蔬菜農(nóng)藥殘留模型樣品制備研究

尹麗穎 曹勁宏 宋 洋 馬 靜 吳 迪

（1.北京市懷柔區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全綜合質(zhì)檢站，北京 101400；2.北京市植物保護(hù)站，北京 100029）

在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測體系中，農(nóng)藥殘留模型樣品對整個檢測質(zhì)量控制體系起到核心作用，被廣泛應(yīng)用于儀器性能驗(yàn)證、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制、實(shí)驗(yàn)室間比對、檢測技能競賽、農(nóng)藥殘留研究等方面。蔬菜農(nóng)藥殘留模型樣品制備一般有兩種方法，分別是自然機(jī)體污染法和空白基質(zhì)加標(biāo)法。前者是將藥物直接噴施于蔬菜上，得到含有藥物的陽性樣品，后者是將藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至空白樣品中。兩種方法得到的樣品存在很大差別，前者目標(biāo)檢測物是與整個蔬菜相結(jié)合，符合現(xiàn)實(shí)蔬菜生產(chǎn)中噴施農(nóng)藥實(shí)際情況，后者是目標(biāo)檢測物僅在勻質(zhì)后的蔬菜糜中。蔬菜中農(nóng)藥殘留檢測的實(shí)施按流程可分為樣品制備、提取、凈化、測定、數(shù)據(jù)分析與結(jié)果報告等環(huán)節(jié)[1]。其中，樣品制備是檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，該環(huán)節(jié)采用空白基質(zhì)加標(biāo)法制備質(zhì)控樣品，雖然具有制備操作過程簡單、可以任意設(shè)計樣品的加標(biāo)濃度、可制備多種濃度的農(nóng)藥殘留模型等優(yōu)點(diǎn)[2]，但從檢測環(huán)節(jié)上不能做到對樣品制備環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，且容易出現(xiàn)樣品不均勻的問題。另外，其他一些對樣品處理、制備等環(huán)節(jié)需要有所質(zhì)控的實(shí)驗(yàn)研究，如研究不同清洗方法、不同儲存時間對蔬菜農(nóng)藥殘留的影響等，均需要采用自然機(jī)體污染法制備蔬菜農(nóng)藥殘留模型樣品。

蔬菜基質(zhì)復(fù)雜，研制以實(shí)物為基質(zhì)、均勻性與穩(wěn)定性好的農(nóng)藥殘留模型樣品對農(nóng)藥殘留檢測具有重要意義[3]，同時樣品中目標(biāo)物的殘留濃度對實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制和研究也有重要影響，目標(biāo)物殘留濃度太高或者太低都達(dá)不到質(zhì)控和研究的目的。有研究表明，采取浸泡方式獲取的農(nóng)藥殘留模型樣品要優(yōu)于噴施方式，可以滿足重復(fù)性、均勻性的需要[4]。但是在浸泡的過程中，最佳浸泡時間為多少，浸泡濃度與目標(biāo)藥物殘留濃度水平的關(guān)系如何，如何實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥殘留模型樣品需要的藥物殘留濃度等卻鮮有報道。本研究分別選擇有機(jī)磷類、有機(jī)氯類、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥中常見的毒死蜱、腐霉利、高效氯氟氰菊酯和克百威作為殘留對象，以櫻桃番茄和菠菜為基質(zhì)，以浸泡方式制取這2種蔬菜中4種農(nóng)藥的蔬菜農(nóng)藥殘留模型樣品，采用氣相色譜法、高效液相色譜法測定蔬菜中農(nóng)藥殘留量[1]，分析比較不同浸泡時間下2種蔬菜中的農(nóng)藥殘留量，研究不同浸泡濃度與目標(biāo)藥物殘留濃度水平之間的關(guān)系，為實(shí)現(xiàn)制備所需目標(biāo)濃度的蔬菜農(nóng)藥殘留模型樣品提供指導(dǎo)依據(jù)。

一、材料與方法

（一）主要儀器與試劑

1.主要儀器。GC－2010 Plus氣相色譜儀（配FPD檢測器，日本島津公司）；Nexis GC－2030氣相色譜儀（配ECD檢測器，日本島津公司）；LC－20AD高效液相色譜儀（配柱后衍生系統(tǒng)和熒光檢測器，日本島津公司）；YP502N電子分析天平（上海菁海儀器有限公司）；EP3010組織搗碎機(jī)（德國博朗公司）；T18高速組織分散器（德國IKA公司）；ASE－24固相萃取裝置（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；MTN－2800W－24氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；Vortex3000渦漩式混合器（德國普邁公司）；RE52－99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

2.主要試劑與耗材。農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品［毒死蜱1 000 μg/mL、腐霉利1 000μg/mL、高效氯氟氰菊酯1 000 μg/mL、克百威1 000μg/mL，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質(zhì)量測試中心（天津）］；乙腈、丙酮、甲醇、正己烷（均為色譜純，美國霍尼韋爾公司）；氯化鈉（分析純，140℃烘烤4 h，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司）；濾膜（0.22μm，有機(jī)溶劑膜，日本島津公司）；固相萃取柱（弗羅里矽柱1 000 mg/6 mL、氨基柱500 mg/6mL，日本島津公司）；0.05 mol/L氫氧化鈉溶液（英國Pickering公司）；OPA稀釋溶液（英國Pickering公司）；鄰苯二甲醛、巰基乙醇（均為色譜純，英國Pickering公司）；腐霉利原藥（純度95.0%）、毒死蜱原藥（純度98.8%）、高效氯氟氰菊酯原藥（純度97.0%）、克百威原藥（純度98.4%），均為東莞市泓信生物科技有限公司生產(chǎn)。

3.樣品采集。櫻桃番茄、菠菜采樣于北京市懷柔區(qū)某蔬菜生產(chǎn)基地，生產(chǎn)過程中未噴施過任何農(nóng)藥。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.浸泡時間對蔬菜農(nóng)藥殘留的影響。將高效氯氟氰菊酯原藥用丙酮溶解后，經(jīng)自來水（16℃）稀釋制成農(nóng)藥浸泡液。將櫻桃番茄和菠菜分別分成6份，去除泥土和腐爛部分，同時完全浸泡至上述農(nóng)藥浸泡液中，浸泡時每5 min取出1份，置于通風(fēng)櫥中瀝干表面水分。每取出1份蔬菜時，將其余浸泡的蔬菜翻動一次，確保蔬菜完全染毒，浸泡過程中室溫保持在20℃左右。全部浸泡結(jié)束后，將染毒后瀝干表面水分的蔬菜分別用保鮮袋包裝密封后放置于4℃冰箱中冷藏24 h，用組織搗碎機(jī)打碎，混勻，待測。

2.蔬菜農(nóng)藥殘留模型樣品制備。將高效氯氟氰菊酯、腐霉利、毒死蜱、克百威原藥用丙酮溶解后，經(jīng)自來水（16℃）稀釋制成不同濃度的混合農(nóng)藥浸泡液。將同樣質(zhì)量（50 g）的菠菜、櫻桃番茄去除泥土和腐爛部分，同時完全浸泡至上述混合農(nóng)藥浸泡液中，浸泡20 min，浸泡過程中每5 min翻動一次蔬菜，確保蔬菜完全染毒，室溫保持在20℃左右。浸泡結(jié)束后，將蔬菜撈出，置于通風(fēng)櫥中瀝干表面水分，用保鮮袋包裝密封后放置于4℃冰箱中冷藏24 h，用組織搗碎機(jī)打碎，混勻，待測。

3.蔬菜農(nóng)藥殘留含量與浸泡濃度線性關(guān)系的建立。根據(jù)測得的櫻桃番茄和菠菜中各農(nóng)藥殘留含量（y）和已知初始農(nóng)藥浸泡濃度（x），分別建立2種蔬菜中農(nóng)藥殘留含量與浸泡濃度的線性關(guān)系（y＝kx）。

4.樣品前處理。分別準(zhǔn)確稱取對照組（空白）樣品和待測樣品（浸泡后樣品）25.0 g放入勻漿機(jī)中，加入50 mL乙腈，高速勻漿2 min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有5～7 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中，收集濾液40～50 mL，蓋上蓋子，劇烈振蕩1 min，在室溫下靜置30 min。

從具塞量筒中分別吸取3份10 mL上層處理液，分別放入150 mL茄形瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃水浴加熱，蒸發(fā)至近干，1份加入2mL丙酮，備用；1份加入2 mL正己烷，待凈化；1份加入2 mL甲醇－二氯甲烷（1∶99，V∶V）溶解殘渣，待凈化。

將上述加入丙酮的備用液用約3 mL丙酮分3次沖洗，每次丙酮用量約1 mL，完全轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶內(nèi)定容，在渦旋混合器上混勻后過0.22μm濾膜，濾液供氣相色譜儀（FPD檢測器）測定。將上述加入正己烷的備用液過活化后的弗羅里矽柱，用5 mL丙酮－正己烷（10∶90，V∶V）沖洗后過柱2次，收集洗脫液在水浴溫度50℃條件下氮吹蒸發(fā)至＜5 mL，用正己烷定容至5.0 mL，在渦旋混合器上混勻，濾液供氣相色譜儀（ECD檢測器）測定。將上述加入甲醇－二氯甲烷的備用液過活化后的氨基柱，用2 mL甲醇－二氯甲烷（1∶99，V∶V）沖洗后過柱2次，收集洗脫液在水浴50℃條件下氮吹蒸發(fā)至近干，用甲醇定容至2.5 mL，在渦旋混合器上混勻后過0.22μm濾膜，濾液供高效液相色譜儀測定。

5.儀器檢測條件。 （1）氣相色譜（配FPD檢測器）檢測條件。柱升溫程序：150℃保持2 min，以30℃/min升至200℃保持5 min，以5℃/min升至240℃（不保持，達(dá)到溫度后立即執(zhí)行新的升溫程序繼續(xù)升溫），以50℃/min升至280℃保持3.53 min。進(jìn)樣口溫度為280℃；檢測器溫度為300℃；色譜柱流量為10 mL/min；色譜柱為Intertcap 17（1.0μm×0.53 mm×30 m）。（2）氣相色譜（配ECD檢測器）檢測條件。柱升溫程序：150℃保持2 min，以6℃/min升至270℃保持18 min。進(jìn)樣口溫度為250℃；檢測器溫度為300℃；色譜柱流量為1.40 mL/min；色譜柱為Intertcap 1（0.25μm×0.25 mm×30 m）。（3）高效液相色譜檢測條件。流動相：A相為甲醇；B相為純水；C相為OPA稀釋溶液（含0.1 g鄰苯二甲醛、2 g巰基乙醇）；D相為0.05 mol/L氫氧化鈉溶液。柱溫箱溫度為50℃；水解溫度為100℃；激發(fā)波長為330 nm；發(fā)射波長為465 nm。

6.數(shù)據(jù)處理。實(shí)驗(yàn)采用外標(biāo)法定量，用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。參照NY/T 761－2008《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》標(biāo)準(zhǔn)方法[1]，將上述處理過的樣品經(jīng)過測定，得到峰面積，計算樣品中被測農(nóng)藥殘留量（w，單位以mg/kg表示），計算方法見公式（1）。

公式（1）中，ρ為標(biāo)準(zhǔn)溶液中農(nóng)藥的質(zhì)量濃度（mg/L）；A為樣品溶液中被測農(nóng)藥的峰面積；As為農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測農(nóng)藥的峰面積；V1為提取溶劑總體積（mL）；V2為吸取出用于檢測的提取溶液的體積（mL）；V3為樣品溶液定容體積（mL）；m為試樣的質(zhì)量（g）。

7.質(zhì)量控制。質(zhì)量控制采取計算加標(biāo)回收率的方法得出。稱取25.0 g櫻桃番茄和菠菜的勻質(zhì)空白樣品（精確至0.1 g）于200 mL燒杯中，分別添加3個濃度梯度的4種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)工作液250μL，工作液濃度分別為10.0、50.0、100.0 mg/L，對應(yīng)添加濃度分別為0.1、0.5、1.0 mg/kg。在重復(fù)性條件下，對低中高水平加標(biāo)的櫻桃番茄和菠菜樣品進(jìn)行測定，按照上文“4.樣品前處理”的方法對樣品進(jìn)行前處理。加標(biāo)回收率計算方法見公式（2）。

公式（2）中，B為加標(biāo)回收率（%）；Y為空白試樣中被測組分的含量（mg/kg）；Y1為加標(biāo)試樣中被測組分的含量（mg/kg）。

二、結(jié)果與分析

（一）方法檢出限按照上述儀器條件建立的氣相色譜和液相色譜方法，以3倍信噪比所對應(yīng)的濃度值確定4種農(nóng)藥的檢出限，結(jié)果顯示，高效氯氟氰菊酯的檢出限為0.000 26 mg/kg，腐霉利的檢出限為0.000 30 mg/kg，毒死蜱的檢出限為0.004 70 mg/kg，克百威的檢出限為0.000 94 mg/kg。

（二）質(zhì)量控制結(jié)果通過3次平行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，4種農(nóng)藥在櫻桃番茄中的平均回收率為86.46%～104.47%，RSD均≤5%（見表1）；4種農(nóng)藥在菠菜中的平均回收率為83.82%～109.11%，RSD均≤5%（見表2）。該分析方法的準(zhǔn)確性符合GB/T 27404－2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[5]的要求，實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果可信。

表1 櫻桃番茄中4種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率 （n＝3）

表2 菠菜中4種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率 （n＝3）

（三）不同浸泡時間對蔬菜農(nóng)藥殘留含量的影響將上文“一、材料與方法”中“1.浸泡時間對蔬菜農(nóng)藥殘留的影響”的待測樣品按照上述前處理方法及儀器條件進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可以看出，隨著農(nóng)藥浸泡時間的增大，櫻桃番茄和菠菜中農(nóng)藥殘留含量的變化趨勢基本一致，前15 min內(nèi)，農(nóng)藥殘留含量不穩(wěn)定，20 min后農(nóng)藥殘留含量變化相對平緩，考慮到盡量減少浸泡時間和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，選擇20 min為最佳浸泡時間。

表3 浸泡時間對蔬菜農(nóng)藥殘留含量的影響

（四）蔬菜農(nóng)藥殘留含量與浸泡濃度之間的線性關(guān)系將上文“一、材料與方法”中“2.蔬菜農(nóng)藥殘留模型樣品制備”的待測樣品按照上述前處理方法及儀器條件進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 兩種蔬菜在不同濃度農(nóng)藥浸泡處理后的農(nóng)藥殘留含量

分別根據(jù)不同農(nóng)藥浸泡濃度對應(yīng)的櫻桃番茄和菠菜中農(nóng)藥殘留含量，以浸泡濃度為橫坐標(biāo)，農(nóng)藥殘留含量為縱坐標(biāo)，繪制農(nóng)藥殘留含量與浸泡濃度之間的趨勢圖（見圖1）。如圖1所示，隨著農(nóng)藥浸泡濃度的增大，櫻桃番茄和菠菜中農(nóng)藥殘留含量均增大，且與農(nóng)藥種類無關(guān)，增大趨勢呈線性關(guān)系，其中菠菜基質(zhì)對應(yīng)的線性方程為y＝1.375x；櫻桃番茄基質(zhì)對應(yīng)的線性方程為y＝0.035x；相關(guān)系數(shù)R2均＞0.99，線性關(guān)系良好。

圖1 在不同浸泡濃度下菠菜和櫻桃番茄中農(nóng)藥殘留量的變化趨勢

三、結(jié)論

本研究分別選擇有機(jī)磷類、有機(jī)氯類、擬除蟲菊酯類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥中常見的毒死蜱、腐霉利、高效氯氟氰菊酯和克百威作為農(nóng)藥殘留對象，以櫻桃番茄和菠菜為基質(zhì)，以浸泡方式制取以上2種蔬菜中4種農(nóng)藥的蔬菜農(nóng)藥殘留模型樣品，采用氣相色譜法、高效液相色譜法測定蔬菜中農(nóng)藥殘留量，得出最佳農(nóng)藥浸泡時間為20 min；在浸泡時間為20 min的條件下，目標(biāo)農(nóng)藥殘留含量與浸泡濃度之間呈線性關(guān)系，線性方程分別為y＝1.375x（菠菜）、y＝0.035x（櫻桃番茄）。以浸泡方式制取農(nóng)藥殘留模型樣品，在浸泡、翻動、晾干表面水分等環(huán)節(jié)有很大的主觀性，該方法適合大批量制取大致濃度的農(nóng)藥殘留樣品，以用于快速檢測技能競賽、農(nóng)藥殘留研究實(shí)驗(yàn)等，若將其應(yīng)用于能力驗(yàn)證、質(zhì)量控制等，還需要對樣品進(jìn)行定值，并進(jìn)行均一性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。