條的可溶性糖含量最高。隨著處理溫度的不斷降低，各砧木枝條可溶性糖含量快速升高，至-30 ℃時達到最高水平，且CFS57-34枝條的可溶性糖含量最高，且顯著高于其他砧木品種（系），101-141枝條的可溶性糖含量最低，但與其余4個品種（系）無明顯差異。

圖4 低溫處理下不同砧木品種枝條的可溶性糖含量Figure 4 Soluble sugar content in branches of different rootstocks under low temperature treatments

2.3.4 低溫處理對可溶性蛋白的影響

由圖5所示，各品種（系）枝條的可溶性蛋白含量隨溫度降低逐漸升高。4 ℃時，CFS57-34枝條的可溶性蛋白含量最高，其次為SO4-762，而SO4-102的可溶性蛋白含量最低，且顯著低于其余各品種（系）。隨著溫度的降低，各品種（系）枝條的可溶性蛋白含量出現(xiàn)不同程度的增加，至-30 ℃時增至最高，其中，1103P-113的可溶性蛋白含量最高，其次為CFS57-34，二者無明顯差異，P40-151的可溶性蛋白含量最低。

圖5 低溫處理下不同砧木品種枝條的可溶性蛋白Figure 5 Soluble protein content in branches of different rootstocks under low temperature treatments

2.3.5 低溫處理對CAT活性的影響

由圖6可以看出，不同砧木枝條的CAT活性隨溫度的變化不同。SO4-102和P40-151枝條的CAT活性隨溫度降低先升高后下降。在-22 ℃時升至最高水平，而后隨著溫度的繼續(xù)降低出現(xiàn)下降；其余4個品種枝條的CAT活性隨溫度降低持續(xù)上升，至-30 ℃時達到最高，且1103P-113、CFS57-34的CAT活性顯著高于其他品種，而P40-151的CAT活性最低。

圖6 低溫處理下不同砧木品種枝條的CAT活性Figure 6 CAT activity in branches of different rootstocks under low temperature treatments

2.4 不同砧木品種抗寒性分析

采用隸屬函數(shù)法對6個葡萄砧木品種（系）枝條的相對電導率及各抗寒相關生理指標進行綜合分析及評價，結果見表2。根據(jù)抗寒指標的平均隸屬函數(shù)值大小可知，各砧木品種的（系）抗寒性由強到弱依次為：CFS57-34＞1103P-113＞101-141＞SO4-762＞SO4-102＞P40-151。

表2 不同砧木品種各抗寒指標的隸屬函數(shù)值Table 2 Subordination value of cold resistance indexs of different rootstock varieties

3 討論與結論

低溫會破壞植物細胞的結構與功能，使細胞質膜發(fā)生改變，細胞內離子、糖類等物質會出現(xiàn)外滲，從而導致電解質的升高[11]。細胞電解質的外滲程度可用相對電導率來表示，且相對電導率越高，表明細胞內的電解質外滲越多，細胞膜的透性越大，也說明植株細胞膜受到傷害的程度越大，抗寒能力越弱[12]。目前，利用相對電導率法對果樹抗寒性進行研究已得到了廣泛應用[13-17]。本文測定結果顯示，各砧木枝條的相對電導率均隨溫度的降低而升高，且相對電導率隨溫度降低的增幅越多，抗寒性越弱，反之抗寒性越強。這與前人研究結果一致[18-20]。根據(jù)Logistic方程預測得出6個葡萄砧木品種（系）枝條的半致死溫度在-25.86～-21.85℃，部分品種的低溫半致死溫度與劉鈺璽等[18]的研究結果有一定差異，這主要與枝條的低溫處理方式、相對電導率的測定方法等因素有關。

植物的生理生化指標與其抗寒性有著密切聯(lián)系[21]。植物在受到低溫脅迫時，可以通過調節(jié)體內的生理生化過程來誘導自身細胞代謝向著適應低溫的方向發(fā)展，從而提高抗寒能力[19]。MDA是膜脂過氧化反應的最終產(chǎn)物，是植物細胞膜系統(tǒng)受害的重要標志之一，其含量的增加與植物的受害程度有極顯著的相關性[22-23]。研究結果表明，隨著溫度的降低，各品種（系）砧木枝條的MDA含量均逐漸升高，其中，P40-151枝條MDA含量增幅最快且最終維持在較高水平，而CFS57-34枝條MDA含量增幅最慢且維持在較低水平，這與相對電導率變化一致，也進一步證實了MDA變化與其抗寒性的關系[24-25]。

游離脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白是植物體內重要的滲透調節(jié)物質，與植物的抗寒性密切相關。游離脯氨酸的積累可以提高植物體內滲透壓，增強保水力，提高植物的抗寒性[26]；可溶性糖含量的增加可使植物細胞液濃度升高，降低冰點溫度，可溶性蛋白具有較高的親水性，其含量與可溶性糖含量密切相關，因此常被作為植物抗寒性鑒定的重要指標[27-28]。本研究中，各品種（系）砧木枝條的游離脯氨酸含量隨溫度的降低先上升后下降，可溶性糖含量和可溶性蛋白含量隨溫度的降低而升高，且抗寒性較強的品種其脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量隨溫度的降低升高較快，并且最終保持在較高水平，而抗寒性較弱的品種則正好相反，脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量的升高較慢且水平較低。這與施明[12]、鐘海霞[29]、付曉偉[30]等的研究結果基本一致，說明在遭受低溫脅迫時，葡萄枝條可以通過代謝增加體內的滲透調節(jié)物質，以此來保護機體免受低溫傷害。

CAT是植物體內的活性氧化保護酶之一，低溫環(huán)境下，它可以通過自身的調控來保護植株，以減輕植物的低溫損傷。在本研究中，SO4-102和P40-151枝條的CAT活性隨溫度降低先升高后下降，而其余品種枝條的CAT活性隨溫度降低持續(xù)上升，表明在一定的低溫范圍內，葡萄枝條可以通過提高氧化防御酶活性來增強自身的耐寒能力，但當?shù)蜏爻隽嗽撈贩N的耐受范圍時，細胞膜受到損害，酶活降低，這主要與砧木品種（系）的抗寒能力強弱有關[31-32]。

與植物抗寒性相關的指標有很多，單一的某個指標具有片面性，在植物抗寒性研究中，通常需要對多個抗寒指標進行綜合分析，以此來判斷其抗寒性[33,31,29]。本文采用隸屬函數(shù)法對6個砧木品種（系）的抗寒性進行了綜合分析，得出各品種（系）的抗寒性強弱順序為CFS57-34＞1103P-113＞101-141＞SO4-762＞SO4-102＞P40-151，這與預測得出的各砧木品種（系）的LT50排序略有差異，可能與LT50為單一指標有關。

綜合以上表明，法國和意大利引入武威地區(qū)的6個釀酒葡萄砧木品種（系）中，CFS57-34的抗寒性最強，1103P-113、101-141、SO4-762、SO4-102的抗寒性較強，P40-151的抗寒性最弱。