一種基于配體肽的CRP熒光檢測(cè)探針的研制

王思雅， 韓雨灝， 李針保， 張婷婷， 梁佳欣， 林卉豐， 張淑華

長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春130022

C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，在炎癥反應(yīng)初期表達(dá)顯著增加，也被稱為免疫防御結(jié)合蛋白［1］，其由細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素1、腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素6 刺激下的肝細(xì)胞合成。CRP 是天然免疫系統(tǒng)的重要組成成分，有激活補(bǔ)體、促進(jìn)吞噬、調(diào)節(jié)免疫等作用［2］。近年來(lái)，研究表明CRP 與某些臨床疾病，如結(jié)締組織疾病、心腦血管疾病、糖尿病、自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［3-4］；同時(shí)，CRP作為標(biāo)志物也可用于其他疾病的診斷與檢測(cè)，包括患者病情評(píng)估及藥效判斷等。因此，對(duì)CRP 的有效檢測(cè)具有重要的臨床意義［5-6］。

目前，CRP 常使用的檢測(cè)方法可分為化學(xué)分析法和免疫測(cè)定法兩大類。化學(xué)分析法包括氣象色譜法（gas chromatography，GC）、薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）及高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）等，如高效液相色譜法，盡管檢測(cè)靈敏度及準(zhǔn)確度較高，可以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，但存在操作要求高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、設(shè)備昂貴等不足［7-8］。免疫測(cè)定法包括免疫擴(kuò)散法（radial immunodiffusion，RID）、乳膠凝集法（latex agglutination method，LA）及酶聯(lián)免疫（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定法等，其中ELISA法是最常用的方法，具有高靈敏性、高特異性、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但該方法核心產(chǎn)品為CRP 單克隆抗體，而抗體存在制備流程繁瑣、價(jià)格昂貴、不能批量合成等不足。因此，探究一種操作簡(jiǎn)便的手段，在保證檢測(cè)特異性前提下，獲得CRP 特異性親和配體，以替代價(jià)格昂貴的單克隆抗體，具有重要的臨床意義。本研究以CRP 為靶標(biāo)，利用噬菌體表面展示技術(shù)篩選出CRP配體序列，再通過(guò)ELISA鑒定其結(jié)合活性，利用多肽固相合成技術(shù)和生物標(biāo)記技術(shù)獲得CRP熒光檢測(cè)探針，以期建立一種高特異性、高靈敏度、低成本檢測(cè)CRP的生物學(xué)新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器 立式高速低溫冷凍離心機(jī)（GL-22M，BIOBASE 公 司）；凝 膠 成 像 系 統(tǒng)（WD-5413C，北京六一生物科技有限公司）；高效液相色譜儀（Agilent 1260，杭州瑞析科技有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（Tecan Infinite? 200 Pro，南京普朗生物技術(shù)有限公司）；冷凍干燥機(jī)（Free zone Plus 6，美國(guó)LABCONCO 公司）。十二通道半自動(dòng)多肽合成儀由吉林大學(xué)生命學(xué)院生物大分子實(shí)驗(yàn)室提供；質(zhì)譜檢測(cè)由吉林大學(xué)測(cè)試中心完成；測(cè)序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.1.2 試劑 C-反應(yīng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（95%）、IPTG、Tetracycline、X-gal、購(gòu)自Sangon Biotech 公司；Ph.D.-12TM試 劑 盒 購(gòu) 自BioLabs 公 司；Tween-20 購(gòu) 自O(shè)XOID 公司；BSA、Tris-base、TMB、DMSO 及96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Aladdin公司；鼠抗M13單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Earth Ox公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體表面展示技術(shù)篩選CRP 親和配體將CRP 標(biāo) 準(zhǔn) 品 溶 解 于0.1 mol·L?1的NaHCO3（pH 8.6）中，配制成100 μg·mL?1，包被聚氯乙烯培養(yǎng)皿4 ℃過(guò)夜。次日回收培養(yǎng)皿中包被液，于濾紙上甩掉殘留液體，加入2 mL 封閉液4 ℃靜置2 h。除去封閉液，用0.1%TBST 緩沖液洗板8次。取1 mL TBST加入到培養(yǎng)皿中，再加入10 μL原始文庫(kù)，即2×1011噬菌體，室溫?fù)u動(dòng)1 h。除去未結(jié)合 的 噬 菌 體，洗 板8 次。取1 mL 0.2 mol·L?1的Glycine-HCl（pH 2.2）加 入 培 養(yǎng) 皿 室 溫 搖 動(dòng)20 min。用1 mol·L?1HCl（pH 9.1）中和溶液。取1 μL 滴度測(cè)定，剩余洗脫液進(jìn)行新一輪擴(kuò)增。通過(guò)計(jì)算，加入到第2輪淘選中。共進(jìn)行3輪篩選，2輪非特異性洗脫和1輪特異性洗脫。

1.2.2 ELISA 法檢測(cè)配體序列與CRP 結(jié)合活性將一定濃度CRP 溶液作為抗原包被96 孔板，同時(shí)，用封閉液包被3 個(gè)空白孔為陰性對(duì)照，4 ℃包被過(guò)夜。次日，于濾紙上棄去孔內(nèi)殘余液體，加入0.2 mL 封閉液，4 ℃封閉2 h。用緩沖液洗板3 次，加入重組噬菌體，室溫孵育1.5 h，緩沖液沖洗6次。在每個(gè)反應(yīng)孔加入0.1 mL 鼠抗M13 一抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，緩沖液沖洗6次。再加入0.1 mL 羊抗鼠-HRP 二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，緩沖液沖洗6 次。0.1 mL TMB 顯色15 min，用2 mol·L?1硫酸溶液終止反應(yīng)。450 nm條件下讀取數(shù)值并統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果。

1.2.3 噬菌體ssDNA 提取及序列測(cè)定 根據(jù)ELISA 檢測(cè)結(jié)果，用碘化物法提取重組噬菌體ssDNA。取 噬 菌 斑 擴(kuò) 增 液，10 000 r·min?1離 心3 min，棄上清，加入1/6 體積PEG-NaCl 室溫靜置20 min。12 000 r·min?1離心10 min，棄上清，用0.1 mL碘化鈉溶液重懸沉淀，再加入0.25 mL乙醇溶液，靜置20 min。離心后用0.5 mL 的70%乙醇（提前預(yù)冷）洗沉淀，短暫真空干燥，加入30 μL TE 重懸沉淀。送樣至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.4 熒光檢測(cè)探針的合成 取適量的2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂加入到反應(yīng)器中，加二氯甲烷（dichloromethane，DCM）振蕩30 min 保證其溶脹充分。接第1 個(gè)氨基酸使用沙芯抽濾掉溶劑，用N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）溶解3倍摩爾過(guò)量的N-（9-芴甲氧羰基）-L-脯氨酸（Fmoc-Pro-OH）氨基酸，再加入10 倍摩爾過(guò)量的N，N-二異丙基乙胺（N，N-diisopropylethylamine，DIEA），振蕩60 min。用DMF 和DCM 分別交替沖洗6 次，用甲醇進(jìn)行封閉。去掉DMF，加20%哌啶/DMF（哌啶∶DMF=1∶4）溶液，振蕩5 min 后將其去除。重新加入該溶液振蕩15 min。抽掉哌啶溶液，用乙醇清洗樹(shù)脂3 次，加入檢測(cè)試劑檢測(cè)，105～110 ℃加熱5 min，深藍(lán)色為陽(yáng)性。分別用DMF、DCM、DMF 各清洗2 次。用DMF 將保護(hù)氨基酸和3 倍過(guò)量的O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽［2-（1H-benzotriazole-1-yl）-1，1，3，3-tetramethyluronium hexafluorophosphate，HBTU］溶解后加入反應(yīng)器，并加入10 倍摩爾過(guò)量DIEA，反應(yīng)30 min。用乙醇清洗樹(shù)脂3 次后加入檢測(cè)試劑檢測(cè)，105～110 ℃加熱5 min，無(wú)色為陰性。應(yīng)用DMF、DCM、DMF 各清洗反應(yīng)器2 次，循環(huán)至12 個(gè)氨基酸添加完畢。最后將肽鏈N端與6-氨基己酸（epsilon-aminocaproic acid，EACA）C 端相連，用異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）與EACA 的N 端相連，避光反應(yīng)4 h。抽干后從樹(shù)脂上切割多肽，切割時(shí)間為2 h。裂解液用氮?dú)獯蹈桑颐亚逑? 次，室溫?fù)]發(fā)干凈。用HPLC 法將粗品提純，探針純品經(jīng)MS鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體表面展示技術(shù)篩選CRP親和配體

利用NaHCO3對(duì)CRP 靶分子進(jìn)行溶解包被聚氯乙烯培養(yǎng)皿，通過(guò)增加TBST（緩沖液濃度Tween-20 由0.1%到0.5%），經(jīng)過(guò)“洗脫-擴(kuò)增-洗脫”循環(huán)，獲得與CRP 特異性親和的配體序列。3輪篩選后結(jié)果詳見(jiàn)表1，回收率提高450 倍，表明噬菌體已達(dá)到特異性富集的目的。

表1 采用噬菌體表面展示技術(shù)3輪篩選結(jié)果Table 1 Results of the biopanning by phage display techniques

2.2 ELISA法檢測(cè)配體序列與CRP結(jié)合活性

從第3 輪洗脫物滴度測(cè)定的培養(yǎng)皿中隨機(jī)挑取15 個(gè)藍(lán)斑擴(kuò)增（標(biāo)記C1~C15），取擴(kuò)增液進(jìn)行ELISA 檢測(cè)，測(cè)試結(jié)果詳見(jiàn)圖1。3 輪篩選后有10個(gè)克隆樣本與CRP 結(jié)合活性較強(qiáng)（OD≥0.2）；其中有6 個(gè)克隆樣本（C1、C5、C8、C10、C12、C14）結(jié)合活性非常明顯（OD≥0.4）；5 個(gè)克隆樣本（C4、C6、C9、C13、C15）結(jié)合活性較弱（OD≤0.2），表明利用噬菌體展示技術(shù)能夠成功獲得與CRP 靶分子特異性結(jié)合的重組噬菌體。

圖1 第3輪篩選后重組噬菌體與CRP結(jié)合活性Fig.1 Binding activity of recombinant phage clone to CRP after three rounds of screening

2.3 噬菌體ssDNA的提取及序列測(cè)定

基于ELISA 測(cè)定結(jié)果，對(duì)第3 輪克隆樣本進(jìn)行ssDNA提取并測(cè)序。如表2所示，1號(hào)肽序列在15 個(gè)樣品中共出現(xiàn)6 次重復(fù)，2 號(hào)和3 號(hào)肽序列分別出現(xiàn)2 次，其余5 條肽序列均出現(xiàn)1 次；1 號(hào)肽序列在15條序列中重復(fù)率最高且包含其他序列的部分基序，表明1號(hào)肽序列優(yōu)于其他序列，結(jié)合ELISA檢測(cè)結(jié)果，將1號(hào)肽作為目標(biāo)肽進(jìn)行合成。

表2 3輪篩選后重組噬菌體DNA單鏈序列測(cè)定結(jié)果Table2 Results of single-stranded DNA sequence of recombinant phage after three rounds of screening

2.4 熒光檢測(cè)探針的合成

通過(guò)序列比對(duì)與ELISA 檢測(cè)結(jié)果，最終確定1 號(hào)肽（S-P-H-N-R-S-N-L-V-Q-E-L）為與CRP 特異性親和的配體。采用多肽固相合成法，以樹(shù)脂為固相載體，將氨基酸從C 端到N 端以共價(jià)鍵形式進(jìn)行連接。為提高檢測(cè)靈敏度，用FITC 作為熒光標(biāo)記物對(duì)該配體進(jìn)行了標(biāo)記，制成檢測(cè)試劑-熒光肽探針：FITC-（Acp）-S-P-H-N-R-S-N-L-V-Q-E-L，結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 CRP熒光檢測(cè)探針結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Structure of CRP fluorescence detection probe

采用高效液相色譜儀對(duì)探針粗品進(jìn)行提純后收集（圖3），回收主峰處純度最高的樣品，凍干成固體粉末，HPLC 分析結(jié)果顯示，純度可達(dá)94.37%。經(jīng)質(zhì)譜鑒定（圖4），分子質(zhì)量為1 896.08，熒光探針實(shí)際分子量與理論計(jì)算分子量相符。結(jié)果表明，合成熒光探針標(biāo)記的配體肽正確。

圖3 CRP熒光檢測(cè)探針HPLC分析圖Fig.3 HPLC analysis of CRP fluorescence detection probe

圖4 CRP熒光檢測(cè)探針質(zhì)譜鑒定圖Fig.4 Mass spectra identification diagram of CRP fluorescence detection probe

3 討論

CRP 是一種高度保守的五聚體蛋白，在臨床上作為機(jī)體感染和損傷的非特異性炎癥標(biāo)志物［9］，對(duì)CRP的有效檢測(cè)一直是臨床關(guān)注的熱點(diǎn)。近年來(lái)，人們不斷探求快速檢測(cè)CRP 的新方法。噬菌體展示技術(shù)目前被廣泛用于抗原表位的分析、生物大分子配體的篩選、蛋白質(zhì)-DNA 結(jié)構(gòu)和功能研究［10］。如羅俊茜［11］和朱錫群等［12］利用該技術(shù)篩選小分子功能肽并成功用于檢測(cè)。Guo［13］和Sompunga 等［14］利用噬菌體展示技術(shù)成功篩選大分子抗體片段。本研究根據(jù)分子間特異性相互作用原理，利用噬菌體表面展示技術(shù)最終得到CRP特異性親和配體序列，且該技術(shù)篩選出的配體分子與靶標(biāo)結(jié)合活性高，特異性強(qiáng)。

多肽固相合成技術(shù)是采用化學(xué)手段將氨基酸按照一定順序定向縮合成多肽或蛋白質(zhì)的技術(shù)［15］，該方法能最大程度上保護(hù)主鏈的完整結(jié)構(gòu)，與經(jīng)典的液相肽合成技術(shù)相比，具有快速、高效、易批量合成等優(yōu)點(diǎn)［16］，已成為多肽合成的常用手段。本研究采用的2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂具有交聯(lián)性好、易于過(guò)濾、機(jī)械性能強(qiáng)等特點(diǎn)，且該樹(shù)脂與氨基酸連接過(guò)程溫和，無(wú)需額外導(dǎo)入反應(yīng)基團(tuán)從而影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在生物標(biāo)記技術(shù)中，同位素常被作為標(biāo)記物進(jìn)行分子標(biāo)記，尤其是放射性同位素的使用會(huì)造成污染［17］，而FITC 作為免疫標(biāo)記中使用率較高的熒光素之一，具有較高的光吸收性、良好的水溶性，能夠在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)，穩(wěn)定性強(qiáng)，且不具有污染性。本研究選擇小分子材料EACA 為橋，一端與FITC連接，另一端與配體肽連接，既保證了制備的熒光探針具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)和高靈敏度，又不影響與靶分子的結(jié)合能力。

雖然本研究制備的熒光檢測(cè)探針能夠在一定程度上替代CRP 單克隆抗體，但由于探針?lè)肿恿枯^小，導(dǎo)致與靶分子結(jié)合的空間位點(diǎn)較少，因此，與相應(yīng)靶分子結(jié)合的牢固性弱于單克隆抗體大分子，且結(jié)合活性也會(huì)受到影響?；诖?，在后續(xù)的研究中可采用抗體庫(kù)進(jìn)行篩選，并考慮引入計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)和分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)得到的序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、修飾及優(yōu)化，以提高探針與靶分子的結(jié)合能力，進(jìn)一步增強(qiáng)特異性，達(dá)到高靈敏度、高特異性、低成本檢測(cè)CRP的目的。