酚醛泡沫對蚯蚓及土壤微生物活性的影響

羅秋萍，李虎*，蘇建強

（1.福建農(nóng)林大學資源與環(huán)境學院，福州 350002；2.中國科學院城市環(huán)境研究所，城市環(huán)境與健康重點實驗室，廈門 361021）

酚醛泡沫是由酚醛樹脂、乳化劑、發(fā)泡劑和添加劑在酸堿催化劑作用下合成的多孔徑聚合材料，目前使用較多的添加劑主要包括增塑劑、纖維、微米粒子和納米粒子等。20 世紀50 年代以來，酚醛泡沫被廣泛用于花卉行業(yè)，在植物生長的早期階段作為育苗或繁殖介質(zhì)使用。酚醛泡沫回收成本高，因此使用后直接殘留于土壤，同時酚醛泡沫普遍具有脆性和密度低、易破碎等特點，從生產(chǎn)、使用到處置過程中易破碎形成微塑料（MPs，直徑＜5 mm），并向環(huán)境中釋放具有生物毒性的單體化合物，如酚類化合物和增塑劑等，因此被視為新污染物。

環(huán)境中的MPs 普遍具有溶解度低、持久性強、粒徑范圍廣和性質(zhì)復雜等特點，有研究提出超過60%的MPs是“環(huán)境友好型”，低氧和低光照條件使土壤中的MPs 難以降解，因此MPs 能在土壤中長期存在。已有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境中的塑料碎片在老化期間會釋放出鄰苯二甲酸酯類增塑劑。MPs 污染引起的生物學效應包括物理毒性、氧化應激、細胞損傷、炎癥、免疫反應、DNA 損傷以及神經(jīng)毒性和代謝作用等。目前關于MPs的研究主要針對聚乙烯（PE）、聚苯乙烯（PS）和聚乳酸（PLA）等聚合物。研究發(fā)現(xiàn)大部分塑料碎片對生物具有低致死性。MPs被攝食、消化等過程可能會對環(huán)境產(chǎn)生長期脅迫，改變土壤細菌、真菌的群落組成和功能，影響土壤的碳氮循環(huán)過程。

盡管酚醛樹脂聚合物被廣泛使用的時間比其他塑料聚合物更早，但有關酚醛樹脂對生物毒性作用的研究卻較少。研究發(fā)現(xiàn)酚醛樹脂對大鼠經(jīng)口急性毒性LD＞16 000 mg·kg，該研究提出酚醛樹脂的急性毒性作用很大程度上取決于材料中的游離酚含量。近年來MPs污染引起了廣泛關注，然而關于酚醛泡沫MPs 的研究仍然有限。TRESTRIAL 等研究發(fā)現(xiàn)酚醛泡沫MPs會在淡水和海洋生物體中積累，MPs及其浸出的有毒化合物會影響細胞酶活性。因此，酚醛泡沫的累積殘留可能會對土壤系統(tǒng)造成巨大壓力。蚯蚓是土壤中最大、最常見的類群之一，其普遍存在于各種環(huán)境中，并可通過攝食、消化、排泄、分泌和掘穴等活動影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量傳遞，還可作為土壤環(huán)境的指示生物。由于MPs 具有體積小、易遷移的特性，因此其可能會被土壤動物誤以為是食物而被攝食吸收，從而對動物自身的生長繁殖及其生長環(huán)境產(chǎn)生不良影響。

農(nóng)用酚醛泡沫主要用作蔬菜育苗的栽培基質(zhì)，幼苗移植時該酚醛泡沫連同植物根系一起進入土壤，植物收獲后酚醛泡沫因回收困難而大部分殘留于土壤中，且其外力作用容易破碎形成微小顆粒物。雖然在成分檢測中一些有害物質(zhì)不超標，但易破碎、易遷移的特性使酚醛泡沫施用于土壤后一方面可能會對土壤物理結構及功能造成危害；另一方面，在土壤動物及微生物等的代謝作用下，酚醛泡沫的次生產(chǎn)物可能對土壤動物及其生長環(huán)境造成威脅，影響土壤的新陳代謝。目前對農(nóng)用酚醛泡沫安全性的評價還停留在成分檢測上，有關農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中酚醛泡沫使用對土壤動物及微生物影響的評價仍十分缺乏，從而造成材料安全性評估不夠全面準確。

因此，本文以農(nóng)用酚醛泡沫MPs 為主要試驗對象，參照經(jīng)濟與合作發(fā)展組織（OECD）制定的蚯蚓急性毒性試驗方法，以赤子愛勝蚓為模式土壤動物，應用人工土壤法分別于第7 d和第14 d測定受試物對蚯蚓的急性毒性效應，并探究酚醛泡沫對蚯蚓抗氧化酶活性的影響；測定土壤呼吸速率、中性磷酸酶和脲酶活性，探討不同質(zhì)量濃度酚醛泡沫在土壤中連續(xù)存在64 d后對土壤及功能酶的影響，以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中酚醛泡沫的施用提供重要數(shù)據(jù)支撐，為農(nóng)業(yè)管理提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蚯蚓急性毒性試驗

選用江蘇省句容市王軍蚯蚓養(yǎng)殖場繁殖的同一批次赤子愛勝蚓作為受試生物，試驗前先將蚯蚓在未添加酚醛泡沫的人工土壤中培養(yǎng)馴化7 d，人工土壤具體組分及配比為：70%石英砂，20%高嶺黏土，10%泥炭蘚（以干質(zhì)量計），添加碳酸鈣調(diào)節(jié)pH 為6.5～7.0。各組分混合均勻后，加入去離子水調(diào)節(jié)含水量為35%左右，人工土壤添加0.5%的燕麥作為蚯蚓生活所需營養(yǎng)。在溫度為（20±2）℃的條件進行避光培養(yǎng)，馴化7 d后挑選生殖環(huán)帶明顯且大小一致、質(zhì)量在300～400 mg的蚯蚓清腸，進行毒性試驗。

試驗選用的農(nóng)用酚醛泡沫來自福建天利高新材料有限公司，是由苯酚、甲醛、鄰苯二甲酸酯等物質(zhì)在堿性催化劑下通過高溫發(fā)泡而成的微孔發(fā)泡材料，其孔隙率可達95%，材料內(nèi)部結構均勻，吸水性好（可達95%），保水性和絕熱性能好，植物根系受外界溫度影響小，pH 呈中性，可作為多種植物生長的基質(zhì)。其化學結構詳見MOUGEL 等文獻的描述。本試驗所用酚醛泡沫中的毒性物質(zhì)（如甲醛、苯酚、鄰苯二甲酸酯類等）通過氣相色譜儀（7890A；Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美國）、液相色譜儀（UltiMate 3000；Thermo Scientific，Waltham，美國）和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（2020NX；SHIMADZU，日本）測定，檢測結果均低于檢出限（5 mg·kg），故后續(xù)未進行毒性物質(zhì)檢測。

參照OECD No.207 實驗準則和《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》（GB/T 31270.15—2014）第15 部分，采用人工土壤法分別于第7天和第14天測定蚯蚓的急性毒性，每個重復添加750 g人工土壤（按干質(zhì)量計算），將石英砂525 g、高嶺黏土150 g、泥炭蘚75 g和燕麥3.75 g 裝入白色透明帶蓋塑料盒中，并加入262.5 g 超純水以維持35%的土壤濕度。依據(jù)準則建議設7 個處理組，參照微塑料粒徑（＜5 mm）和已有文獻研究，將酚醛泡沫揉成碎屑，用2 mm 篩網(wǎng)過濾酚醛泡沫顆粒（在實際生產(chǎn)中，該酚醛泡沫大多是以2.2 cm×2.2 cm×1.8 cm 的方塊大小連同植物根系一起進入土壤中，經(jīng)外力作用破碎成顆粒態(tài)物質(zhì)混合進入土壤，表觀形態(tài)與土壤無顯著差別）。酚醛泡沫MPs的添加量分別為1、10、100、1 000 mg·kg；并模擬田間實際使用量，估算該酚醛泡沫使用2 a 和5 a 后的含量作為處理中的高含量組（假設該酚醛泡沫不被降解，模擬小番茄育苗的酚醛泡沫使用量，一年種植5 茬作物，一年的平均使用量約1 g·kg），添加量分別為2 000、5 000 mg·kg。稱取定量的酚醛泡沫MPs（≤2 mm）加入到已混好的人工土壤中，再次攪拌混勻。另設不添加酚醛泡沫的對照組（CK），每個處理設4個重復，每個重復放置10條生長形態(tài)相近且活性較好的赤子愛勝蚓。于恒溫恒濕培養(yǎng)箱（寧波海曙賽福實驗儀器廠，HWS-450）中避光培養(yǎng)，每2～3 d 添加1 次去離子水以保持35%的土壤濕度，溫度為（20±2）℃。分別于培養(yǎng)第7 天和第14 天觀察并記錄蚯蚓的存活數(shù)量，用針輕觸蚯蚓尾部，蚯蚓無反應則為死亡，試驗期間對照組死亡率控制在10%以內(nèi)。

1.2 蚯蚓酶活性的測定

為進一步分析酚醛泡沫MPs 對赤子愛勝蚓的毒性效應，采用人工土壤按照上述生長條件在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)64 d，假設蚯蚓在14 d不致死的條件下再持續(xù)培養(yǎng)50 d。試驗期間只添加去離子水保持土壤濕度，不添加燕麥等食物。通過蚯蚓酶活性、土壤酶活性和土壤呼吸速率進一步表征酚醛泡沫的生理毒性。

蚯蚓酶活性測定中，蚯蚓蛋白液處理參照WANG等的方法。具體步驟為：分別從各處理組取3 條生長形態(tài)相近的赤子愛勝蚓，置于含生理鹽水的培養(yǎng)皿中，于黑暗條件下清腸24 h，用去離子水洗凈體表，吸干水分，稱質(zhì)量后剪碎，按1∶10（/）加入生理鹽水，用手持超聲勻漿機研磨勻漿，在10 000×、4 ℃下離心15 min，上清液即為10%的蚯蚓勻漿液，以上操作均在4 ℃下進行。收集的上清液用于測定蚯蚓的抗氧化酶活性。上清液蛋白質(zhì)含量使用生工生物工程股份有限公司的改良型BCA 法蛋白質(zhì)含量測定試劑盒測定；超氧化物歧化酶（SOD）選用SOD測定試劑盒（WST-1 法）測定；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）選用GSH-Px測定試劑盒（比色法）測定。

1.3 土壤酶活性和呼吸速率的測定

土壤酶活性和呼吸速率的取樣時間與蚯蚓相同。測定方法為：稱取風干土0.1 g，采用土壤中性磷酸酶（Soil neutral phosphatase，S-NP）活性測定試劑盒測定S-NP活性，S-NP活性以每小時每克土樣水解產(chǎn)生1 nmol PNP 表示（nmol·g·h）；稱取風干土0.2 g，按照土壤脲酶（Solid-Urease，S-UE）活性測定試劑盒測定S-UE 活性，S-UE 活性以每克土樣中產(chǎn)生1 μg NH-N 表示（U·g）。酶活性測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

稱取5 g 新鮮的人工土壤放入120 mL 血清瓶中，25 ℃孵育24 h 后使用氣相色譜儀（7890A；Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美國）測定1 h 和5 h 的頂空氣體中的CO含量，所測CO產(chǎn)氣差值即為土壤呼吸速率，以μmol·g·h表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019 計算整理，差異顯著性（One way ANOVA，＜0.05）和相關性分析采用IBM SPSS Statistics 26.0，柱狀圖和線性相關分析結果圖采用Origin 2021繪制。

2 結果與分析

2.1 酚醛泡沫對蚯蚓的致死作用

酚醛泡沫處理7 d 和14 d 的結果如圖1 所示。從圖中可以看出，不同含量酚醛泡沫處理中蚯蚓存活率與不添加酚醛泡沫的對照組無顯著差異，說明該酚醛泡沫對蚯蚓無急性致死作用。

圖1 酚醛泡沫對赤子愛勝蚓存活的影響Figure 1 Effects of phenolic foam on the survival of earthworms

2.2 酚醛泡沫對蚯蚓GSH-Px及SOD活性的影響

培養(yǎng)64 d 后，赤子愛勝蚓GSH-Px 及SOD 活性的測定結果見圖2。對照組中蚯蚓GSH-Px 活性為15.06 U·mg，添加酚醛泡沫的各處理組的活性為27.47～56.96 U·mg（圖2A），是對照組的1.82～3.78倍。酚醛泡沫添加顯著（＜0.05）增強了蚯蚓GSH-Px活性。對照組蚯蚓SOD 活性為20.81 U·mg，添加酚醛泡沫的各處理組的活性為32.43～58.10 U·mg（圖2B），是對照組的1.56～2.75 倍，高含量酚醛泡沫處理（2 000、5 000 mg·kg）顯著（＜0.05）增加了蚯蚓SOD活性。

圖2 酚醛泡沫對蚯蚓谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）的影響Figure 2 Effects of phenolic foam on the activities of glutathione peroxidase（GSH-Px）and superoxide dismutase（SOD）in earthworm

2.3 酚醛泡沫對土壤酶活性和呼吸速率的影響

土壤S-NP 和S-UE 活性變化如圖3 所示。S-NP活性為787.01～1 192.03 nmol·g·h（圖3A），S-UE 活性為860.69～1 066.71 U·g（圖3B），各處理組S-NP和S-UE 活性與對照組無顯著差異，表明該酚醛泡沫對相關微生物活性無顯著影響。

圖3 酚醛泡沫對土壤中性磷酸酶（S-NP）和脲酶（S-UE）活性的影響Figure 3 Effects of phenolic foam on the activities of neutral phosphatase（S-NP）and urease（S-UE）in soils

土壤呼吸速率如圖4所示。對照組土壤呼吸速率為0.067μmol·g·h，而添加酚醛泡沫處理的土壤呼吸速率為0.041～0.055 μmol·g·h，顯著低于對照組（＜0.05，圖4A）。相關性分析（圖4B）表明，土壤呼吸速率與酚醛泡沫含量顯著負相關（=-0.652，＜0.05），證明酚醛泡沫對土壤呼吸存在顯著抑制作用（＜0.05）。

圖4 酚醛泡沫對土壤呼吸速率的影響及添加量與土壤呼吸的相關關系Figure 4 Effects of phenolic foam on carbon respiration of soil microbes and correlation analysis between phenolic foam and soil respiration rate

3 討論

蚯蚓急性毒性試驗可以快速地對污染物生態(tài)毒性予以初步判斷，試驗結果與實際土壤中觀察到的結果有較好的相關性，可為慢性毒性試驗和田間試驗的濃度或劑量設計提供依據(jù)。酚醛泡沫在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應用廣泛，殘留于土壤中的酚醛泡沫受外力作用后會破碎為細小顆粒物，這些細小顆粒物可能對土壤及土壤動物造成不良影響。然而酚醛泡沫MPs 施用量對土壤動物和土壤活性的影響尚不明確，由OECD制定的人工土壤法能很好地模擬蚯蚓生活的自然環(huán)境，可以全面地了解酚醛泡沫殘留對土壤動物及其生長環(huán)境的影響，考察蚯蚓在短期暴露下SOD 和GSH-Px 活性的變化趨勢；同時可以測定土壤S-UE和S-NP 活性，并通過土壤呼吸進一步判斷土壤有機碳含量的變化。

研究發(fā)現(xiàn)MPs 影響土壤微生物組成、活性及功能；土壤酶活性是微生物活性和土壤肥力的重要指標，S-UE 和磷酸酶活性與土壤能量流動和養(yǎng)分循環(huán)相關，常被用作污染土壤應激下土壤健康狀況變化的指標。磷酸酶對土壤磷化合物的水解有促進作用；S-UE活性可以指示土壤的供氮能力，與土壤中氮轉化和植物對氮素的吸收利用密切相關。S-UE和磷酸酶活性對評價酚醛泡沫對土壤環(huán)境的影響具有重要意義。本研究各處理組中S-NP 和S-UE 活性均無顯著變化（圖3），表明當該酚醛泡沫使用量小于5 000 mg·kg時對微生物活性和土壤肥力沒有顯著影響。土壤呼吸是土壤有機碳礦化向大氣環(huán)境釋放CO的主要過程，可反應土壤有機碳的分解狀況和微生物的活性，也是評價土壤健康的重要參數(shù)。本研究結果表明土壤呼吸即可被1 mg·kg酚醛泡沫顯著抑制（＜0.05，圖4A），且呼吸速率與酚醛泡沫含量顯著負相關（＜0.05，圖4B）。酚醛泡沫可能會抑制微生物的生長，降低其活性。研究發(fā)現(xiàn)MPs會導致土壤呼吸速率下降，影響微生物的生長繁殖。本研究結果表明，酚醛泡沫MPs 降低了微生物呼吸強度，酚醛泡沫中易分解的碳組分含量很低，這可能會進一步影響碳周轉速率。已有研究表明MPs 可能通過與土壤動物相互作用來改變土壤環(huán)境，并對土壤動物的適應性和土壤微生物豐度及功能產(chǎn)生潛在影響。本研究對赤子愛勝蚓急性毒性、蚯蚓抗氧化酶活性及土壤活性和呼吸速率進行了研究，對于評價顆粒態(tài)酚醛泡沫對土壤動物、微生物活性及功能的影響具有一定意義。該酚醛泡沫使用后在土壤環(huán)境中隨意被丟棄，光解作用和農(nóng)耕活動等破碎產(chǎn)生的顆粒物粒徑和單位面積殘留量不一，實際殘留粒徑可能遠大于2 mm，而暴露濃度可能低于試驗中的高濃度處理，本試驗放大了該酚醛泡沫對土壤生態(tài)系統(tǒng)的毒性效應，其對實際的土壤環(huán)境影響會更小。為了更加全面理清酚醛泡沫使用的安全性，酚醛泡沫對農(nóng)田土壤微生物群落組成、豐度及功能的影響需要更加深入的研究。

4 結論

（1）酚醛泡沫對赤子愛勝蚓無致死作用，但可誘導蚯蚓抗氧化酶活性顯著增強。

（2）該酚醛泡沫添加對土壤中性磷酸酶和脲酶活性均沒有顯著影響；酚醛泡沫顯著降低土壤微生物呼吸速率，且降低程度與濃度呈顯著負相關，表明該酚醛泡沫能對土壤微生物活性和土壤有機碳含量造成一定影響。