副溶血弧菌外膜鐵蛋白受體pvuA基因的原核表達及產(chǎn)物的誘導條件優(yōu)化

劉蕾， 周欣悅， 朱楨， 曹燁， 王文彬*

1.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 連云港222005；2.江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室， 江蘇 連云港222005；3.江蘇海洋大學食品科學與工程學院， 江蘇 連云港222005

副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）屬于弧菌科弧菌屬［1］，是一種廣泛分布在海水及海產(chǎn)品中的耐鹽性革蘭氏陰性菌［2］。副溶血性弧菌可引起人體出現(xiàn)嘔吐、眩暈等反應，嚴重時可致死，是危害公眾健康的主要致病菌之一，近年來其引起的食物中毒案例占比不斷上升［3-9］。副溶血性弧菌等引起的弧菌病也給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，目前主要采用抗生素和化學藥品進行防治，但長期使用或不合理用藥會導致魚類等水產(chǎn)品藥物殘留，進而威脅人體健康［10］，也降低了水產(chǎn)養(yǎng)殖動物本身的免疫能力，不利于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展［11］。因此，尋求更加安全有效的方法抑制副溶血性弧菌等致病菌的方法已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及食品行業(yè)的研究重點，同時對魚類副溶血性弧菌的抗原微生物檢測具有重要意義。

外膜蛋白是革蘭氏陰性菌的一種重要的表面抗原，具有維持細胞結(jié)構(gòu)及生命活動的作用［12］，也是細菌與外界環(huán)境相互作用的靶點［13］，其暴露的抗原決定簇致使外膜蛋白極易被宿主的免疫系統(tǒng)識別，能夠引起宿主的體液免疫和細胞免疫。通過外膜蛋白誘導產(chǎn)生的免疫對副溶血性弧菌及其他致病菌的血清具有交叉保護作用，是一種很有潛力的保護抗原，如OmpK、OmpU、OmpW、OmpA等［14］?；【F蛋白受體pvuA 是外膜蛋白的一種，作為攝取環(huán)境中Fe3+的弧菌鐵蛋白表面受體具有重要的生理功能，該蛋白與弧菌屬中的解藻酸弧菌（V. alginolyticus）、霍亂弧菌（V. fluvialis）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）、哈維氏弧菌（V. harvey）、殺巖龍蝦弧菌（V.jasicida）、需鈉弧菌（V.natriegens）、燦爛弧菌（V. splendidus）的部分菌株具有相似性（80%~98%），與弧菌屬外的氣單胞菌、太平洋腸弧菌部分菌株有相似性（75%~93%），與其他細菌同源性較低。已有報道表明，副溶血性弧菌的psuA 和pvuA 的重組蛋白混合免疫大黃魚4 周后，活菌攻毒后的免疫保護率為80%，有望作為高效疫苗抗原［15］。梁夏夏等［16］利用弧菌鐵蛋白受體通過酶聯(lián)免疫吸附反應（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和免疫印跡研究了小鼠多抗與不同副溶血性弧菌、其他弧菌等菌株的交叉反應，結(jié)果表明，重組弧菌鐵蛋白受體以包涵體形式表達，且小鼠多抗與免疫重組蛋白的效價較好。周清等［17］研究表明副溶血性弧菌脅迫下的鐵蛋白在先天性免疫中具有很好的防御作用。目前國內(nèi)對副溶血性弧菌的外膜蛋白的免疫原性報道較多，但關(guān)于弧菌鐵蛋白方面研究較少。

本研究從副溶血弧菌基因組DNA 擴增了弧菌鐵蛋白受體pvuA基因，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a（+）-ferric vibrioferrin receptor，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 并經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-Dthiogalactoside，IPTG）誘導表達蛋白，但大腸桿菌中的蛋白表達產(chǎn)量不多。本研究采用響應面分析法（response surface，RSA），在單因素的基礎(chǔ)上，以菌體初始濃度、誘導時間、誘導溫度、誘導劑濃度為自變量，菌體蛋白濃度為響應值，根據(jù)響應面法的Box-Benhnken 中心設(shè)計原理，研究自變量及其交互作用對弧菌鐵蛋白產(chǎn)量的影響，并利用Design-Expert 和響應面分析相結(jié)合的方法對誘導條件進行優(yōu)化，以期提高其在大腸桿菌中的表達產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、NcoⅠ、DNA Marker、膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、IPTG、卡那霉素、雙色預染蛋白Marker 及SDS-PAGE 凝膠電泳所需試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自Sigma 公司；原核表達載體pET-28a（+）、大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）為本實驗室保存；副溶血弧菌（CICC 21617）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；其他化學試劑均購自上海國藥化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 副溶血弧菌鐵蛋白受體基因的克隆 根據(jù)

NCBI 中弧菌鐵蛋白受體（GenBank：28901511）的基因序列，插入限制性酶切位點XhoⅠ、NcoⅠ后，使用軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計引物。將副溶血弧菌CICC21617 培養(yǎng)至對數(shù)期，CTAB 法提取基因組DNA作為模板。弧菌鐵蛋白受體pvuA上游引物（5'→3'）：5'-CCCATGGATGTCTTACCAGAATTTG-3'；下游引物（5'→3'）：5'-CCGCTCGAGAAACTGATAGTTCAGATC-3'。PCR 反應程序均為：95 ℃5 min；95 ℃45 s，53 ℃45 s，72 ℃60 s，30個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后切膠回收。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及陽性克隆篩選 目的基因和pET-28a（+）質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，通過T4連接酶連接得到重組質(zhì)粒pET-28a（+）-ferric vibrioferrin receptor。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coliDH5α 感受態(tài)，在平板上挑取6 個單菌落做PCR 驗證，抽提重組質(zhì)粒并由生工生物工程（上海）股份有限公司，將測序驗證后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達宿主E. coliBL21（DE3），制作甘油菌保藏于?80 ℃。

1.2.3 弧菌鐵蛋白受體誘導表達條件優(yōu)化 為提高重組蛋白的產(chǎn)量，對IPTG 濃度、菌株起始濃度、誘導溫度、誘導時間進行優(yōu)化。將添加誘導劑的終濃度設(shè)計為0.2、0.5、0.8、1.0 mmol·L?1，37 ℃搖床震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期OD600=0.6 時，誘導時間為12 h；菌株起始濃度設(shè)計為OD600為0.4、0.6、0.8，誘導劑的濃度為1.0 mmol·L?1，誘導溫度為37 ℃，誘導12 h；誘導溫度設(shè)計為16、28、37、42 ℃，菌株起始濃度OD600=0.6 時，加入IPTG 濃度為1.0 mmol·L?1；誘導時間設(shè)計為8、10、12、14 h，菌株起始濃度OD600=0.6 時，加入IPTG 濃度為1.0 mmol·L?1，誘導溫度為37 ℃。對收集的菌體進行離心、超聲破碎、離心，收集上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳表征，分析蛋白表達情況。

1.2.4 弧菌鐵蛋白受體誘導表達條件響應面設(shè)計弧菌鐵蛋白受體pvuA 誘導條件的優(yōu)化采用響應面分析方法。綜合單因素試驗結(jié)果，根據(jù)Box-Benhnken 中心設(shè)計原理，采用4 因素3 水平進行設(shè)計，各個因素根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)定中心點和高、低水平，試驗因素水平及編碼見表1。

表1 RSA設(shè)計中定量因子的水平及編碼Table 1 Levels and code of RSA test factors

1.2.5 弧菌鐵蛋白受體的表達與純化 將陽性克隆菌種子液按1%比例接種于50 mL含100 μg·mL?1卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600為0.6~0.8），向菌液中加入IPTG 至終濃度為1.0 mmol·L?1，37 ℃、180 r·min?1搖床震蕩過夜。離心后收集菌體，用5 mL 10 mmol·L?1PBS 重懸后，冰浴超聲破碎（400 W，30 min）后，離心并收集上清和沉淀，用2 mL PBS將沉淀重懸，用SDS-PAGE 檢測重組蛋白的表達情況。將蛋白包涵體用8 mol·L?1尿素變性后進行鎳柱親和層析純化，將純化蛋白進行尿素梯度透析復性，用Millipore 超濾管（截斷分子量：10 kD）濃縮樣品，Bradford法定量后?20 ℃冷凍貯存。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的PCR 擴增與陽性重組質(zhì)粒的篩選

如圖1 所示，PCR 擴增出來的產(chǎn)物DNA 分子量大小約為2 000 bp，與NCBI 副溶血性弧菌外膜蛋白弧菌鐵蛋白受體（2 139 bp）的分子量大小相似。將目的基因雙酶切、連接及轉(zhuǎn)化后，構(gòu)建到質(zhì)粒pET-28a 上，重組質(zhì)粒即為pET-28a（+）-ferric vibrioferrin receptor。重組質(zhì)粒進行PCR 驗證，驗證結(jié)果如圖2 所示，pET-28a（+）-ferric vibrioferrin receptor 平板上挑取的1、3、4、5 號單菌落可以擴增出弧菌鐵蛋白受體基因大小相似的條帶，將以上菌落提取質(zhì)粒并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序驗證，測序結(jié)果顯示送檢質(zhì)粒的核苷酸序列與NCBI 公布的核苷酸序列相似性均在98.5% 以上，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 弧菌鐵蛋白受體pvuA基因PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR product of ferricvibrioferrin receptorpvuAgene

圖2 弧菌鐵蛋白受體重組質(zhì)粒PCR驗證Fig.2 PCR verification of ferric vibrioferrin receptor recombinant plasmid

2.2 重組蛋白的表達

將重組質(zhì)粒菌株經(jīng)28 ℃、IPTG 濃度為1.0 mmol·L?1，誘 導12 h 后，5 000 r·min?1，離 心30 min，棄上清，加入PBS 緩沖液重懸后進行超聲破碎，再次離心，上清和沉淀用10%的SDS-PAGE進行凝膠電泳分析。由圖3 可知，重組質(zhì)粒誘導菌體裂解物上清中未見目的條帶，沉淀中目的條帶顯著，與外膜蛋白弧菌鐵蛋白受體理論分子量78.75 kD 大小相近，說明蛋白均以包涵體形式表達?？瞻踪|(zhì)粒誘導后菌體裂解物上清和沉淀中均未出現(xiàn)目的條帶。

圖3 重組蛋白誘導表達Fig.3 Expression induction of recombinant protein

2.3 重組外膜蛋白弧菌鐵蛋白受體表達條件優(yōu)化

2.3.1 IPTG 濃度的優(yōu)化 將陽性重組菌株于液體培養(yǎng)基37 ℃搖床震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期OD600=0.6時，誘導時間為12 h 后，10%SDS-PAGE 電泳驗證誘導結(jié)果。結(jié)果顯示，誘導劑在0.2~1.0 mmol·L?1濃度區(qū)間內(nèi)，重組弧菌鐵蛋白受體蛋白的表達產(chǎn)物隨著誘導劑的增加而增加，當IPTG 濃度為1.0 mmol·L?1時目的條帶最寬，經(jīng)蛋白濃度測定儀所測得的蛋白表達量最高，為8.58 mg·mL?1，因此1.0 mmol·L?1為最佳IPTG濃度（圖4）。

圖4 IPTG濃度優(yōu)化Fig.4 Optimization of IPTG concentration

2.3.2 菌株起始濃度的優(yōu)化 陽性重組菌株加入IPTG 誘導劑的濃度為1.0 mmol·L?1、誘導溫度為37 ℃時，誘導12 h，對菌株起始菌液濃度進行優(yōu)化。蛋白凝膠電泳結(jié)果顯示為當OD600從0.4 增加到0.6，重組蛋白表達量隨起始濃度的升高而升高，當OD600繼續(xù)增加到0.8，重組蛋白表達量無明顯變化，即OD600達到0.6時，重組蛋白的表達量較高，為8.92 mg·mL?1（圖5）。

圖5 起始菌液濃度優(yōu)化Fig.5 Optimization of the initial bacterial concentration

2.3.3 誘導溫度的優(yōu)化 菌株起始濃度OD600為0.6，加入IPTG 濃度為1.0 mmol·L?1，誘導時間為12 h，對梯度誘導溫度進行優(yōu)化。實驗結(jié)果顯示，與誘導溫度為16 ℃相比，誘導溫度為28、37 ℃時，包涵體蛋白表達產(chǎn)量有一定增加，并且在37 ℃時表達量略高，為8.98 mg·mL?1。誘導溫度42 ℃時，重組蛋白表達量略有降低。因此重組蛋白的最優(yōu)誘導溫度為37 ℃（圖6）。

圖6 誘導溫度優(yōu)化Fig.6 Optimization of induction temperature

2.3.4 誘導時間的優(yōu)化 菌株起始濃度OD600為0.6，加入IPTG 濃度為1.0 mmol·L?1，誘導溫度為37 ℃，對梯度誘導時間進行優(yōu)化。蛋白凝膠電泳結(jié)果顯示，誘導時間為8 h 時，重組蛋白表達產(chǎn)物較少；誘導時間10 h時，重組蛋白表達產(chǎn)量增加達到最大值，為10.58 mg·mL?1。誘導時間為12、14 h時，蛋白表達產(chǎn)量與10 h 時產(chǎn)量無統(tǒng)計學差異。因此，確定重組蛋白的最優(yōu)誘導時間為10 h（圖7）。

圖7 誘導時間優(yōu)化Fig.7 Optimization of induction time

2.4 響應面優(yōu)化試驗設(shè)計和結(jié)果

以初始濃度（A）、誘導時間（B）、誘導溫度（C）、誘導劑濃度（D）為自變量，蛋白濃度（Y）為響應值，優(yōu)化弧菌鐵蛋白的誘導條件。試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results

2.4.1 回歸方程的方差分析 由表3 可知，回歸模型的P=0.000 7，表明回歸模型極顯著（P＜0.01）；失擬系數(shù)的P值為0.106 5，在統(tǒng)計學上分析其影響不顯著（P＞0.05），說明參與響應面的考察因素設(shè)計合理，未知因素對目的蛋白的表達量影響很小。因此不需要引入更高次數(shù)的項，模型適當。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，一次項A 和D 處于顯著水平（0.01＜P＜0.05）。二次項A2和C2處于極顯著水平（P＜0.01），B2處于顯著水平（0.01＜P＜0.05）。

表3 回歸方程各方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

2.4.2 響應面圖及其等高線 弧菌鐵蛋白pvuA

各誘導條件的交互作用響應面曲線和等高線見圖8。響應面圖顯示曲面均成山丘型，在試驗中所選的范圍內(nèi)，響應面有最高點，存在最大值。不同因素交互效應的強弱可以通過等高線的形狀判斷。圖8 中，誘導劑濃度及菌體初始濃度的等高線為橢圓形，表明這兩因素交互作用顯著。其他因素間等高線為圓形表示其交互作用不顯著。

圖8 菌體初始濃度與誘導溫度、誘導劑濃度、誘導時間對菌體蛋白產(chǎn)量影響的響應面與等高線圖Fig.8 Response surface and contour map of the effects of initial cell concentration with induction temperature,inducer concentration and induction time on the production of bacterial protein

2.4.3 最佳表達條件的確定 由Design-Expert分析得到最大響應值，其對應的最佳誘導表達條件：初始菌體濃度OD600=0.6，IPTG 濃度1.0 mmol·L?1，誘導溫度37 ℃，誘導時間10 h，理論最佳蛋白濃度為10.58 mg·L?1。為驗證該模型得到的最佳條件，進行3 組平行試驗，結(jié)果表明，實際最高蛋白濃度為11.00 mg·mL?1，與理論值相當，說明該方程與實際情況具有較好的擬合度，驗證了該模型的準確性，方程如下：

Y=10.03+0.68A+0.35B+0.31C+0.77D+0.0005AB+0.11AC+0.34AD+0.073BC?0.17BD+0.12CD?2.04A2?0.9B2?2.25C2?0.61D2

2.5 重組蛋白的純化及含量測定

將制備得到的包涵體蛋白進行變性、復性實驗后，未得到可溶的蛋白，后續(xù)實驗以蛋白包涵體進行，將純化的重組蛋白（圖9）采用超濾管濃縮后，用Bradford 法測得的重組蛋白含量為11.00 mg·mL?1。

圖9 重組蛋白純化Fig.9 The recombinant protein purification

3 討論

鐵是絕大多數(shù)細菌生存所必需的元素，自然環(huán)境中存在的鐵元素是微量的，并且多數(shù)為不溶性狀態(tài)，而宿主中的鐵多以亞鐵紅素、鐵結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白等形式存在［18］，細菌難以直接獲取。因此，鐵的攝取通常與細菌生存及在宿主內(nèi)的致病過程相關(guān)。副溶血性弧菌有多種鐵攝入系統(tǒng)，在缺鐵環(huán)境下，其本身產(chǎn)生一種載鐵體，即弧菌鐵蛋白以促進鐵的獲取［19］?；【F蛋白與環(huán)境中Fe3+絡合后，被運送到與之特異性結(jié)合的表面受體蛋白，即弧菌鐵蛋白受體；該蛋白分子量79 kD，由pvuA基因表達，其轉(zhuǎn)運過程需要TonB 系統(tǒng)的幫助［20］。目前對于弧菌鐵蛋白受體的免疫原性研究僅見于大黃魚，本研究旨在構(gòu)建弧菌鐵蛋白受體重組質(zhì)粒并優(yōu)化表達條件，為抗體制備奠定基礎(chǔ)。

大腸桿菌E.coli被證實能夠重組表達多種細菌外膜蛋白［21］，pET-28a（+）具有T7 啟動子，具有較強的啟動能［22］。pET 系統(tǒng)能將外源目的基因克隆到T7啟動子之下使目的蛋白本底表達量較低，并且表達的重組蛋白帶有6個His標簽，便于后續(xù)純化［23］。本試驗結(jié)果表明，弧菌鐵蛋白受體的pET-28a（+）重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功，重組蛋白誘導后以包涵體形式表達，蛋白分子量與理論值一致。通過單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，帶重組質(zhì)粒的初始菌體濃度OD600（0.4~0.8）、誘導時間（8~14 h）對蛋白表達產(chǎn)量影響較大。當OD600在0.6 時，包涵體在凝膠上的目的條帶最粗，重組蛋白表達量達到最大。這可能是因為OD600在0.4~0.8 時是大腸桿菌生長的對數(shù)期，但初始菌濃度較低會造成菌量較低，影響總體表達量；而初始菌濃度較高時，由于重組蛋白的合成與細菌的生長繁殖競爭營養(yǎng)物質(zhì)，總蛋白表達量趨于穩(wěn)定。誘導時間的影響也與重組菌的生長繁殖有關(guān)，隨著誘導時間的延長，重組蛋白的表達量也隨之增大，當誘導時間達到10 h 后重組菌的生長趨于平穩(wěn)，此時的重組蛋白表達量無明顯增加。本試驗結(jié)果顯示誘導溫度為28、37 ℃時，弧菌鐵蛋白受體表達量較高。大腸桿菌最適生長溫度為37 ℃，此時蛋白表達的速度較快，蛋白常以無活性的包涵體形式存在。溫度在16 ℃時，不利于大腸桿菌的生長，蛋白表達量較少，主要用于減少蛋白合成速度、促進蛋白可溶性表達。本研究中，在各種溫度下均無可溶性蛋白表達，這可能與弧菌鐵蛋白受體自身結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、分子量有關(guān)。此外誘導劑IPTG 濃度也是影響表達量的重要因素，通常隨著誘導劑濃度增加，會增強重組蛋白表達，但過高的IPTG 濃度會產(chǎn)生毒性，從而影響表達量。

本研究成功構(gòu)建了弧菌鐵蛋白受體pvuA 的pET-28a（+）重組表達質(zhì)粒，IPTG 誘導后蛋白以包涵體形式表達，經(jīng)響應面設(shè)計優(yōu)化最終得到了誘導表達條件為IPTG 濃度1.0 mmol·L?1、菌株起始濃度OD600=0.6、誘導溫度37 ℃、誘導時間10 h，此時包涵體沉淀中的蛋白濃度為11.00 mg·mL?1。本研究經(jīng)純化后得到了純度較高的重組弧菌鐵蛋白受體蛋白，為下一步制備多克隆抗體及研究該蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和免疫原性奠定了基礎(chǔ)。