黏著劍菌CN-02胞外多糖在緩解水稻Cu2+脅迫中的作用

＊孫科 沙鳳 譚芳美 熊美惠

（蘇州科寧多元醇有限公司 江蘇 215000）

引言

近年來，隨著社會經濟的發(fā)展，由人類活動引起的土壤重金屬污染日趨嚴重。在我國，生態(tài)環(huán)境部基于全國土壤污染狀況調查結果顯示，農田土壤超標率達19.4%，其中主要以鎘（Cd）、鎳（Ni）、銅（Cu）、汞（Hg）、鉛（Pb）等為主。研究人員發(fā)現，銅脅迫下，若土壤中的銅含量超過50mg/kg，則會影響柑橘的生長；若土壤中的銅含量超過200mg/kg時，則會嚴重抑制小麥生長。另一方面，重金屬通過食物鏈進入生物體內，對其造成極大的危害。因此，減少重金屬離子在植物體內的富集、增強植物重金屬脅迫抗性，對于我國糧食安全至關重要。

胞外多糖是由微生物分泌的胞外聚合物，其由單糖通過糖苷鍵的形式連接而成。由于單糖種類豐富、糖苷鍵不同以及側鏈修飾差異，使得自然界中的胞外多糖多種多樣，其效果也不盡相同。其中，胞外多糖中的羥基、羧基、硫酸基團等官能團，對金屬離子的吸收至關重要。山東大學侯萬國教授團隊[1]研究發(fā)現，富含羥基、羧基的深海中溫菌Wangia profunda SM-A87胞外多糖對Pb、Cu、Cd有較強的吸附能力。Mukherjee等[2]發(fā)現，砷（2mM）增加了Halomonas sp.Exo1胞外多糖的產生，進而又隔離了重金屬，緩解了水稻的重金屬脅迫，表現出正反饋機制。鑒于胞外多糖較好的陽離子吸附特性，胞外多糖及其分泌菌株已被建議作為重金屬修復的輔助劑[3]。

黏著劍菌（Ensifer adhaerens）屬于α-變形菌門細菌，其最早由Casida于1982年從土壤中被分離鑒定。隨著研究的深入，人們發(fā)現黏著劍菌是優(yōu)異的土壤有機污染物降解和工業(yè)化生產維生素B12菌種。也有研究表明，來源于黏著劍菌的胞外多糖是一種良好的食用油生物乳化劑[4]。在本研究中，我們發(fā)現黏著劍菌CN-02具備較強的胞外多糖分泌能力，且其胞外多糖富含糖醛酸，可吸附Cu2+，并緩解Cu2+脅迫對水稻生長的抑制作用。

1.材料與方法

(1)菌株

黏著劍菌（Ensifer adhaerens）CN-02篩選自水稻根際土壤，已于2020年12月保藏至中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC，No21357）。

(2)培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：NaCl 10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，溶解于1L去離子水中。

發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl 10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，蔗糖40g，溶解于1L去離子水中。

固體培養(yǎng)基則額外添加15g/L瓊脂，所述培養(yǎng)基菌滅菌后使用。

(3)胞外多糖產量及組分測定

挑取E.adhaerens CN-02至LB液體培養(yǎng)基，37℃，過夜培養(yǎng)。隨后將其以4%接種量轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，200rpm培養(yǎng)24h，即得發(fā)酵液。發(fā)酵液高速離心（10000×g，15min）后保留上清，減壓蒸餾至原始體積的1/5。濃縮液通過Sevag試劑（異戊醇:氯仿=1:4v/v）去除蛋白后，加入3倍體積95%乙醇，4℃過夜醇沉。將沉淀冷凍干燥后，即得E.adhaerens CN-02胞外多糖。

胞外多糖總糖含量通過苯酚-硫酸法測定[4]；糖醛酸含量通過硫酸-咔唑法測定[5]；蛋白質含量通過Brad-Ford法測定；灰分含量通過馬弗爐測定。

(4)胞外多糖與Cu2+螯合能力測定

準確稱量12.6g無水CuSO4（含5g Cu），溶解至95mL去離子水中。隨后，加入5mL 5g/L、10g/L、20g/L、40g/L的胞外多糖溶液，以加入5mL去離子水為空白對照，充分混合后常溫靜置30min。將混合溶液在4000×g離心20min，上清液通過電感耦合等離子體光譜儀測定Cu2+含量。螯合率使用如下公式計算：

螯合率（%）=（對照組Cu2+含量－實驗組Cu2+含量）×100/對照組Cu2+含量

(5)紅外光譜分析

稱取10mg樣品與100mg KBr混合后研磨至細粉末，并通過壓片機制成薄片，使用傅里葉變換紅外光譜儀對其進行掃描。

(6)水稻種植及處理

供試的水稻種子（Oryza sativa ssp.japonica cv.Nipponbare）由江蘇省農業(yè)科學院提供。將種子用2.5%次氯酸鈉表面滅菌20min，然后用無菌水沖洗3次。在22℃催芽后，移栽至滅菌土壤中，培養(yǎng)一周后，挑選長勢相似的水稻幼苗，隨機分成6組，分別為：T1，空白對照；T2，施加CuSO4溶液，至終濃度為250mg/kg土壤；T3，施加胞外多糖溶液，至終濃度為100mg/kg土壤；T4，施加胞外多糖和CuSO4溶液，至胞外多糖終濃度為100mg/kg土壤，CuSO4終濃度為250mg/kg土壤；T5，施加胞外多糖和CuSO4溶液，至胞外多糖終濃度為200mg/kg土壤，CuSO4終濃度為250mg/kg土壤；T6，施加胞外多糖和CuSO4溶液，至胞外多糖終濃度為400mg/kg土壤，CuSO4終濃度為250mg/kg土壤。培養(yǎng)一周后，收集水稻，測定其根長、莖長、鮮重、葉綠素含量，體內Cu2+含量，丙二醛（MDA）含量[6]，脯氨酸含量[7]；收集水稻根圍土，測定游離Cu2+含量。其中，整個培養(yǎng)期間生長條件為：25℃、相對濕度65%、光強度4000lx、光照16h/d。

2.結果與討論

(1)胞外多糖產量及組分分析

經發(fā)酵、提取后測得E.adhaerens CN-02胞外多糖產量為8.83g/L；E.adhaerens CN-02胞外多糖中，總糖含量為74.20%，糖醛酸含量為26.18%，不含蛋白質。此外，灰分含量為4.79%。

(2)胞外多糖對Cu2+的結合能力分析

為了考察胞外多糖高糖醛酸含量的特性，是否表現出較好的Cu2+螯合能力，我們對其進行了分析。實驗結果如圖1所示，隨著胞外多糖含量（0～30g/L）的升高，其對Cu2+的螯合率逐漸升高，而30g/L與40g/L胞外多糖對Cu2+的螯合率卻無明顯差異。

圖1 胞外多糖對Cu2+的結合能力

(3)胞外多糖紅外圖譜分析(圖2)

圖2 胞外多糖在吸附Cu2+前和后的紅外光譜分析

Cu2+處理前后的E.adhaerens CN-02胞外多糖紅外光譜圖如圖2所示。根據文獻報道，胞外多糖在3400cm-1附近又寬又大的特征吸收峰為-OH的伸縮振動，在2940cm-1附近的吸收峰為糖亞甲基中C-H的伸縮振動，在1600cm-1和1400cm-1附近的吸收峰為羧酸根離子基團（COO-）和C-H的結合震動，在1070cm-1附近的吸收峰代表了C-O-C和C-O-H的伸縮振動[8]。胞外多糖吸附Cu2+后，其紅外光譜吸收峰在3400cm-1處、1600cm-1和1400cm-1處的吸收峰明顯變強，說明這些基團與胞外多糖結合Cu2+有關，而在3400cm-1和1600cm-1處的變化最為顯著，說明羧基和羥基在吸附Cu2+的過程中發(fā)揮著主要作用。

(4)胞外多糖增強水稻對銅離子脅迫的抗性

不同處理下水稻苗莖長、根長、鮮重和葉綠素含量如表1所示。重金屬脅迫處理，即T2組，顯著抑制了水稻生長，其莖長、根長、鮮重和葉綠素含量均顯著低于對照組，即T1。施加胞外多糖處理組（T3），顯著促進了水稻生長。施加胞外多糖和重金屬脅迫的處理，則顯著緩解了重金屬脅迫對水稻幼苗的傷害，其中，胞外多糖含量越高，其緩解作用越明顯，這一現象與胞外多糖濃度越高對Cu2+吸附能力越強相吻合（圖1）。

表1 不同處理下水稻苗生長指標差異

重金屬脅迫下，植物會細胞失水而進一步受到滲透壓脅迫。此時，植物會調整代謝，分泌并積累過量的脯氨酸，用于提高自身抗?jié)B透壓脅迫的能力，從而盡量緩解重金屬脅迫對植物造成的損傷。因此，水稻在正常環(huán)境下生長時（T1和T3組），其體內脯氨酸含量較低，在重金屬脅迫下生長時（T2組），其脯氨酸含量顯著上升，為T1組的2.5倍。當施加胞外多糖后（T4、T5和T6組），水稻苗內脯氨酸含量有所下降，但仍顯著高于T1處理組圖3（A），這或許是因為胞外多糖在植物體外絮凝了Cu2+，使水稻收到了更低濃度的重金屬離子脅迫，進而其對脅迫緩解需求較小，體內脯氨酸含量也因此降低。

MDA是脂膜氧化后的最終產物。換言之，植物體內MDA含量越高，其受到的脅迫傷害越嚴重[8]。Cu2+脅迫對植物造成了明顯的傷害，使脂膜過氧化，積累了更多的MDA圖3（B），T2組的MDA含量為T組的3.1倍，這對植物造成了極大的傷害。胞外多糖處理顯著緩解了這一傷害，水稻體內的MDA與T2組相比，從29.6nmol/g降低至18.9nmol/g（T4組）、16.9nmol/g（T5組）、16.2nmol/g（T6組）。

隨后，我們考察了水稻根內外的Cu2+含量。實驗結果如圖3（C）和圖3（D）所示，在正常環(huán)境下生長的水稻（T1和T3組）根內和根外Cu2+含量低，而T2組，根內、根外Cu2+含量顯著提高，分別達到了124mg/kg和133mg/kg。胞外多糖處理后（T4、T5和T6組），水稻根內的Cu2+含量顯著降低圖3（C），有趣的是，水稻根圍土壤中的游離Cu2+含量也同樣顯著降低圖3（D）。因此，我們推測，在Cu2+脅迫下，Cu2+大量內流，顯著提高了水稻根內的Cu2+含量，而胞外多糖的加入，由于其對Cu2+較好的吸附能力，限制了Cu2+內流，同時，將Cu2+絮凝在土壤中，從而減少了Cu2+對植物生長的抑制作用。

圖3 不同處理下水稻幼苗脯氨酸（A）、MDA（B）、根內Cu2+（C）和根圍Cu2+（D）含量

3.總結

在本研究中，我們發(fā)現來源于E.adhaerens CN-02的胞外多糖中含有較多的糖醛酸含量。同時，該胞外多糖展現出了較強的Cu2+吸附能力，從紅外圖譜分析，我們推測其吸附能力主要與羧基和羥基有關。將該胞外多糖使用至模擬鹽脅迫的土壤中，其通過對Cu2+吸附效應，將Cu2+排除在水稻根際外圍，顯著增強了水稻對Cu2+脅迫的抗性。