黃酮類化合物微生物合成途徑構(gòu)建與優(yōu)化研究進展

朱睿睿，趙玉成，秦民堅

（中國藥科大學中藥學院，江蘇，南京211198）

黃酮類化合物是一類以二苯基色原酮為基本骨架的植物次生代謝產(chǎn)物，通常以苷與苷元的形式廣泛存在于植物體內(nèi)，可為植物的生存與繁殖提供一定的進化優(yōu)勢［1］。此外，黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛［2］、抗心腦血管疾?。?］、抗腫瘤、保肝護肝［4］和抗病毒［5］等多種藥理活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。

黃酮類化合物以2-苯基色原酮為基本母核，由兩個芳香環(huán)（A 環(huán)與B 環(huán)）通過中間三碳結(jié)構(gòu)（C 環(huán)）連接而成。如圖1 所示，黃酮類化合物可根據(jù)A 環(huán)與B環(huán)之間的三碳原子結(jié)構(gòu)是否成環(huán)、取代、氧化以及鍵飽和度等差異歸類為查爾酮、異黃酮、黃酮醇等類以及各類的二氫衍生物［6-7］。黃酮類化合物在植物中有多種生物學功能，如影響花的顏色與氣味，吸引昆蟲授粉同時提高觀賞價值［8-9］；對抗各種生物與非生物脅迫，如抵御紫外線［10］、防止微生物感染和食草動物吞食［11-12］。黃酮類化合物在人類慢性疾病方面也具有一定的治療作用，包括癌癥、糖尿病、阿爾茨海默癥等［13-17］，同時在功能食品中的應用也越來越廣泛［18］。

圖1 黃酮類化合物基本骨架Fig.1 The structure of several flavonoids

黃烷酮是黃酮類化合物合成的直接前體，由苯丙氨酸與酪氨酸通過苯丙素途徑合成［19］。如圖2所示，葡萄糖在系列酶的催化下，生成苯丙素途徑起始底物苯丙氨酸與酪氨酸［19-20］，隨后分別在苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）與酪氨酸解氨酶（Tyrosinase，TAL）的催化下轉(zhuǎn)化為類黃酮中間體。例如，苯丙氨酸依次在PAL、肉桂酸4-羥化酶（Cinnamate 4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酰輔 酶A 連 接 酶（4-Coumarate：coenzyme A ligase，4CL）的作用下轉(zhuǎn)化為黃酮類化合物合成前體對香豆酰輔酶A，隨后與三分子丙二酰輔酶A（Malonyl-CoA）在查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）的作用下生成類黃酮生物合成途徑的起始底物——查爾酮［21］，進而在一系列酶的作用下生成多種黃酮類化合物［22］。

圖2 黃酮類化合物生物合成的詳細步驟Fig.2 Detailed steps of flavonoid biosynthesis

植物提取作為黃酮類化合物的主要生產(chǎn)方式，操作工藝復雜，且產(chǎn)物常為混合體系，純化過程會增加生產(chǎn)成本，還會造成產(chǎn)品損失與活性降低［23-25］?，F(xiàn)有研究表明通過化學合成能實現(xiàn)部分黃酮類化合物的全合成［26-28］，但常伴隨極端的反應條件，如高溫、強酸與強堿，對環(huán)境影響較大，阻礙了化學合成方法規(guī)?；蜕虡I(yè)化應用［28-29］。另外，通過化學合成產(chǎn)生的黃酮類化合物通常會產(chǎn)生兩種立體異構(gòu)體混合物，需經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾，如糖基化和手性合成以形成具有生物活性的（2S）-黃酮［30-31］。

1 微生物合成體系

1.1 大腸桿菌合成體系

隨著合成生物學與代謝工程的發(fā)展，利用微生物細胞工廠生產(chǎn)黃酮類產(chǎn)物已引起廣泛關(guān)注［25，32-33］。通過重組宿主構(gòu)建異源體系合成黃酮類化合物與其他方法相比生長周期短、易培養(yǎng)、廢棄物少、能耗低、可批量生產(chǎn)。其中，釀酒酵母與大腸桿菌的各種遺傳操作與代謝修飾已得到充分的研究，被認為是目前最成熟的真核表達系統(tǒng)與原核表達系統(tǒng)。

大腸桿菌作為微生物細胞工廠具有高培養(yǎng)密度、高生長速率、以及易實施性等優(yōu)勢，是目前微生物生產(chǎn)平臺的首選［32-34］。Huwang 等人［35］將來自三個不同物種的PAL、4CL與CHS基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主中，成功生成了柚皮素與喬松素，首次實現(xiàn)黃酮類化合物在微生物中的合成。該研究發(fā)現(xiàn)天藍色鏈霉菌中的4CL，能催化肉桂酸與4-香豆酸分別生成肉桂酰輔酶A與4-香豆酰輔酶A［35］。后續(xù)的研究中，利用大腸桿菌成功生成了多種黃酮類化合物，包括圣草酚、柚皮素、喬松素、黃芩素和野黃芩素等，表1 總結(jié)了近五年在大腸桿菌中合成黃酮類化合物的相關(guān)研究。

表1 大腸桿菌合成黃酮類化合物的相關(guān)研究Tab.1 Research on the synthesis of flavonoids production in E. coli

由于大腸桿菌缺乏真核生物特有的膜系統(tǒng)，無法滿足細胞色素P450 單加氧酶（CYP450s）的膜定位要求，也不能對蛋白進行翻譯修飾和正確折疊，因此需要氧化還原搭檔負責電子轉(zhuǎn)移［50］。大腸桿菌從頭合成黃酮類化合物時，涉及多種CYP450 酶，這些酶活性較低，選擇性較差［51］。為解決CYP450家族基因在大腸桿菌中表達困難的問題，研究人員嘗試多種方法試圖提高其催化活性與特異性，如融合工程［52］、定向進化方法［19］、蛋白工程［41］和底物工程［53］，雖然在一定程度上解決了低效率的問題，但效果甚微［29］。在后續(xù)研究中，引入來自細菌非P450的加氧酶和羥化酶取代植物細胞色素P450酶，可能是解決該問題的方法之一。

1.2 酵母合成體系

釀酒酵母作為一種公認的安全菌株，適合大規(guī)模生產(chǎn)，在制藥和生物技術(shù)行業(yè)已得到廣泛的應用［54-55］。釀酒酵母作為一種有完整膜結(jié)構(gòu)和多個細胞器的真核生物，能為生物合成提供不同環(huán)境，且能對蛋白進行翻譯修飾與正確折疊。此外，釀酒酵母對惡劣的工業(yè)條件還具有很高的耐受性［56］。RO和Douglas 首次證實了對香豆酸是通過PAL、C4H與CPR基因共表達實現(xiàn)在重組酵母中的生產(chǎn)［57-58］，但產(chǎn)率較低。之后的研究中，酪氨酸和來自Rhodos?pidrium toruloides中的TAL基因被用來代替苯丙氨酸和C4H基因，使對香豆酸的產(chǎn)率有所提高［59］。Ro?driguez 等 人［60］引 入Flavobacterium johsoniaeu中 的TAL基因并敲除苯基丙酮酸脫羧酶ARO10基因和丙酮酸脫羧酶PDC5基因，通過過表達DHAP 合成酶ARO4基因、分支酸變位酶ARO7基因和莽草酸激酶AroL基因，減少了對香豆酸合成過程中副產(chǎn)物的生成，使對香豆酸的產(chǎn)量達到1.93 ± 0.26 g/L，為生產(chǎn)黃酮類化合物提供了一個有力的平臺宿主［60-61］。

Koopman 等人［62］結(jié)合產(chǎn)物途徑優(yōu)化、密碼子優(yōu)化、改善前體供給和減少副產(chǎn)物生成等方法，證明了釀酒酵母菌株可以利用葡萄糖從頭生產(chǎn)柚皮素。在批量培養(yǎng)體系中，柚皮素的含量超過了400 μmol/L，相較于之前的大腸桿菌菌株，產(chǎn)量增長了4 倍以上［61-63］。Rodriguez等人［64］在前期香豆酸生產(chǎn)菌株的研究基礎(chǔ)上，通過過表達4CL、CHS、CHI與CHR等基因，實現(xiàn)了柚皮素、甘草素、山奈酚、5-去氫山奈素、槲皮素和非瑟酮的從頭合成。因此，構(gòu)建高產(chǎn)的酵母菌株是進一步合成黃酮類化合物的重要途徑，表2 總結(jié)了近幾年來黃酮類化合物在酵母菌株中的合成進展。

表2 釀酒酵母合成黃酮類化合物的相關(guān)研究Tab.2 Research on the synthesis of flavonoids production inS. cerevisiae

2 微生物合成黃酮類化合物的優(yōu)化策略

隨著合成生物學與代謝工程的迅速發(fā)展，已實現(xiàn)了多種黃酮類化合物的微生物合成，但生產(chǎn)效率低、規(guī)模小，無法實現(xiàn)目標產(chǎn)物的高效合成。本文將從前體與輔因子優(yōu)化、關(guān)鍵酶高效與靶向表達、代謝通道構(gòu)建與微生物共培養(yǎng)技術(shù)等方面進行討論，為黃酮類化合物的高效生產(chǎn)提供優(yōu)化策略。

2.1 黃酮類化合物生物合成前體的優(yōu)化

代謝通量不平衡是難以實現(xiàn)微生物高效合成黃酮類化合物的主要因素之一。作為黃酮類化合物合成前體，酪氨酸、苯丙氨酸與丙二酰輔酶A，同時也是維持細胞生長的必需前體［72］，因此目標產(chǎn)物合成常受到前體供給不足的限制［73-74］。通過合理改造代謝途徑，平衡細胞生長和產(chǎn)物合成之間的碳通量，并引導其流向黃酮類化合物合成途徑是實現(xiàn)其高效合成的重要前提條件。

通過直接添加前體化合物作為初始底物在一定程度上能夠提高目標黃酮類化合物產(chǎn)量［43，45-46，75］，但無法避免內(nèi)源性途徑的競爭消耗，且中間產(chǎn)物積累對微生物宿主也有毒性。通過基因缺失、過度表達與基因組整合等方法，調(diào)控微生物代謝網(wǎng)絡，將碳源轉(zhuǎn)化為黃酮類化合物合成前體，可提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量［48-49，76-78］。例如，過表達或突變乙酰輔酶A合酶和乙酰輔酶A羧化酶增加酶活性來提高丙二酰輔酶A含量［41，79-80］。此外，可添加脂肪酸抑制劑淺藍菌素（Cerulenin）或抑制β-酮脂酰ACP 合成酶FabB和FabF基因的表達，延緩丙二酰輔酶A 的自然降解，抑制脂肪酸合成過程對丙二酰輔酶A的消耗［81］。

構(gòu)建動態(tài)調(diào)控元件微調(diào)細胞生長和產(chǎn)物合成之間的碳通量是提高微生物合成效率的另一種思路［42，82-84］。Wu 等人［82］通過反義RNA 對大腸桿菌脂肪酸通路進行調(diào)控，使黃酮類化合物合成通路中丙二酰輔酶A含量增加，結(jié)果（2S）-柚皮素的生產(chǎn)效價提高了431%。通過CRISPR 干擾敲除脂肪酸生物合成基因fabB、fabI和fabF，增加細胞內(nèi)丙二酰輔酶A 的濃度，使白藜蘆醇的產(chǎn)量提高到188.1 mg/L，相比對照菌株提高了6倍［83］。此外，選擇耶氏酵母屬、念珠菌屬、油脂酵母屬和紅酵母屬等可積累大量丙二酰輔酶A 的微生物作為黃酮合成的宿主［29，85-87］，也可以在一定程度上改善前體供應不足的問題。

2.2 黃酮類化合物生物合成輔因子優(yōu)化

輔因子的供應對黃酮類化合物合成途徑關(guān)鍵酶的活性表達有重要影響，從而進一步影響目標產(chǎn)物產(chǎn)率。細胞自身產(chǎn)生的腺嘌呤核苷三磷酸（Ade?nosine triphosphate，ATP）能夠保證細胞自身各項生命活動，但異源黃酮合成途徑對ATP 的需求會超過細胞原有的產(chǎn)出。因此，增加黃酮生物合成通路中的ATP 供應十分重要。在Tao 等人［32，88］的研究中采用CRISPR 干擾技術(shù)篩選了與ATP 合成相關(guān)的候選基因，發(fā)現(xiàn)上調(diào)metK基因和proB基因能增加ATP含量，使喬松素產(chǎn)量提高至165.31 mg/L，比對照菌株高10.2倍。另外，還原型輔酶Ⅱ（NADPH）輔因子作為合成代謝的供氫體，不僅參與細胞體內(nèi)羥化反應，也是Ⅱ類P450酶重要輔助因子［89］。通過加強戊糖磷酸途徑代謝通量，改善細胞內(nèi)的NADPH 水平，能夠提高P450 酶的活性。Zhao 等人［90］將生產(chǎn)兒茶酸菌株中的pgi基因（編輯葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶）和ppc基因（編碼PEP 羧化酶）敲除，提高細胞內(nèi)NADPH 的水平，使兒茶酸的產(chǎn)量比對照菌株相比高出943%。根據(jù)黃酮類化合物合成途徑酶活性表達的條件，優(yōu)化FAD（黃素腺嘌呤二核苷酸）［91］、亞鐵血紅素［92］等輔助因子的供應［32］，均可在一定程度上提升黃酮類化合物的產(chǎn)量。

2.3 優(yōu)化途徑酶的高效表達與靶向性

過度表達黃酮類化合物合成途徑酶增加代謝通量，不僅會導致低效碳利用，還會給細胞帶來代謝負擔［93-94］。因此，提高限速酶活性實現(xiàn)目標化合物高效合成的同時平衡基因表達保持最佳細胞生長狀態(tài)也十分重要。例如，為篩選較高活性的4CL，通過TtgR 調(diào)控系統(tǒng)設計感知4CL 產(chǎn)物積累量的生物傳感器［94-95］，識別體內(nèi)定向進化后活性增強的4CL突變體，使柚皮素的產(chǎn)量有所增加［95］。

此外，在大腸桿菌中實現(xiàn)黃酮類化合物高效合成，需改善合成途徑中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的植物細胞色素P450 單加氧酶的功能表達。通過對宿主大腸桿菌進行改造、優(yōu)化反應體系以及利用來自細菌的非P450 單加氧酶和羥化酶對P450 酶進行替換，可改善黃酮類化合物生物合成途徑的限速反應。對于其他異源基因在宿主菌中的低效表達，通過選擇合適的啟動子、優(yōu)化密碼子以及通過優(yōu)化UTR（mRNA降解過程中發(fā)揮作用）提高mRNA 穩(wěn)定性等方法，均能在一定程度上提高基因的表達率。

微調(diào)關(guān)鍵酶基因不同組成成分（如啟動子強度、核糖體結(jié)合位點強度）可以有效平衡基因表達水平［96］，但當目標黃酮類產(chǎn)物合成通路涉及多條靶基因時，實現(xiàn)關(guān)鍵酶基因平衡表達耗時耗力［32］。在一項研究中，通過構(gòu)建基因啟動子的所有組合，通過迭代高通量篩選，徹底調(diào)整微生物中柚皮素的生物合成途徑，最終柚皮素的產(chǎn)量可達到191.9 mg/L［42］。除了要考慮途徑酶的平衡表達，還要考慮酶的催化環(huán)境和靶向性。例如，利用酵母菌株生產(chǎn)淫羊藿苷時，若在細胞質(zhì)中表達，通路中甲基轉(zhuǎn)移酶GmOMT2 會因細胞質(zhì)pH 低而失活，將該酶重新定位至釀酒酵母線粒體（pH高于細胞質(zhì)）后，首次實現(xiàn)了以葡萄糖為原料合成淫羊藿苷［71］。

2.4 優(yōu)化黃酮類化合物合成代謝通道

天然黃酮類化合物是植物為抵抗外源刺激與微生物侵染而產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，對微生物宿主細胞存在一定的毒性。因此，通過采用代謝通道技術(shù)，將反應物從一個活性位點直接轉(zhuǎn)移至另一個活性位點，實現(xiàn)底物向黃酮類化合物的高效轉(zhuǎn)化，可有效降低細胞代謝負擔、毒性中間體積累以及防止底物擴散［97-98］。設計蛋白支架，控制酶促反應的空間區(qū)域，可實現(xiàn)底物的充分利用和酶的高效表達［99］。例如，在Zhao 等人［90］的研究中，采用組合策略，將兒茶素合成途徑中的F3H、DFR 和LAR 等酶的結(jié)構(gòu)域構(gòu)建成特定的合成蛋白支架，實現(xiàn)代謝通道結(jié)構(gòu)，使兒茶素的產(chǎn)量增加了155.6%。在甲戊酸、葡糖二酸等物質(zhì)生物合成過程中引入蛋白支架，也在一定程度上提高了產(chǎn)量［99］。然而，目前合成蛋白支架在黃酮類化合物生物合成方面鮮有應用，但與其相似的方法卻已有所涉及。將黃酮類化合物合成途徑酶組裝為復合體，雖然不是真正的支架復合體，但原理都是將酶強制靠近，減少中間體的積累，消除路徑瓶頸［100］。例如，通過開發(fā)黃芩素兩個途徑酶的序列自組裝酶反應器，在大腸桿菌中成功實現(xiàn)了蛋白-肽相互作用［101］，優(yōu)化了黃芩素的生物合成途徑，使黃芩素和野黃芩素等產(chǎn)物產(chǎn)率都有所提升［101］。

2.5 微生物共培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)黃酮類化合物

黃酮類化合物合成菌株代謝途徑復雜，傳統(tǒng)的微生物代謝工程主要使用單一的菌株構(gòu)建黃酮類化合物生產(chǎn)平臺，使菌體負荷過大，目標產(chǎn)物的產(chǎn)量也受到限制。因此，可通過共培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建高效的合成通路，提高生產(chǎn)性能［102］。例如，Jones 等人將花青素合成途徑涉及的15 個外源基因整合到4 個不同的大腸桿菌菌株中，獲得的混合菌株培養(yǎng)體系能夠從葡萄糖從頭生成阿福豆素和翠菊苷。共培養(yǎng)可以克服單一物種的固有限制，同時利用大腸桿菌和釀酒酵母生產(chǎn)黃酮類化合物［102］。P450 酶在大腸桿菌中很難實現(xiàn)功能表達，Wang等人［71］將淫羊藿苷合成途徑分為釀酒酵母部分與大腸桿菌部分，不僅可以發(fā)揮大腸桿菌快繁的優(yōu)勢，同時也能利用釀酒酵母完整的胞內(nèi)酶系統(tǒng)，實現(xiàn)膜蛋白酶的成功表達。微生物共培養(yǎng)體系在緩解菌體代謝負擔、避免中間產(chǎn)物負反饋作用以及為不同的酶營造適宜生長環(huán)境等方面均優(yōu)于單一菌株培養(yǎng)體系，但仍然無法避免不同菌株之間無親和性、底物競爭性、代謝中間體轉(zhuǎn)運困難等問題［103］。代謝產(chǎn)物運輸?shù)南拗坪碗y以保持穩(wěn)定可靠的共培養(yǎng)體系是該方法廣泛應用的主要挑戰(zhàn)［38］。因此，進一步優(yōu)化現(xiàn)有的共培養(yǎng)體系或?qū)で笮碌牟呗詠砜朔@一問題十分重要。

2.6 其他問題

近20年來，多種代謝工程技術(shù)和策略已用于黃酮類化合物的微生物合成，然而部分相關(guān)酶功能尚不清晰，已知功能的酶數(shù)量有限。隨著研究的不斷深入，已有研究通過對現(xiàn)有的酶進行定向進化，以期獲得特定活性的酶。例如，Wu 等人［104］通過計算機快速測試蛋白空間序列，篩選出具有預期活性的酶突變體，為新酶的發(fā)現(xiàn)提供了新的方法，但實現(xiàn)對蛋白質(zhì)從頭設計還是具有一定的挑戰(zhàn)性。在最近的研究中，通過調(diào)節(jié)分子間和分子內(nèi)相互作用，開發(fā)出了酶從頭合成的新方法，極大地促進了生物合成新途徑的構(gòu)建［105］。

3 總結(jié)與展望

黃酮類化合物作為一種在人類健康與醫(yī)療領(lǐng)域具有巨大應用潛力的植物次生代謝產(chǎn)物，對其進行微生物合成途徑的研究具有重要科研意義與經(jīng)濟價值。但傳統(tǒng)生產(chǎn)方法成本高、提取工藝復雜，產(chǎn)品效價與收率低，難以大規(guī)模生產(chǎn)應用。隨著黃酮類化合物合成途徑酶的鑒定與驗證，以及分子生物學與合成生物學的快速發(fā)展，黃酮類化合物微生物合成途徑得到了深入的研究，并取得大量成果，但仍然無法滿足工業(yè)化需求。為進一步優(yōu)化現(xiàn)有合成體系，需要不斷尋找新的策略以及技術(shù)克服黃酮化合物微生物合成中面臨的問題與挑戰(zhàn)。

黃酮類化合物的從頭合成途徑較長，因此，微生物共培養(yǎng)技術(shù)與動態(tài)調(diào)控技術(shù)可能是今后研究中提高產(chǎn)率的主要策略。通過擴大共培養(yǎng)技術(shù)中微生物的種類，并根據(jù)各種微生物的生理生化特點與培養(yǎng)特性，對代謝途徑進行合理分工，均能在一定程度上提高黃酮類產(chǎn)物的產(chǎn)量。利用高通量篩選與動態(tài)調(diào)控技術(shù)，調(diào)控菌株間的相互作用與各反應步驟之間的動態(tài)平衡，有望實現(xiàn)從頭高效合成黃酮類化合物。我們相信，隨著研究逐漸深入與技術(shù)不斷發(fā)展，終能實現(xiàn)微生物合成黃酮類化合物的工業(yè)化生產(chǎn)。