王會(huì)鋒 馮書(shū)惠 周其芳 李圓圓 李淑芳 郝學(xué)飛
(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450002)
脂肪酸(Fatty acids,F(xiàn)A)是一類羧酸化合物,由碳?xì)浣M成的烴類基團(tuán)連接羧基構(gòu)成。脂肪酸作為中性脂、磷脂和糖脂等脂質(zhì)的組分,又被稱為脂肪酸酯或總脂肪酸,通常以酯化形式存在。酯化脂肪酸在磷脂酶作用下水解得到游離脂肪酸,游離脂肪酸為非酯化的脂肪酸,是類脂代謝物的重要組成部分。
目前,有關(guān)脂肪酸的研究日益增多。脂肪酸關(guān)乎人體健康,其會(huì)影響機(jī)體的生理功能及健康狀態(tài),與炎癥、肥胖、糖尿病、癌癥、心血管硬化等疾病存在一定的關(guān)系[1]。脂肪酸組成關(guān)乎農(nóng)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì),農(nóng)業(yè)科學(xué)家試圖選育出高油酸的花生品種,以期提升植物油品質(zhì)和貨架壽命[2]。根據(jù)油脂脂肪酸組成,可以鑒定食用油摻偽[3~4],打擊食用油非法添加,保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益。對(duì)反式脂肪酸檢測(cè),可以打擊不法商販添加氫化植物油[5]和濫用地溝油[6],保護(hù)人體健康。隨著脂肪酸檢測(cè)技術(shù)的提高,檢測(cè)更為精準(zhǔn),應(yīng)用更為廣泛。
脂肪酸檢測(cè)技術(shù)主要有近紅外光譜(NIRS)法[7]、氣相色譜(GC-FID)法[8~9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法[10]、高效液相色譜(HPLC)法[11]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)法[12]、核磁共振波譜(NMR)法[13]。其中,氣相色譜法是應(yīng)用最為廣泛的脂肪酸檢測(cè)方法,由于其檢測(cè)方便、分離效果好、靈敏度高、檢出限低,因此現(xiàn)行有效的方法標(biāo)準(zhǔn)[14~18]多是氣相色譜法。隨著氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)推廣普及,GC-MS測(cè)定脂肪酸的研究也越來(lái)越多,已形成了方法標(biāo)準(zhǔn)[19]。GC-MS有較好的定性定量能力,研究人員從質(zhì)譜得到大量碎片信息后,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定;同時(shí),選擇離子掃描(SIM)模式定量能有效去除干擾,提高靈敏度。本文綜述了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定脂肪酸的方法研究進(jìn)展,比較了前處理技術(shù)的特點(diǎn),對(duì)樣品水解、脂肪提取、脂肪皂化、脂肪酸甲酯化等步驟進(jìn)行分析;重點(diǎn)介紹了色譜優(yōu)化和質(zhì)譜條件設(shè)置、數(shù)據(jù)處理等策略;最后介紹了GC-MS測(cè)定脂肪酸的代表性應(yīng)用,為高通量、高靈敏度的脂肪酸分析方法的發(fā)展提供參考。
紅外光譜法檢測(cè)脂肪酸簡(jiǎn)便快速,對(duì)樣品無(wú)損傷,但只能獲得脂肪酸總量。HPLC法利用熒光或紫外檢測(cè)器檢測(cè),方法響應(yīng)靈敏度低,存在應(yīng)用局限。HPLC-MS法和NMR法檢測(cè)成本昂貴。目前脂肪酸檢測(cè)最可行的方法是GC-FID法和GC-MS法。
GC-FID法基于待測(cè)組分沸點(diǎn)、極性差異進(jìn)行氣相色譜柱分離,組分依次流出,F(xiàn)ID檢測(cè)器檢測(cè)。該方法依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性,一般出峰時(shí)間相同即為同一化合物,但保留時(shí)間吻合也可能是干擾物質(zhì),遇到無(wú)標(biāo)樣確認(rèn)的未知峰,定量結(jié)果有偏差。
GC-MS法是基于氣相色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的準(zhǔn)確鑒定能力而開(kāi)發(fā)的分析技術(shù),其應(yīng)用于脂肪酸檢測(cè)有一定優(yōu)勢(shì)。GC-MS法可借用GCFID法成熟的前處理技術(shù),二者僅檢測(cè)器不同,同一前處理獲得的待測(cè)液可分別供GC-FID和GCMS分析。GC-MS法除了可利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間定性,也可以依據(jù)質(zhì)譜圖碎片信息進(jìn)行定性,其能夠?qū)Τ龢?biāo)準(zhǔn)品之外的組分,通過(guò)提取不同特征離子進(jìn)行鑒定和定量[20~22]。GC-MS法比GC-FID法獲得的檢出限(定量限)更低,結(jié)果更加準(zhǔn)確,兩種方法的比較見(jiàn)表1。
表1 GC-FID與GC-MS測(cè)定脂肪酸的方法比較
GC-MS法測(cè)定脂肪酸,一般需要經(jīng)過(guò)樣品水解→脂肪提取→脂肪皂化→脂肪酸甲酯化→儀器分析→數(shù)據(jù)處理等步驟。
(一)樣品前處理樣品前處理通常包括水解、提取和酯化,要求水解徹底、提取充分、酯化完全,減少干擾基質(zhì),保證后續(xù)檢測(cè)結(jié)果的靈敏性和準(zhǔn)確性。
1.脂肪提取。脂肪的存在形式有游離態(tài)(如動(dòng)植物油脂)和結(jié)合態(tài)(乳粉及液態(tài)乳),其中游離態(tài)脂肪可通過(guò)有機(jī)溶劑直接提取[8]或者索氏提取[23];結(jié)合態(tài)脂肪提取則需要先破壞脂肪與非脂成分的結(jié)合力(壁),即采取水解方法。水解方法分為酸水解法、堿水解法、酸堿水解法3種[14],根據(jù)基質(zhì)不同選擇不同方法。林麟等[24]分別用酸水解法和堿水解法對(duì)奶粉標(biāo)準(zhǔn)參考物進(jìn)行脂肪測(cè)定比較,堿水解法的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值最接近,酸水解法的結(jié)果偏低。田春霞等[25]考察了采用酸水解法、堿水解法、酸堿水解法對(duì)嬰幼兒奶粉脂肪提取率的影響,結(jié)果顯示,提取率分別為16.89%、19.14%和15.21%,堿水解法的提取率較高。
鑒于環(huán)保節(jié)能以及前處理技術(shù)和儀器的發(fā)展,環(huán)保高效的脂肪提取技術(shù)被應(yīng)用于不同基質(zhì)脂肪酸的提取、凈化。有關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道的以不同的脂肪提取技術(shù)提取不同基質(zhì)中脂肪的應(yīng)用情況見(jiàn)表2,相比而言,SPE、ASE、MAE、UAE、DLLME均能夠比LLE縮短萃取時(shí)間、減少溶劑用量,但ASE設(shè)備的維護(hù)費(fèi)用較高,MAE可能會(huì)導(dǎo)致不飽和脂肪酸發(fā)生氧化,限制了其在脂肪酸分析中的應(yīng)用。UAE、DLLME不改變萃取體系溫度,有利于萃取脂肪酸等熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。
表2 不同脂肪提取技術(shù)應(yīng)用情況
2.脂肪酸甲酯化。脂肪提取物主要是甘油三酯,需進(jìn)一步皂化成脂肪酸。脂肪酸因含羧基等極性基團(tuán),極性大,沸點(diǎn)高,不能直接用GC-MS進(jìn)行分析,需要將其衍生化為低極性、易揮發(fā)的脂肪酸衍生物,以提高檢測(cè)靈敏度、改善色譜分辨率和減少長(zhǎng)鏈脂肪酸色譜峰拖尾等。衍生方式有甲酯化、異丙酯化、丁酯化、硅烷化、胺化和?;?。甲酯化即脂肪酸生成脂肪酸甲酯(FAMEs),其反應(yīng)簡(jiǎn)單,揮發(fā)性好,是目前最常用的脂肪酸衍生化方式[33]。脂肪酸甲酯化主要有5種方法,目前文獻(xiàn)中報(bào)道的脂肪酸甲酯化的應(yīng)用情況見(jiàn)表3。對(duì)比國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[14]中奶粉脂肪酸甲酯化的3種方法,乙酰氯-甲醇法優(yōu)于堿酯化法和酸酯化法[39]。劉文媛等[40]比較了6種牦牛骨脂質(zhì)甲酯化方法,結(jié)果顯示,應(yīng)用堿酯化法衍生后脂肪酸幾乎無(wú)檢出,應(yīng)用乙酰氯-甲醇法衍生后測(cè)得的脂肪酸總含量顯著高于硫酸-甲醇法和鹽酸-甲醇法。
表3 不同脂肪酸甲酯化方法應(yīng)用
(二)色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化
1.色譜條件優(yōu)化。色譜分離受色譜柱型號(hào)、色譜柱溫度、色譜柱流量(進(jìn)樣口壓力)、載氣類型、進(jìn)樣量、分流比和進(jìn)樣濃度等影響[41]。色譜柱是決定分離效果的最核心部件,合適的色譜柱可顯著改善分離度和分離效率,強(qiáng)極性的色譜柱對(duì)FAMEs的分離能力優(yōu)于中等極性、弱極性色譜柱。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[14~15]推薦的脂肪酸分析使用的色譜柱是HP-88和SP-2560,規(guī)格是100 m×0.25 mm×0.20 μm,若柱長(zhǎng)度再增加,其分離能力愈增強(qiáng),但分析時(shí)間則會(huì)增長(zhǎng)。
FAMEs出峰順序有一定規(guī)律性[20,24]:飽和類脂肪酸甲酯,碳原子數(shù)小的先于碳原子數(shù)大的出峰;碳原子數(shù)相同的脂肪酸甲酯,飽和類先于不飽和類出峰;不飽和類脂肪酸甲酯,不飽和度越大,出峰越晚;順?lè)串悩?gòu)體的脂肪酸,反式脂肪酸先出峰。相同類型的色譜柱,F(xiàn)AMEs出峰順序基本一致,但有個(gè)別組分的保留時(shí)間存在差異,CP-Sil 88和BPX-70相比,C20∶1與C18∶3的流出順序正好相反[42]。同樣,相同型號(hào)的HP-88色譜柱也存在這個(gè)情況,國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)[14]中 所 列 的 出 峰 順 序 為C20∶3n3>C22∶1n9、C20∶5>C24∶0,不同于楊明等[20]實(shí)驗(yàn)得到的出峰順序(C22∶1n9>C20∶3n3、C24∶0>C20∶5)。 推測(cè)原因有兩方面:一是不同批號(hào)色譜柱分離效果具有不一致性[41],對(duì)于保留時(shí)間接近的組分影響較大;二是載氣類型對(duì)分離順序的影響,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[14]選用氮?dú)鉃檩d氣,GC-MS[20]使用氦氣作為載氣??紤]到柱子間和色譜條件差異,須使用單標(biāo)準(zhǔn)品監(jiān)測(cè)混合標(biāo)準(zhǔn)樣的出峰順序,來(lái)確定混合標(biāo)準(zhǔn)品中各組分的保留時(shí)間。
脂肪酸甲酯分析可以在恒溫條件下完成[43],但程序升溫分離更佳,初始溫度設(shè)定為60~120℃,以3~20℃/min升溫速率升至最高溫度。當(dāng)進(jìn)樣量太大時(shí),比起樣品稀釋,調(diào)整進(jìn)樣體積和分流比是更為快捷的手段[44]。
2.質(zhì)譜條件優(yōu)化。質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)主要有離子源溫度、四極桿溫度、傳輸線溫度、溶劑延遲時(shí)間、SIM特征離子等。掃描模式有全掃描(SCAN)、選擇離子掃描和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描(MRM)。GC-MS測(cè)定脂肪酸多是SCAN模式,采用保留時(shí)間和全掃描的質(zhì)譜離子信息定性,面積歸一化法[19]或者外標(biāo)法[45]定量。全掃描模式對(duì)測(cè)定有較大的背景干擾時(shí),選擇GC-MS-SIM測(cè)定脂肪酸[20~22],SIM模式有一定抗干擾能力,背景干凈,靈敏度高,有利于低含量的脂肪酸檢測(cè)。目前,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式檢測(cè)脂肪酸還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
FAMEs質(zhì)譜裂解規(guī)律[20,24]:根據(jù)基峰荷質(zhì)比判定不飽和度,飽和脂肪酸甲酯、單不飽和脂肪酸甲酯、雙不飽和脂肪酸甲酯、3個(gè)以上雙鍵不飽和脂肪酸甲酯的基峰荷質(zhì)比依次是74、55、67、79;隨著碳鏈及不飽和度增加,其分子離子峰的豐度逐漸減弱;分子峰(M)斷裂產(chǎn)生M-43、M-32、M-31、M-29的碎片離子依次為飽和脂肪酸甲酯、單不飽和脂肪酸甲酯、雙不飽和脂肪酸甲酯、4個(gè)以上雙鍵不飽和脂肪酸甲酯的特征離子。根據(jù)脂肪酸甲酯全掃描得到總離子流圖(TIC)和質(zhì)譜裂解規(guī)律,選擇基峰離子、分子峰離子及其他特征離子為定性離子和定量離子。
楊明等[20]建立的GC-MS-SIM方法雙內(nèi)標(biāo)定量檢測(cè)脂肪酸的時(shí)間為GB 5009.168標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)時(shí)間的1/2。孫翠霞等[21]用于食品中脂肪酸含量準(zhǔn)確測(cè)定的方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[14]的測(cè)定結(jié)果無(wú)差異。參考楊明等[20]和林麒等[24]的研究成果,本文推薦各脂肪酸甲酯的特征離子信息見(jiàn)表4。
表4 各脂肪酸甲酯的特征離子信息
(三)定量方法前處理是實(shí)現(xiàn)脂肪酸準(zhǔn)確分析的基礎(chǔ),而儀器分析是定性定量分析的關(guān)鍵。常用的脂肪酸定量方法有3種,即歸一化法[19]、外標(biāo)法[25]和內(nèi)標(biāo)法[20],結(jié)果以相對(duì)含量或者絕對(duì)含量表示?!吨袊?guó)食物成分表》(第6版)[47]記錄的脂肪酸含量是絕對(duì)含量(單位為g/100 g),歸一化法測(cè)定的脂肪酸結(jié)果是相對(duì)含量(%),二者除單位不同外,數(shù)值差異也較大。
歸一化法是對(duì)所有組分進(jìn)行歸一化,求得相對(duì)含量。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可以不需要標(biāo)準(zhǔn)品,不要求精確進(jìn)樣,一次進(jìn)樣就可以完成分析;缺點(diǎn)是必須保證樣品中所有組分都出峰。FAMEs在儀器上的響應(yīng)因子接近時(shí),直接對(duì)色譜圖中峰面積歸一化;當(dāng)響應(yīng)因子差別較大時(shí),采用校正因子計(jì)算結(jié)果更準(zhǔn)確。GB 5009.257-2016[15]附錄C中列出了各脂肪酸甲酯GC-FID響應(yīng)因子及相對(duì)于C16∶0的校準(zhǔn)因子(均是理論計(jì)算值),其中C14∶0~C22∶6響應(yīng)因子為1.30~1.44,與十四碳以下脂肪酸甲酯響應(yīng)因子差別較大。研究人員所在實(shí)驗(yàn)室根據(jù)不同濃度的脂肪酸甲酯的儀器響應(yīng)面積計(jì)算出GC-FID校準(zhǔn)因子(實(shí)測(cè)值),該實(shí)測(cè)值和標(biāo)準(zhǔn)[15]中理論值誤差在5%以內(nèi)。關(guān)于GC-MS的校正因子,實(shí)測(cè)值和理論值的比較還未有研究報(bào)道。
GC-MS測(cè)定脂肪酸絕對(duì)含量有外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法兩種定量方法。采用內(nèi)標(biāo)法時(shí)可選1種脂肪酸作為內(nèi)標(biāo), 如C11∶0、 C19∶0、 C21∶0、 C23∶0[47]等; 也可以選2種脂肪酸共同作為內(nèi)標(biāo),如C13∶0和C21∶0,C13∶0作為碳原子數(shù)<18的FAMEs的內(nèi)標(biāo),而C21∶0則作為碳原子數(shù)>18的FAMEs的內(nèi)標(biāo)[20]。關(guān)于內(nèi)標(biāo)的加入時(shí)間,一種是在脂肪酸甲酯化衍生時(shí)添加脂肪酸內(nèi)標(biāo)物,校正不同脂肪酸在儀器上濃度和響應(yīng)值關(guān)聯(lián)的誤差[20];另一種是添加脂肪酸甘油三酯于樣品中作為內(nèi)標(biāo),和試樣一起前處理,校正前處理帶來(lái)的損失,有回收率校正作用[14]。內(nèi)標(biāo)法計(jì)算,需要FAMEs響應(yīng)因子和FAMEs轉(zhuǎn)換成FA的系數(shù),F(xiàn)AMEs峰面積與FAMEs濃度、種類和色譜條件密切相關(guān)。楊明等[20]對(duì)混標(biāo)中FAMEs的濃度與內(nèi)標(biāo)濃度比乘以內(nèi)標(biāo)峰面積與FAMEs峰面積比計(jì)算出FAMEs響應(yīng)因子。
(四)數(shù)據(jù)處理GC-MS獲得的數(shù)據(jù),利用Excel、SPSS軟件進(jìn)行分析,P<0.05表示具有顯著性差異,所用描述性統(tǒng)計(jì)值均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(x±s)表示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后,結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué),運(yùn)用代謝組學(xué)、數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)等方法分析和處理軟件繪圖,得到主成分得分圖、脂肪酸熱圖、區(qū)域分布三維圖等直觀圖,用于品質(zhì)分析、產(chǎn)地溯源和鑒別摻假等研究[48~51]。
郭敏等[48]為研究國(guó)內(nèi)外不同產(chǎn)地藜麥的成分差異,采用GC-MS技術(shù)對(duì)藜麥中脂肪酸及非極性小分子物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定,并結(jié)合無(wú)監(jiān)督模式的主成分分析(PCA)和有監(jiān)督模式的正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)對(duì)產(chǎn)地與成分之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。通過(guò)PCA得分散圖上散點(diǎn)位置的分布可以比較直觀地展現(xiàn)樣品或組別之間的差異。采用有監(jiān)督模式的OPLS-DA,對(duì)不同產(chǎn)地的藜麥樣品按照產(chǎn)地進(jìn)行分組,可對(duì)藜麥中小分子物質(zhì)與產(chǎn)地之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。
張勇等[51]測(cè)定進(jìn)口大豆、國(guó)產(chǎn)大豆和摻假大豆的脂肪酸組成,利用主成分分析、系統(tǒng)聚類分析對(duì)進(jìn)口大豆和國(guó)產(chǎn)大豆樣品進(jìn)行聚類分析,結(jié)果顯示進(jìn)口大豆與國(guó)產(chǎn)大豆油酸、亞麻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸等脂肪酸相對(duì)含量存在極顯著差異;利用脂肪酸組成可實(shí)現(xiàn)進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)大豆正確聚類。他們還利用隨機(jī)森林方法建立了進(jìn)口大豆與國(guó)產(chǎn)大豆、摻假大豆與國(guó)產(chǎn)大豆間的判別模型,該模型可有效區(qū)分進(jìn)口大豆與國(guó)產(chǎn)大豆、摻假大豆與國(guó)產(chǎn)大豆,采用隨機(jī)森林交互檢驗(yàn)預(yù)測(cè)正確率均為100%。
縱觀脂肪酸檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用,主要用于醫(yī)學(xué)健康、油脂資源、安全監(jiān)管、產(chǎn)地溯源、生物生理等方面。在醫(yī)學(xué)健康方面,因?yàn)樯飿颖局兄舅岷颗c疾病有一定相關(guān)性,脂肪酸檢測(cè)可應(yīng)用于脂肪酸代謝相關(guān)疾病的診斷,以便人們及時(shí)調(diào)整膳食營(yíng)養(yǎng)[52]。在油脂資源方面,脂肪酸的種類、含量、比例決定了油脂的品質(zhì)和利用,脂肪酸檢測(cè)可用于新油脂資源的發(fā)現(xiàn)、替代,使其變廢為寶。在安全監(jiān)管方面,產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了脂肪酸的含量及相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),可以嚴(yán)控產(chǎn)品質(zhì)量。在產(chǎn)地溯源方面,不同來(lái)源的樣品中脂肪酸組成具有明顯區(qū)別特征,基于脂肪酸深挖營(yíng)養(yǎng)差異,可凸顯地理標(biāo)志產(chǎn)品、名特優(yōu)新農(nóng)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)特色[48~51]。在生物生理方面,脂肪酸檢測(cè)技術(shù)可為動(dòng)植物脂質(zhì)的代謝研究、脂質(zhì)生物學(xué)功能研究提供分析技術(shù)平臺(tái)[53~54]。
對(duì)于更復(fù)雜組分,GC-MS的MRM模式相比SCAN和SIM模式,有更強(qiáng)抗干擾能力,結(jié)果更加準(zhǔn)確。但SCAN質(zhì)譜圖中豐度較高的離子荷質(zhì)比較小(如m/z55、69、74),不適合作為MRM母離子,選擇MRM離子對(duì),還需要進(jìn)一步研究。對(duì)于反式脂肪酸檢測(cè),全二維氣相色譜-質(zhì)譜具備較強(qiáng)的分離能力,提供了新的技術(shù)手段[55]。此外,也有采用液質(zhì)聯(lián)用[56]、液相色譜-飛行時(shí)間-串聯(lián)質(zhì)譜[54]檢測(cè)脂肪酸的研究報(bào)道。獲得的數(shù)據(jù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)、代謝組學(xué)等分析方法,將會(huì)給脂肪酸檢測(cè)帶來(lái)新發(fā)現(xiàn)和新應(yīng)用。
農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全2022年3期