葡萄膨果肥最佳施用時(shí)期判斷與生物標(biāo)記的開發(fā)

王令宇，劉司瑜，楊毓賢，王子誠(chéng)，房經(jīng)貴，上官凌飛

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/江蘇省果樹品種改良與種苗繁育工程中心，江蘇南京 210095）

根據(jù)《中國(guó)農(nóng)業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，截止到2019年，我國(guó)葡萄栽培面積已經(jīng)達(dá)到726.20 hm2，僅次于柑橘、蘋果和梨，居于第四位。葡萄是需肥量比較大的果樹，化肥的不合理使用，不僅會(huì)造成肥料的浪費(fèi)，也會(huì)造成環(huán)境的污染。肥料的精準(zhǔn)施用既可以節(jié)約肥料，均衡土壤養(yǎng)分，又可以減少環(huán)境污染，增加葡萄產(chǎn)量。

葉面施肥操作簡(jiǎn)單、用量少，同時(shí)具有肥效快、利用率高、對(duì)環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。在葉面施肥過(guò)程中可以結(jié)合農(nóng)藥噴施，在一定程度上能夠減少勞動(dòng)力的投入[3]。磷鉀是植物生長(zhǎng)必需的元素，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用，對(duì)葡萄果實(shí)的發(fā)育尤為重要[4-5]。因此，在葡萄果實(shí)膨大前噴施KH2PO4可促進(jìn)其迅速膨大，但是生產(chǎn)上對(duì)其噴施時(shí)期不能精準(zhǔn)把控，造成肥料浪費(fèi)等問(wèn)題。因此，葡萄精準(zhǔn)施肥在產(chǎn)業(yè)提檔升級(jí)和高質(zhì)量發(fā)展中顯得尤為重要。

基因的表達(dá)早于生物體性狀的變化，利用基因信息開發(fā)的生物標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物（花斑裸鯉等）、植物（水稻、菠菜、亞麻等）、人類（遺傳疾病等）等[6-10]。近幾年，已有相關(guān)研究報(bào)道指出，基于基因表達(dá)信息變化開發(fā)的生物標(biāo)記可以用于指導(dǎo)葡萄生產(chǎn)，如利用葡萄氮代謝基因的表達(dá)評(píng)價(jià)不同氮肥肥效、利用鉀吸收相關(guān)基因評(píng)價(jià)葡萄葉面肥的效果和濃度、利用葡萄花果相關(guān)基因的表達(dá)情況來(lái)指導(dǎo)施肥等[11-14]。磷肥和鉀肥是葡萄果實(shí)膨大期所需的主要肥料，本研究選擇了7個(gè)磷鉀吸收相關(guān)的基因用于生物標(biāo)記的開發(fā)。其中，VvKUP1、VvKUP2屬于KUP家族鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體，其功能是促進(jìn)植物對(duì)鉀的吸收和維持細(xì)胞內(nèi)K+濃度。VvSORK、VvSIRK屬于shaker家族，VvSIRK為shaker家族內(nèi)向整流K+通道基因，主要功能為低親和吸收K+。VvSORK為shaker家族外向整流K+通道基因，VvPHT1-4、VvPHT2-1屬于PHT基因家族，為高親和力磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要作用是從外界環(huán)境攝取磷酸鹽。磷調(diào)節(jié)子VvPHO1屬于高親和力磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因，增加植物磷元素的吸收[15-18]。本研究以‘陽(yáng)光玫瑰’‘巨峰’葡萄為試材，在分子水平研究葉面噴施磷鉀肥的最佳時(shí)期，開發(fā)相關(guān)的生物標(biāo)記，對(duì)葡萄的精準(zhǔn)施肥具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料來(lái)源

試驗(yàn)位于淮安市盱眙縣穆店鎮(zhèn)，江蘇省龍誠(chéng)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司基地?！薹濉汀?yáng)光玫瑰’葡萄均為3年生，大H架設(shè)施栽培。園區(qū)為智能水肥一體化管理，土壤pH為5.8，有效磷含量為29.1 mg·kg-1、速效鉀含量為51.4 mg·kg-1。

KH2PO4購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京TaKaRa有限公司。熒光定量染料SYBR GreenⅠ購(gòu)自上海浦迪生物科技有限公司。所用引物由北京通用生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成（表1）。

1.2 肥料噴施處理

選取大面積種植園區(qū)，每個(gè)品種分別在坐果后7 d（6月7日，AFS7）、11 d（6月11日，AFS11）、15 d（6月15日，AFS15）選取發(fā)育基本一致的植株，選擇陰天或者上午9:00前對(duì)葡萄葉片正反面均勻噴施0.3%KH2PO4溶液，以葉面下滴溶液為止，每處理3次重復(fù)。4個(gè)處理記為T1（AFS7）、T2（AFS11）、T3（AFS15）和噴施清水的對(duì)照CK。在AFS3（6月3日）、AFS7（6月7日）、AFS11（6月11日）、AFS15（6月15日）、AFS19（6月19日）噴施之前采集第8～9節(jié)位的成熟葉片，并用液氮處理，放-80 ℃冰箱，用于測(cè)定葉片內(nèi)磷鉀吸收相關(guān)基因的表達(dá)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 生理指標(biāo)

每個(gè)處理在噴施前采樣一次和噴施后每4 d隨機(jī)采集30粒果，最后一次采樣為坐果后27 d，用于果實(shí)縱橫徑以及粒質(zhì)量的測(cè)量。穗質(zhì)量和粒質(zhì)量用電子天平稱量，精確到0.01 g，取平均值。用游標(biāo)卡尺隨機(jī)測(cè)量各個(gè)處理5粒果實(shí)的縱徑和橫徑，精確到0.01 cm，取均值。

1.3.2 RNA提取與cDNA的合成

總RNA提取采用改良CTAB法[19]，DNA去除使用TaKaRa試劑盒，RNA濃度使用超微量分光光度計(jì)（型號(hào)為Nanodrop-100a）檢測(cè)，完整性使用瓊脂糖電泳檢查。以提取的RNA為反轉(zhuǎn)錄模版，使用TaKaRa試劑盒（型號(hào)為ES10）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，所得cDNA置于-20℃貯藏，用于基因表達(dá)趨勢(shì)分析。

1.3.3 熒光定量PCR

利用Primer Premier 5.0軟件，分別設(shè)計(jì)看家基因以及與磷鉀吸收相關(guān)基因：Shaker家族內(nèi)向整流鉀離子通道（inward rectifying shaker-like K+channel, VvSIRK）、shaker家族外向整流鉀離子通道（shaker-like potassium channel, VvSORK）[12]；磷轉(zhuǎn)運(yùn)體1-4（phosphate transporters1-4,VvPHT1-4）、磷轉(zhuǎn)運(yùn)體2-1（phosphate transporters2-1,VvPHT2-1）、木質(zhì)部磷離子轉(zhuǎn)載轉(zhuǎn)運(yùn)體1（Xylem phosphorusion transporter1,VvPHO1）、鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因1（Potassium protein, VvKUP1）、鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因2（Potassium protein, VvKUP2）等基因的定量PCR引物見(jiàn)表1。

以葡萄看家基因Actin為內(nèi)參，按照SYBR Premix ExTaqTM試劑盒說(shuō)明書，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtime quantitative PCR, RT-qPCR）方法測(cè)定基因的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系分為（1）擴(kuò)增體系：cDNA 1.0 μL，上下游引物為0.8 μL（表1），反應(yīng)MIX 10 μL，ddH2O 7.4 μL，總體系是20 μL。（2）程序是：95 ℃變性1 min，Tm退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，退火溫度58 ℃，反應(yīng)結(jié)束后分析融解曲和熒光值變化曲線。3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel和LinReg PCR[13]軟件分析，采用2-△CT計(jì)算方法，以CK計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Fluorescent quantitative PCR primers

2 結(jié)果分析

2.1 不同時(shí)期噴施KH2PO4對(duì)果?？v橫徑的影響

由表2可以看出，T3處理‘巨峰’果實(shí)縱徑和橫徑與CK差異顯著，縱徑增加大約21%，橫徑增加大約10%。由表2可以得到，經(jīng)施肥處理的‘陽(yáng)光玫瑰’果實(shí)的縱橫徑與CK相比增加明顯，尤其是T3處理效果最好，縱徑與CK相比增加約17%，橫徑增加約15%。結(jié)果表明，在不同時(shí)期噴施的KH2PO4均促進(jìn)了果實(shí)縱橫徑的增加，以T3效果最好。

表2 不同時(shí)期噴施KH2PO4對(duì)果實(shí)縱橫徑的影響Table 2 Effect of spraying KH2PO4 in different times on fruit vertical and horizontal diameter

2.2 不同時(shí)期噴施KH2PO4對(duì)果粒質(zhì)量的影響

葡萄果實(shí)粒質(zhì)量是評(píng)價(jià)果實(shí)外觀品質(zhì)的重要參考，也是本試驗(yàn)最重要的一個(gè)指標(biāo)。結(jié)果顯示，葉面噴施磷鉀肥均有效的增加了果粒質(zhì)量?！薹濉訲3施肥效果最好，如圖1A施肥處理較對(duì)照處理差異明顯，在噴后27 d，T3處理粒質(zhì)量已經(jīng)超過(guò)5 g，對(duì)照組不足4 g，增加約25%。‘陽(yáng)光玫瑰’也是第3次施肥效果最好，如圖1B，T3（AFS15）處理在噴后27 d時(shí)果實(shí)粒質(zhì)量達(dá)到了6.5 g以上，對(duì)照為5.5 g左右，增加大約為18%。

圖1 不同時(shí)期噴施磷酸二氫鉀對(duì)兩品種果粒質(zhì)量的影響Figure 1 Effect of spraying KH2PO4 on fruit weight in different periods

2.3 不同時(shí)期葡萄葉片磷鉀吸收基因的表達(dá)情況

2.3.1 不同時(shí)期‘陽(yáng)光玫瑰’葉片磷鉀吸收基因的表達(dá)

通過(guò)對(duì)‘陽(yáng)光玫瑰’5個(gè)時(shí)期的葉片進(jìn)行基因表達(dá)趨勢(shì)分析（圖2）可得：磷鉀吸收基因VvKUP1的表達(dá)趨勢(shì)先上升再下降，以AFS7表達(dá)量最高；VvKUP2的表達(dá)趨勢(shì)先降低再上升再降低，以AFS3和AFS11表達(dá)量較高。VvSORK的表達(dá)趨勢(shì)總體下降；VvPHT1-4的表達(dá)趨勢(shì)是先下降再上升，在AFS15表達(dá)量達(dá)到最大值然后下降。VvSIRK基因的表達(dá)趨勢(shì)是先上升再下降，以AFS11和AFS15表達(dá)量較高。VvPHT2-1表達(dá)趨勢(shì)是先下降再上升再下降，以AFS3表達(dá)量最高。VvPHO1基因的表達(dá)趨勢(shì)是先上升再下降，再上升，以AFS19表達(dá)量最高。經(jīng)過(guò)表型數(shù)據(jù)可得‘陽(yáng)光玫瑰’最佳的施肥處理為T3，即花后15 d施肥最佳。此時(shí)，VvKUP2、VvPHT2-1基因表達(dá)趨勢(shì)表現(xiàn)為在AFS11上升、在AFS15下降；VvPHO1的表達(dá)趨勢(shì)都為AFS11下降，AFS15上升，VvPHT1-4的表達(dá)趨勢(shì)則為在AFS15突然上升并表達(dá)量到達(dá)最大值。

圖2 坐果后‘陽(yáng)光玫瑰’葉片磷鉀吸收基因的表達(dá)情況Figure 2 Expression of phosphorus and potassium genes in leaves of 'Shine Muscat' after fruit setting

2.3.2 不同時(shí)期‘巨峰’葉片磷鉀吸收基因的表達(dá)情況

圖3顯示，磷鉀相關(guān)基因在不同時(shí)期葉片的表達(dá)量不同，這可能與植株在各個(gè)時(shí)期所吸收的營(yíng)養(yǎng)元素有關(guān)?！薹濉汀?yáng)光玫瑰’的磷鉀吸收相關(guān)基因的表達(dá)趨勢(shì)大致相同，如‘陽(yáng)光玫瑰’和‘巨峰’在最佳施肥時(shí)期時(shí)，VvKUP1基因都表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)，VvPHO1的表達(dá)量都表現(xiàn)為先下降再上升的趨勢(shì)，VvSORK總體表現(xiàn)為下降的趨勢(shì)，VvPHT1-4、VvPHT2-1基因都是先下降再上升再下降的趨勢(shì)，VvSIRK表達(dá)量都是先上升后下降。VvKUP2基因的表達(dá)量在‘巨峰’中表現(xiàn)為先升高再降低，而在‘陽(yáng)光玫瑰’中表現(xiàn)為先降低再上升再降低。經(jīng)過(guò)縱橫徑和粒質(zhì)量分析可得，‘巨峰’最佳的施肥處理為T3，VvKUP2、VvSORK基因的表達(dá)趨勢(shì)都表現(xiàn)為AFS11表達(dá)量上升、AFS15表達(dá)量下降；VvPHT2-1和VvPHO1的表達(dá)趨勢(shì)都為AFS711先下降，在坐果后AFS15再上升。

圖3 坐果后‘巨峰’葉片磷鉀吸收基因的表達(dá)情況Figure 3 Expression of phosphorus and potassium genes in leaves of 'Kyoho' after fruit setting

2.4 生物標(biāo)記的開發(fā)與利用

2.4.1 生物標(biāo)記的開發(fā)

通過(guò)對(duì)‘陽(yáng)光玫瑰’和‘巨峰’果實(shí)粒質(zhì)量和縱橫徑分析，確定出最佳施肥日期，再結(jié)合基因表達(dá)趨勢(shì)分析結(jié)果可以得出，VvSORK和VvKUP2基因的表達(dá)趨勢(shì)由上升轉(zhuǎn)為下降，VvPHO1和VvPHT1-4基因的表達(dá)趨勢(shì)由下降轉(zhuǎn)為上升，且VvPHO1/VvPHT2-1的比值為3～4，VvPHT1-4/VvPHT2-1的比值為27～35時(shí)為最佳施肥日期（圖4）。綜合考慮可以作為確定最佳噴施膨果肥日期的判定依據(jù)，達(dá)到減肥增效的目的。

圖4 坐果后葉片VvPHO1-4/VvPHT2-1和VvPHO1/VvPHT2-1的比值Figure 4 The ratio of VvPHO1-4/VvPHT2-1 and VvPHO1/VvPHT2-1 of leaves after fruit setting

2.4.2 生物標(biāo)記的利用

當(dāng)‘巨峰’‘陽(yáng)光玫瑰’果實(shí)坐果后，每隔3 d采集一次葉片，用于RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行熒光定量RCR分析是否符合標(biāo)記規(guī)律。若符合，立即葉面噴施KH2PO4，此時(shí)噴施促進(jìn)果實(shí)膨大效果最好，流程見(jiàn)圖5。

圖5 生物標(biāo)記使用示意圖Figure 5 Biomarker diagram of biomarker utilization

3 討論

磷、鉀元素在植物細(xì)胞中較為豐富，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的影響，如促進(jìn)光合作用、維持滲透壓、調(diào)節(jié)氣孔和細(xì)胞伸長(zhǎng)、提高葉片葉綠素含量等[20-21]。葉面施肥技術(shù)已經(jīng)在番茄、小麥、棉花等作物上廣泛使用和深入研究[22-24]。葡萄葉面噴施是彌補(bǔ)土壤缺肥的有效措施，具有利用率高、效果顯著、用肥少、見(jiàn)效快的特點(diǎn)[25-26]。本研究表明，對(duì)‘陽(yáng)光玫瑰’‘巨峰’葉面噴施磷鉀肥均促進(jìn)葡萄果實(shí)縱橫徑的增加和粒質(zhì)量的提高。

肥料施用的種類、濃度和時(shí)期是決定葉面肥效果的關(guān)鍵因素。不同時(shí)期的葡萄對(duì)磷鉀肥的要求不同，傳統(tǒng)施肥時(shí)期是基于樹木生長(zhǎng)確定磷肥和鉀肥的需求判斷，屬于經(jīng)驗(yàn)判斷，很難做到精準(zhǔn)施肥[22-23]。傳統(tǒng)施肥不僅沒(méi)有最佳的施肥效果，也造成了肥料的浪費(fèi)和環(huán)境的污染。開發(fā)用于施肥最佳時(shí)期判定的生物標(biāo)記，利用分子診斷方法提前預(yù)測(cè)和精準(zhǔn)判斷樹體生理狀況，可以做到精準(zhǔn)施肥，減少肥料浪費(fèi)[24-25]。

生物標(biāo)記能夠精準(zhǔn)鑒定有機(jī)體的生命狀態(tài)和生理階段，預(yù)判某種疾病是否存在[26-27]。隨著農(nóng)業(yè)科技的不斷發(fā)展，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)逐步由“傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)”過(guò)渡走向“精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)”。農(nóng)業(yè)對(duì)精準(zhǔn)的要求以及生物標(biāo)記在生命體特征預(yù)判上的優(yōu)越性促進(jìn)了生物標(biāo)記在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，已經(jīng)成為精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)的重要依據(jù)。有很多研究證據(jù)表明，利用相關(guān)基因的表達(dá)情況，可以預(yù)測(cè)植物的營(yíng)養(yǎng)狀況[1,28-32]?；蛐畔⒖梢跃珳?zhǔn)地反映植物體各種生理狀態(tài)，可以作為精準(zhǔn)施肥的依據(jù)。

李傲等[29]研究表明，在葡萄果實(shí)膨大期噴施0.3%的KH2PO4的效果最好，可以促進(jìn)果實(shí)膨大。在葡萄對(duì)磷鉀元素的研究中，主要聚集在根系吸收磷鉀元素和不同鉀肥種類對(duì)葡萄果實(shí)品質(zhì)的影響上，對(duì)于葉面噴施磷鉀肥最佳時(shí)期的判斷研究不多[33-37]。本試驗(yàn)在果實(shí)膨大期進(jìn)行葉面噴施KH2PO4，測(cè)定果實(shí)的粒質(zhì)量和縱橫徑，并采集不同時(shí)期的葉片用于測(cè)定葉片中磷鉀吸收相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)合生理和基因表達(dá)，篩選出一套可用于提前預(yù)測(cè)噴施膨果肥的最佳時(shí)期的生物標(biāo)記。將來(lái)，可以開發(fā)快速檢測(cè)試劑盒，結(jié)合高密度田間采樣，實(shí)現(xiàn)葡萄大規(guī)模種植園的精準(zhǔn)施肥管理，達(dá)到減少肥料施用和省工省力的目的。

4 結(jié)論

葉面噴施磷鉀肥可以有效促進(jìn)果實(shí)增大，結(jié)合生理數(shù)據(jù)和基因表達(dá)，篩選出一套可作為噴施磷鉀肥最佳時(shí)期判定的生物標(biāo)記，VvSORK和VvKUP2基因的表達(dá)趨勢(shì)由上升轉(zhuǎn)為下降，VvPHO1和VvPHT1-4基因的表達(dá)趨勢(shì)由下降轉(zhuǎn)為上升，且VvPHO1/VvPHT2-1的比值為3～4，VvPHT1-4/VvPHT2-1的比值為27～35。