胺碘酮對房顫大鼠的藥效與肝臟伴隨毒副作用研究

戴雨晨，沈月紅，桑 明，徐一嬌，秦 瑜，曹 鵬，2*，周 謙*

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇南京210028；2.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇南京210023）

房顫是一種在老年人群中常見的心律失常［1］。研究顯示房顫會導(dǎo)致中風、心力衰竭［2］、心肌梗死等嚴重并發(fā)癥［3］。近年來，房顫的全球流行率和治療成本激增［4］，在中國，35 歲及以上的居民中有526 萬人患有房顫。其患病率與高齡、心肌梗死、左心室肥大（LVH）、肥胖和飲酒等有關(guān)［5］。作為經(jīng)典的III類抗心律失常藥物，胺碘酮具有延長動作電位持續(xù)時間和復(fù)極時間、維持竇性心律、延長有效不應(yīng)期、減慢傳導(dǎo)速度、消除折返激動等作用，是有效的房顫治療藥物［6］。然而，長期臨床實踐表明胺碘酮代謝緩慢、心外毒性高、易與華法林等藥物相互作用［7］、易導(dǎo)致肝硬化［8］、肺纖維化［9］和甲狀腺功能障礙［10］等。因此，胺碘酮在臨床上的應(yīng)用是一把“雙刃劍”，近三分之一的患者由于嚴重的不良反應(yīng)無法維持長期治療［11-12］。

Ammi visnaga是原產(chǎn)于北非、亞洲和歐洲地中海地區(qū)的一年生或兩年生傘形花序植物，在很久之前就被用于亞洲和中東的民族醫(yī)學制劑，如今被廣泛種植以獲得提取物或活性成分［13］。呋喃并色酮（Khellin）是從Ammi visnaga的果實中分離的含有苯并呋喃部分的化合物［14-15］。Anrep 最初發(fā)現(xiàn)Khellin對狗的冠狀動脈具有選擇性擴張作用，臨床研究表明Khellin 能夠明顯緩解心絞痛患者疼痛癥狀，之后Labze 實驗室在Khellin 結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上增加了苯呋喃基團合成了Khellin 衍生物-乙胺碘呋酮，簡稱胺碘酮（圖1）［16-18］。胺碘酮的毒副作用可能與胺碘酮的結(jié)構(gòu)有關(guān)［19］。胺碘酮結(jié)構(gòu)中親脂性的一端易集中在脂肪含量高的器官中，導(dǎo)致肝臟、肺和脂肪等組織廣泛的脂質(zhì)沉積等超微結(jié)構(gòu)變化［20］。此外，由于胺碘酮分子富含碘且結(jié)構(gòu)與甲狀腺素相似，會干擾甲狀腺素的合成及釋放，導(dǎo)致游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）和游離四碘甲狀腺原氨酸（FT4）降低，促進肝硬化的形成［21-22］。Li-Qin Jiang 等在探討胺碘酮和決奈達隆單獨或與肝保護劑多烯磷脂酰膽堿聯(lián)合使用對甲狀腺功能和脂質(zhì)代謝的影響時發(fā)現(xiàn)胺碘酮易引起血脂異常和甲狀腺功能不全，增加膽固醇（TC）、低密度脂蛋白受體（LDL-C）等的水平［23］。Kannan R 等發(fā)現(xiàn)胺碘酮會導(dǎo)致健康新西蘭兔血清TG 和TC 含量升高，指出胺碘酮可能會對血脂產(chǎn)生不利影響［24］。Amira Motawea 等發(fā)現(xiàn)胺碘酮治療組大鼠的脂質(zhì)譜中TG 含量高于對照組［25］。Philippe Lettéron 等指出小鼠單劑量服用胺碘酮（1 mmoL/Kg）后可顯著抑制脂肪酸氧化，導(dǎo)致脂肪變性［26］。臨床研究直接指出，胺碘酮會導(dǎo)致房顫患者血清膽固醇升高［27］、劑量依賴性增加TC［28］等。

圖1 胺碘酮的化學結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structure of amiodarone

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（SREBP2）的上調(diào)可以驅(qū)動HMGCR 的轉(zhuǎn)錄和膽固醇生物合成，促進膽固醇積累［29］。SREBPs 裂解激活蛋白（SCAP）和胰島素誘導(dǎo)基因蛋白（INSIGs），包括INSIG1 和INSIG2，對SREBPs從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）到高爾基體的運輸至關(guān)重要［30］。INSIGs 通過結(jié)合HMGCR 和SCAP，以固醇依賴的方式調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)［31-32］，當INSIGs 與SCAPSREBPs復(fù)合物結(jié)合，SREBPs從ER到高爾基體的運輸被阻斷，脂質(zhì)合成降低［33］。同時，膽固醇穩(wěn)態(tài)由SREBP 途徑控制，當膽固醇水平下降時，SCAP 和INSIG 分離，SREBP2-SCAP 復(fù)合物轉(zhuǎn)運至高爾基體，SREBP2 水解形成游離形式轉(zhuǎn)運至細胞核激活膽固醇合成和攝?。?4］。Allen LB 等在探究胺碘酮對培養(yǎng)的神經(jīng)元和非神經(jīng)元細胞以及服用胺碘酮的個體膽固醇代謝的影響時發(fā)現(xiàn)，胺碘酮以劑量依賴性方式抑制24-脫氫膽固醇還原酶（DHCR24）增加膽固醇前體［35］。但是胺碘酮是如何影響膽固醇合成，是否與HMGCR、INSIG1、SCAP 和SREBP2 的基因和蛋白表達相關(guān)尚無報道。

目前，關(guān)于胺碘酮對血脂和肝臟毒性影響的機制尚不明確，本研究試圖通過給予房顫大鼠胺碘酮灌胃治療，探討其治療房顫的藥效、對血脂和肝臟毒性的影響以及影響膽固醇合成的可能機制。

1 儀器與試劑

1.1 試驗藥材與試劑

胺碘酮（純度≥98%，批號HY-14188，MCE 公司）；乙酰膽堿（純度≥98%，批號A6625，SIGMA 公司）；氯化鈣（批號10043-52-4，西隴科學股份有限公 司）；Trizol Reagent（批 號15596018，Ambion 公司）；RIPA 裂解液（批號P0013C，Beyotime 公司）；多聚甲醛（純度≥95%，批號20161012，上海凌峰化學試劑有限公司）；Western 一抗稀釋液（批號P0023A，Beyotime 公司）；INSIG1、HMGCR、SCAP、SREBP2 抗體（批號A16278、A19063、A18401、A13049，Abclonal公司）；大鼠AST、ALT、TC、TG ELISA 試劑盒（批號AE4091、AE4102、AE4104、AE4105，南京善本生物科技有限公司）；LDL-C 試劑盒（批號A113-1-1，南京建成生物工程研究所）；HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 試 劑 盒（批 號R323-01、Q711-02，南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；IN?SIG1、HMGCR、SCAP、SREBP2、GAPDH 引物（南京金斯瑞生物科技股份有限公司）。

1.2 試驗儀器

十二導(dǎo)自動分析心電圖機（FX-7402，北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司）；Vevo 3100 高分辨動物超聲影像系統(tǒng)（加拿大VisualSonics公司）；Multiskan全波長酶標儀（美國Thermo Scientific 公司）；Eppendorf小型臺式高速冷凍離心機（5417R，德國Eppendorf公司）；Western blot 電泳儀（Mini Protean 3 Cell，BIO?RAD）；轉(zhuǎn)膜儀（Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，BIORAD）；Odyssey 近紅外雙色激光成像系統(tǒng)（美國LICOR 公司）；Applied Biosystems VeritiPro PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司）；ABI 7500 Real-Time PCR system PCR 儀（美國Applied Biosys?tems公司）。

1.3 試驗動物

雄性SD 大鼠，8周齡，體質(zhì)量（200±20 g），適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，生產(chǎn)批號SCXK（滬）2013-0016。實驗動物飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心，飼養(yǎng)溫度為23℃~25℃，濕度40%~70%。實驗過程符合《江蘇省實驗動物管理條例》等實驗動物道德倫理的相關(guān)規(guī)定，動物實驗倫理審查表編號：AEWC-20210716-159。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

健康雄性SD 大鼠18 只，隨機分為對照組（n=5），模型組（n= 6）和胺碘酮組（n= 7）。采用Ach（33 μg/mL）-CaCl2（5 mg/mL）混合溶液（0.1 mL/100 g，新鮮配置）尾靜脈注射的方法制備大鼠房顫模型［36-39］。模型組大鼠尾靜脈注射造模藥物，隔天注射1 次，共注射10 次。胺碘酮組大鼠隔天注射造模藥物，并在第7 天起每日口服50 mg/kg 胺碘酮［36，40］。對照組大鼠給予同體積的生理鹽水。

2.2 大鼠心功能的檢測

末次給藥后24 h，采用吸入式麻醉的方法使大鼠吸入氧氣和異氟烷混合氣體并使其進入輕度昏迷狀態(tài)，使用Vevo 3100 高分辨動物超聲影像系統(tǒng)對大鼠進行超聲心動圖檢查。測量LAD、LA Area、左心室收縮期前壁厚度（LVAW；s）、左心室舒張期前壁厚度（LVAW；d）、左心室收縮期后壁厚度（LVPW；s）和左心室舒張期后壁厚度（LVPW；d），計算射血分數(shù)（EF）和左心室短軸縮短率（FS）。

FS =（VLVd- VLVs）/VLVd×100%。 EF =（LVEDd -LVESd）/LVEDd×100%。

2.3 心電圖數(shù)據(jù)收集

吸入式麻醉的方法使大鼠進入輕度昏迷狀態(tài)，電子心電圖機連接大鼠肢體導(dǎo)聯(lián)，尾靜脈注射Ach-CaCl2溶液或生理鹽水，同時記錄心電圖，給藥后恢復(fù)竇性心律時停止記錄。記錄房顫誘發(fā)時間和持續(xù)時間，計算RR間期。

2.4 大鼠體質(zhì)量及肝系數(shù)的測定

隔天對大鼠的體質(zhì)量進行稱量并記錄。末次給藥后24 h 眶靜脈取血，處死大鼠剖取肝臟，拍照觀察肝組織外觀形態(tài)并稱量質(zhì)量，計算肝臟系數(shù)。肝系數(shù)=（肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量）×100%。

2.5 大鼠肝臟組織病理學形態(tài)觀察

4%多聚甲醛固定肝臟組織，經(jīng)梯度脫水、浸蠟包埋、切片貼片、常規(guī)脫蠟、二甲苯透明后，再經(jīng)梯度乙醇脫水，中性樹膠封片后在光學顯微鏡下進行肝臟組織形態(tài)學觀察。H＆E 染色觀察肝細胞形態(tài)變化；Masson染色和Sirius Red染色檢測肝臟中膠原纖維，并使用ImageJ 1.53a 進行定量評分。

2.6 大鼠血清生化指標檢測

離心30 min（2000 rpm）分離血清，ELISA法測定AST、ALT、TG、TC和LDL-C水平。

2.7 qRT-PCR 檢測大鼠肝臟組織中INSIG1、HMGCR、SCAP、SREBP2 等膽固醇合成相關(guān)基因的表達

取肝臟組織適量，加入Trizol 1 mL進行研磨，提取上層RNA 溶解物后測濃度。提取總RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件是37℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85℃5 s 合成cDNA。設(shè)定PCR 反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min；95℃15 s；57℃20 s；72℃30 s；60℃15 s。平均相對含量采用2-ΔΔCt公式，以GAPDH 為內(nèi)參，計算mRNA的相對表達量。PCR引物序列設(shè)計見表1。

表1 用于實時定量PCR 檢測的引物序列Tab.1 Primer sequences for Real-time quantitative PCR assay

2.8 Western blot 檢測大鼠肝臟組織中INSIG1、HMGCR、SCAP、SREBP2 等膽固醇合成相關(guān)蛋白的表達

各組大鼠取肝臟組織，剪碎并按質(zhì)量與體積比1：9 比例加入RIPA 裂解液，勻漿后12000 rpm 30 min 取上清，采用BCA 定量法將蛋白調(diào)整到統(tǒng)一濃度，加入上樣緩沖液混勻，100℃條件下煮樣8 min后進行電泳。電泳結(jié)束后冰浴環(huán)境將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂牛奶室溫封閉1 h，4℃孵育一抗（INSIG1、HMGCR、SCAP、SREBP2）過夜，后用TBST清洗3次，室溫孵育二抗2 h，TBST 清洗后用Odyssey 近紅外雙色激光成像系統(tǒng)顯影，ImageJ 1.53a 分析蛋白條帶強度。

2.9 統(tǒng)計學方法

Graphpad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本資料t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 試驗結(jié)果

3.1 胺碘酮對房顫大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能影響

與對照組相比，模型組大鼠LAD 顯著增加（P＜0.01），LA Area 顯著增加（P＜0.05）（圖2），LVPW；d顯著減?。≒＜ 0.05）。較模型組，胺碘酮組LAD 縮短約13.1%（P＜ 0.01），LA Area 縮小約22.7%（P＜0.01），表明胺碘酮改善了房顫大鼠的心房擴大現(xiàn)象。值得注意的是，胺碘酮同時延緩了AF 大鼠的心功能下降趨勢（表2）。LVAW、s 和LVAW、d 和LVPW、s 在各組中沒有統(tǒng)計學差異，詳細超聲數(shù)據(jù)見表2。

圖2 胺碘酮改善AF大鼠心臟形態(tài)和功能Fig.2 Amiodarone improved cardiac morphology and function in AF rats注：與對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，##P＜0.01（±s，n（Control）=5，n（Model）=6，n（Amiodarone）=7）。

表2 房顫大鼠的超聲心動圖參數(shù)Tab.2 Echocardiographic parameters of atrial fibrillation rats（±s，n（Control）=5，n（Model）=6，n（Amiodarone）=7）

表2 房顫大鼠的超聲心動圖參數(shù)Tab.2 Echocardiographic parameters of atrial fibrillation rats（±s，n（Control）=5，n（Model）=6，n（Amiodarone）=7）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

Group對照組（n=5）EF（%）FS（%）LVAW；s（mm）3.35±0.17 LVAW；d（mm）2.05±0.17 LVPW；s（mm）3.42±0.29 LVPW；d（mm）83.30±4.69 53.76±5.27模型組（n=6）胺碘酮組（n=7）80.15±1.87 49.58±2.81 2.05±0.10 3.14±0.23 82.77±5.08 52.96±4.43 1.97±0.15 3.66±0.21 2.21±0.14*3.22±0.35 2.01±0.18 3.58±0.15 2.29±0.39

3.2 胺碘酮對房顫大鼠心電活動的影響

房顫發(fā)生時，心電圖特征包括p波消失、出現(xiàn)一系列不規(guī)則f 波、心室律絕對不規(guī)則（R-R 間期不等）［24］等。模型組和胺碘酮組大鼠尾靜脈給予Ach-CaCl2混合液，對照組大鼠尾靜脈給予生理鹽水，給藥同時監(jiān)測心電圖?？芍睇}水不對大鼠心電圖造成影響（圖3a）；Ach-CaCl2導(dǎo)致大鼠心電圖p 波消失，代之以波形較小且不規(guī)則的基線波動，形態(tài)與振幅均變化不定的f 波（房顫波），R-R 間期不等，表現(xiàn)出了典型的房顫的心電圖，之后恢復(fù)竇律（圖3a）。較模型組，胺碘酮組的房顫誘發(fā)時間延緩了72.6%（圖3b，P＜ 0.01），房顫持續(xù)時間縮短了37.3%（圖3c，P＜ 0.01），RR 間期趨于相等（圖3a）。以上結(jié)果提示，胺碘酮能夠顯著抑制由Ach-CaCl2誘發(fā)的大鼠房顫。

圖3 胺碘酮對AF大鼠心電圖的影響Fig.3 The effect of amiodarone on the electrocardiogram in AF rats注：與對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01（±s，n（Control）=5，n（Model）=6，n（Amiodarone）=7）。

3.3 胺碘酮對房顫大鼠體質(zhì)量和肝系數(shù)的影響

圖4a 所示，實驗大鼠肝臟組織顏色紅潤，質(zhì)地較軟，表面光滑，邊緣整齊且厚薄一致。與對照組相比，模型組大鼠肝臟呈現(xiàn)彌漫性腫大，表面尚光滑，顏色和質(zhì)地無明顯變化；胺碘酮組大鼠肝臟雖然顏色、質(zhì)地等無明顯變化，但相比對照組和模型組大鼠肝臟表現(xiàn)出了不同程度的腫大現(xiàn)象。各組大鼠在給藥期體重間無明顯差異（圖4b，P>0.05）。圖4c 顯示，與對照組相比，模型組大鼠肝系數(shù)增加了7.36%（P＜0.01）。與模型組相比，胺碘酮組大鼠肝臟系數(shù)進一步上升了約9.18%（P＜0.01），提示胺碘酮可能導(dǎo)致了肝臟組織擴大現(xiàn)象。

圖4 胺碘酮增加AF大鼠的肝系數(shù)Fig.4 Amiodarone increased liver coefficient in AF rats注：與對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01（±s，n（Control）=5，n（Model）=6，n（Amiodarone）=7）。

3.4 胺碘酮對房顫大鼠肝組織病理學變化的影響

H＆E 染色結(jié)果顯示，對照組肝細胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀整齊排列，胞質(zhì)均勻，肝細胞無脂肪變性、壞死；與對照組相比，模型組可見肝臟呈彌漫樣的脂肪變性，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞并腫大，肝小葉及匯管區(qū)內(nèi)有大量炎性細胞浸潤；與模型組相比，胺碘酮組上述形態(tài)學變化更加明顯（圖5a）。Masson 染色結(jié)果顯示模型組肝臟組織存在明顯的膠原纖維自匯管區(qū)周圍向外延伸，纖維條索較粗且染色著色較深，肝組織間質(zhì)纖維化明顯（圖5a-b，P＜ 0.01）；與模型組相比，胺碘酮組間質(zhì)纖維化比例進一步加重（圖5a-b，P＜0.01）。Sirius Red 染色結(jié)果顯示模型組大鼠肝結(jié)締組織、肌束和血管膜中出現(xiàn)I 型及III 型膠原纖維沉積（圖5a 和5c，P＜0.01）；與模型組相比，胺碘酮組大鼠結(jié)締組織、肌束和血管膜中I 型及III 型膠原纖維沉積比例加重（圖5a和5c，P＜0.01）。

圖5 胺碘酮致AF大鼠肝組織病理學改變Fig.5 Amiodarone caused histopathological changes in liver tissue in AF rats注：與對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01（±s，n（Control）=5，n（Model）=6，n（Amiodarone）=7）。

3.5 胺碘酮對房顫大鼠血清AST 和ALT 水平的影響

如圖6a 所示，與對照組比較，模型組血清AST輕微升高（P＜ 0.05），胺碘酮組血清AST 顯著上調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，胺碘酮組血清AST 進一步上升5.2%（P＜0.01）。圖6b所示，與對照組比較，模型組血清ALT 水平有升高趨勢，胺碘酮組血清ALT水平明顯升高（P＜0.05）。

圖6 胺碘酮增加AF大鼠血清AST和ALT Fig.6 Amiodarone increased serum AST and ALT in AF rats注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01（±s，n（Control）=5，n（Model）=6，n（Amiodarone）=7）。

3.6 胺碘酮對房顫大鼠血清TG、TC 和LDL-C 含量的影響

與對照組相比，模型組血清TG 有升高趨勢，胺碘酮組TG 水平顯著上調(diào)（圖7a，P＜0.01）。相比較模型組，胺碘酮組大鼠血清TG 進一步升高約29.0%（圖7a，P＜0.05）。與對照組相比，模型組大鼠血清TC 和LDL-C 水平顯著上調(diào)（圖7b-c，P＜0.01）。相比較模型組，胺碘酮組大鼠血清TC水平進一步上升約31.91%（圖7b，P＜ 0.01），LDL-C 水平進一步升高7.8%（圖7c，P＜0.05）。

圖7 胺碘酮增加AF大鼠血清TG、TC 和LDL-C Fig.7 Amiodarone increased serum TG，TC and LDL-C in AF rats注：與對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01（±s，n（Control）=5，n（Model）=6，n（Amiodarone）=7）。

3.7 胺碘酮對房顫大鼠肝組織INSIG1、SCAP、SREBP2、HMGCR mRNA表達的影響

如圖8所示，與對照組相比，模型組大鼠肝組織INSIG1 mRNA 表達水平降低（圖8a，P＜ 0.01），SCAP、SREBP2、HMGCR mRNA 表達水平顯著升高（圖8b-d，P＜ 0.01），其中INSIG1 含量降低約20%（圖8a，P＜ 0.01），SCAP、SREBP2、HMGCR 含量分別上調(diào)50%，31%和160%（圖8b-d，P＜ 0.01）。與模型組比較，胺碘酮組大鼠肝臟的SCAP 的mRNA含量約為模型組的2 倍（圖8b，P＜ 0.01），SREBP2為模型組的1.7倍（圖8c，P＜0.01），HMGCR 為模型組的1.5倍（圖8d，P＜0.01），INSIG1為模型組的0.6倍（圖8a，P＜0.01）。

圖8 胺碘酮上調(diào)AF大鼠SCAP、SREBP2、HMGCR mRNA表達，下調(diào)INSIG1 mRNA表達Fig.8 Amiodarone up-regulated the expression of SCAP，SREBP2，HMGCR mRNA and down-regulated the expression of INSIG1mRNA in AF rats注：與對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01（±s，n（Control）=5，n（Model）=6，n（Amiodarone）=7）。

3.8 胺碘酮對房顫大鼠肝組織INSIG1、SCAP、SREBP2、HMGCR蛋白表達的影響

圖9a 為每組隨機選取2 只大鼠肝臟組織經(jīng)Western 印 跡 檢 測INSIG1、SCAP、SREBP2 和HMGCR蛋白表達水平代表圖。與qRT-PCR結(jié)果相一致，與對照組相比，模型組大鼠肝臟內(nèi)SCAP、SREBP2 和HMGCR 的蛋白相對表達量增加（圖9ab，P＜ 0.01），INSIG1 的蛋白表達量降低（圖9a-b，P＜0.01）；相較于模型組，胺碘酮組的SCAP 的表達量約為模型組的1.6 倍（圖9a-b，P＜0.01），SREBP2的表達量約為模型組的1.3 倍（圖9a-b，P＜ 0.01），HMGCR 的表達量約為模型組的1.2 倍（圖9a-b，P＜ 0.01），INSIG 的表達量約為模型組的7/10（圖9a-b，P＜ 0.01）。提示，胺碘酮可能通過促進膽固醇合成路徑導(dǎo)致肝臟毒性和血脂異常。

圖9 胺碘酮上調(diào)AF大鼠SCAP、SREBP2、HMGCR蛋白表達，下調(diào)INSIG1蛋白表達Fig.9 Amiodarone up-regulated SCAP，SREBP2，HMGCR protein expression and down-regulated INSIG1 protein expression in AF rats注：與對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01（±s，n（Control）=5，n（Model）=6，n（Amiodarone）=7）。

4 討論

Ammi visnaga是一種來自地中海傘形科的草本植物，是血管擴張劑呋喃色酮的寶貴來源，傳統(tǒng)上用于治療心絞痛和作為鎮(zhèn)痙劑［41］。從Ammi visnaga中提取出有效活性成分Khellin和Visnagin具有抗炎和鎮(zhèn)痛特性［42-43］。現(xiàn)代醫(yī)學常使用這些活性物質(zhì)或結(jié)構(gòu)衍生物治療白癜風、支氣管哮喘和腎絞痛等［43］。Duarte J 等發(fā)現(xiàn)Visnagin 可以通過多種機制抑制大鼠胸主動脈環(huán)收縮反應(yīng)［44］。Fu HR 等首次在大鼠模型研究中指出Visnagin 可能通過誘導(dǎo)自噬和減少細胞凋亡對缺血/再灌注損傷后的大鼠心臟具有潛在保護作用［45］。Abukhalil MH 等發(fā)現(xiàn)Visnagin可以通過減輕氧化應(yīng)激和炎癥以及上調(diào)Nrf2 信號預(yù)防異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌受損［46］。Anrep等發(fā)現(xiàn)Khellin 具有擴張冠狀動脈的作用，同時相比硝酸酯具有更好的選擇性，不會引起全身血管擴張和降低血壓。胺碘酮源于Ammi visnaga提取物Khe?lin［16-18］。

房顫是臨床上最常見的心律失常，房顫的發(fā)生風險隨年齡增長及潛在基礎(chǔ)病的存在和嚴重程度而增加，男性患病率高于女性，容易導(dǎo)致中風、外周栓塞和死亡等［47-48］。當前，Ach-CaCl2誘導(dǎo)的陣發(fā)性大鼠房顫模型是近年來廣泛應(yīng)用的實驗方法［36-39］。其中，Ach 可以作用于心房肌膽堿能M2 受體，激活受體依賴的鉀通道引起鉀離子外流增加，導(dǎo)致心房肌細胞復(fù)極加快，動作電位時程及有效不應(yīng)期縮短［36］。氯化鈣溶液會引起心房肌細胞鈣超載，鈣離子通道改變誘導(dǎo)心房電重構(gòu)，促進房顫的發(fā)生［49］。我們通過使用Ach-CaCl2混合液誘導(dǎo)房顫大鼠模型，采用心電圖檢測，發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)心電圖p 波消失，代之以波形較小且不規(guī)則的基線波動，形態(tài)與振幅均變化不定的f 波（房顫波），心室律絕對不規(guī)則，表現(xiàn)出典型的房顫的心電圖，表明Ach-CaCl2混合液觸發(fā)了大鼠心房電重構(gòu)。應(yīng)用超聲心動圖觀察，發(fā)現(xiàn)Ach-CaCl2導(dǎo)致大鼠左心房出現(xiàn)擴大現(xiàn)象，提示Ach-CaCl2混合液介導(dǎo)了大鼠心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)。以此，我們證明了房顫模型復(fù)制成功。

胺碘酮是臨床房顫治療應(yīng)用最廣的復(fù)律藥物，同時具有I 類和III 類抗心律失常藥物的特性，可以通過降低心房肌細胞傳導(dǎo)速度和延長動作電位時程抑制折返還路，恢復(fù)或維持房顫電復(fù)律后竇性心律［50］。采用胺碘酮維持竇律一年有效率達67.5-70.8%［51］。我們的研究表明，與模型組相比，胺碘酮組大鼠房顫持續(xù)時間顯著減小、房顫誘發(fā)時間顯著延長，左心房內(nèi)徑和面積擴大現(xiàn)象被有力地抑制。我們首先從實驗的角度復(fù)制了胺碘酮對房顫的治療作用。

盡管胺碘酮治療房顫藥效顯著，但是其帶來的毒副作用不可忽視。研究表明，使用胺碘酮的患者中高達15%存在不良反應(yīng)，包括胃腸出血、肝臟毒性、甲狀腺功能減退和視力改變等［52］，其中脂代謝紊亂是最常見的一種［53］。我們的研究指出房顫大鼠血清TC、LDL-C 增加，而胺碘酮組大鼠血清TG、TC 和LDL-C 進一步升高，加重了房顫大鼠血脂異常。Michelle M. Angrish 等指出脂肪變性可發(fā)展為脂肪性肝炎和不可逆的肝病階段，包括肝纖維化等［54］。我們發(fā)現(xiàn)，胺碘酮導(dǎo)致房顫大鼠血清AST 和ALT升高、肝臟腫大且肝系數(shù)增加，肝臟組織細胞形態(tài)破壞，且存在肝細胞壞死現(xiàn)象，膠原纖維沉積加重，表明胺碘酮導(dǎo)致了房顫大鼠肝臟強烈的副作用。

INSIG 是近年來發(fā)現(xiàn)的調(diào)控脂肪代謝的新基因，其中INSIG1 在肝臟高表達［55］，且受SREBP 正調(diào)控［56］。SREBP2 可以促進膽固醇攝入和合成，在控制膽固醇和脂肪酸合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄中起著核心作用。SCAP 是處于ER 的一種膜蛋白，SCAPSREBP2-HMGCoA 通路對膽固醇攝入與合成的平衡起關(guān)鍵作用。當細胞內(nèi)膽固醇濃度降低時，SCAP從ER 運載SREBP2 到高爾基體，隨后SREBP2 被蛋白酶S1P 和S2P 水解，釋放出具有活性的N 末端轉(zhuǎn)錄因子片斷［57-58］，進入細胞核與靶基因啟動子上的固醇調(diào)節(jié)元件SRE-1 結(jié)合，激活靶基因（包括HMG?CoA 還原酶等）的轉(zhuǎn)錄［33，59-60］。當細胞內(nèi)膽固醇水平升高時，SCAP-SREBP2 復(fù)合物滯留在ER，LDLr/HMGCoA 還原酶基因的轉(zhuǎn)錄停止［54，56］。本研究證實胺碘酮通過下調(diào)INSIG1基因和蛋白表達水平，上調(diào)SREBP2、SCAP 和HMGCR 基因和蛋白表達水平從而導(dǎo)致體內(nèi)血脂異常。

胺碘酮是臨床常用藥物，治療房顫藥效確切，但會導(dǎo)致嚴重的肝毒性和血脂異常。因此，胺碘酮的安全性分析需得到更多關(guān)注。本研究初步證明胺碘酮可能通過影響膽固醇合成路徑，包括影響IN?SIG1、SCAP、SREBP2 和HMGCR 的基因和蛋白表達引起血脂異常。本研究初步探討胺碘酮治療房顫時的肝臟副作用及可能機制，可為臨床合理應(yīng)用胺碘酮并降低其不良反應(yīng)提供理論依據(jù)和診療思路。