自動QuEChERs樣品制備系統(tǒng)在中藥禁用農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用

武曉麗 易 鵬 戚 倉 丁自勉

（1.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193；2.北京芥微科技有限公司，北京 102209；3.北京本立科技有限公司，北京 100098）

中藥中禁用農(nóng)藥殘留不僅會影響中藥的質(zhì)量安全，也是阻礙中藥走向國際化的壁壘[1]。為了控制高毒、高風險農(nóng)藥在中藥種植過程中的違規(guī)使用，達到從源頭控制中藥質(zhì)量的目的，在《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版四部《0212藥材和飲片檢定通則》中，首次規(guī)定藥材及飲片（植物類）中33種禁用農(nóng)藥不得檢出（不得過定量限）[2]，并在《2341農(nóng)藥殘留量測定法》中新增了第五法。第五法中采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測的農(nóng)藥30種，供試品溶液制備方法3種，包括直接提取法、快速樣品處理法（Quick，easy，cheap，effective，rugged，and safe，QuEChERs）和固相萃取法[3]，其中QuEChERs方法是農(nóng)藥殘留檢測常用的方法之一。

QuEChERs方法由美國科學家ANASTASSIADES等開發(fā)[4]，最初用于蔬菜、水果等食品中農(nóng)藥多殘留的樣品前處理，后經(jīng)過完善后逐漸成為很多國家和地區(qū)的官方分析方法，例如美國AOAC 2007.01[5]、歐盟EN 15662[6]和我國的一些食品安全國家標準[7～9]。近年來，QuEChERs方法在中藥材農(nóng)藥殘留檢測分析中的應(yīng)用也逐年增多。例如，耿昭等[10]建立了貝母類藥材中53種農(nóng)藥殘留檢測的QuEChERS法結(jié)合氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法；賓婕等[11]建立QuEChERS－UPLC－MS/MS法快速測定香茅草中33種農(nóng)藥殘留量；熊穎等[12]建立QuEChERSGC－MS/MS法測定化橘紅中65種農(nóng)藥殘留。QuEChERs方法主要包括兩個步驟，第1步，樣品經(jīng)過乙腈振蕩提取、鹽析后離心分離；第2步，上一步提取液經(jīng)過分散固相萃取凈化后，離心分離。QuEChERs方法重復(fù)性好，適用于多種化合物的分析，但是傳統(tǒng)的QuEChERs方法是以手動離心分離，這增加了溶劑收集、轉(zhuǎn)移的時間和過程中的污染風險[13]。因此，QuEChERs的自動化是值得科學家們研究改進的方向。

本研究使用了一種新型QuEChERs樣品制備系統(tǒng)，其能夠自動實現(xiàn)振蕩、離心、提取液轉(zhuǎn)移和凈化等。該系統(tǒng)對植物源食品如芹菜、番茄、葡萄、玉米、綠茶等基質(zhì)中大多數(shù)農(nóng)藥都有較好的提取效果[14]，但尚未應(yīng)用于復(fù)雜的中藥基質(zhì)。本研究以半夏、金銀花、紫蘇葉為代表，將該系統(tǒng)用于30種禁用農(nóng)藥殘留分析的樣品前處理，用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS/MS）進行檢測，并與手動QuEChERs方法進行對比，對回收率、精密度等方法學指標進行考察，以期為中藥農(nóng)藥殘留檢測提供一種簡單、快捷的自動QuEChERs方法。

一、材料與儀器

（一）材料與試劑乙腈（色譜純，美國Fisher公司），甲酸（質(zhì)譜級，美國Fisher公司），氯化鈉、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。石墨化碳黑（GCB）、N－丙基乙二胺（PSA）、硅膠、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、禁用農(nóng)藥混合標準品（2～20 mg/L），均購于上海安譜實驗科技股份有限公司。中草藥樣品制備管、QuEChERs萃取鹽包、氧化鋯振子購于北京芥微科技有限公司，其中樣品制備管內(nèi)管中含無水硫酸鎂900 mg、N－丙基乙二胺300 mg、十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg、硅膠300 mg、石墨化碳黑90 mg。

半夏、金銀花、紫蘇葉購于藥材市場，粉碎后過3號篩，過篩后樣品置于－20℃冰箱備用。

（二）儀器LC－20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；5500 QTRAP質(zhì)譜儀配有電噴霧離子源ESI（美國AB SCIEX公司）；SiO－7512自動QuEChERs樣品制備系統(tǒng)（北京本立科技有限公司）。

二、方法與結(jié)果

（一）UPLC-MS/MS條件

1.液相色譜條件。色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（Thermo Scientific Hypersil GOLD，100 mm×2.1mm，1.9μm）。流動相：以乙腈為流動相A，以0.1%甲酸水溶液為流動相B，梯度洗脫（0～0.5 min，70%B；0.5～9 min，70%B～10%B；9～13 min，10%B；13～14 min，10%B～70%B；14～18 min，70%B）。流速為0.20 mL/min；柱溫為30℃；進樣量為2μL。

2.質(zhì)譜條件。以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測；電噴霧（ESI）離子源，監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），正離子掃描。各化合物按照保留時間先后編號，監(jiān)測離子對、去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）見表1。

表1 30種禁用農(nóng)藥的保留時間和多反應(yīng)監(jiān)測條件

續(xù)表1

（二）混合標準品儲備液的配制精密量取禁用農(nóng)藥混合對照品溶液0.5 mL，置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻備用。

（三）樣品前處理方法

1.手動QuEChERs法。參照《中國藥典》四部《2341農(nóng)藥殘留量測定法》中第五法，取供試品粉末3 g，精密稱定，置于50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30 min，加入乙腈15 mL，渦旋混勻，置振蕩器上劇烈振蕩5 min（500次/min），加入無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末（比例為4∶1）7.5 g，立即搖散，再置振蕩器上劇烈振蕩3 min（500次/min），于冰浴中冷卻10 min，離心5 min（4 000 r/min）。取上清液9 mL，置分散固相萃取凈化管（含無水硫酸鎂900 mg、N－丙基乙二胺300 mg、十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg、硅膠300 mg、石墨化碳黑90 mg）中，渦旋使充分混勻，置振蕩器上劇烈振蕩5 min（500次/min），離心5 min（4 000 r/min）。精密吸取上清液5 mL，置氮吹儀上于40℃水浴濃縮至約0.4 mL，加乙腈稀釋至1.0 mL，精密加入0.3 mL水，渦旋混勻，過0.22μm濾膜，待測。

2.自動QuEChERs法。取供試品粉末3 g，精密稱定，置于70 mL樣品制備管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30 min，加入乙腈15 mL、氧化鋯振子和QuEChERs萃取鹽包（含無水硫酸鎂6 g、無水乙酸鈉1.5 g），立即搖散。將樣品制備管放入自動QuEChERs樣品制備系統(tǒng)，參照《中國藥典》中的振蕩和離心條件，設(shè)置振蕩轉(zhuǎn)速為500 r/min，處理時間300 s，離心轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，處理時間300 s。點擊運行，系統(tǒng)按照以下程序自動處理：第1步，振蕩，轉(zhuǎn)速為500 r/min；第2步，離心，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min；第3步，振蕩，轉(zhuǎn)速為500 r/min；第4步，離心，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min。各步處理時間均為300 s。運行結(jié)束后，精密吸取制備管內(nèi)管中的上清液5 mL，置氮吹儀上于40℃水浴濃縮至約0.4 mL，加乙腈稀釋至1.0 mL，精密加入0.3 mL水，渦旋混勻，過0.22μm濾膜，待測。

（四）加樣回收試驗本研究以半夏、紫蘇葉、金銀花為代表性藥材，驗證自動QuEChERs方法用于中藥禁用農(nóng)藥殘留分析的方法準確度和重復(fù)性，并與手動的QuEChERs法進行對比。根據(jù)2020年版《中國藥典》，禁用農(nóng)藥的限量值在0.02～0.2 mg/kg范圍內(nèi)（見表2）。本研究選取限量值附近的濃度，平行6次進行加樣回收試驗。具體方法為：取供試品粉末3 g，精密稱定，添加0.3 mL禁用農(nóng)藥混合對照品，平行6份，分別根據(jù)上文所述的手動QuEChERs法和自動QuEChERs法進行樣品處理，30種農(nóng)藥在3種基質(zhì)中的回收率和相對標準偏差（RSD）結(jié)果見表2和圖1。

圖1 半夏、金銀花、紫蘇葉中禁用農(nóng)藥的回收率結(jié)果及分布情況（手動和自動QuEChERs方法比較）

表2 經(jīng)手動或自動QuECHERs處理的半夏、金銀花、紫蘇葉中禁用農(nóng)藥的回收率和相對標準偏差 （n＝6）

（五）方法的線性和檢測限本研究根據(jù)《中國藥典》四部《2341農(nóng)藥殘留量測定法》中第五法制備混合對照溶液，進行方法的線性和定量限的考察。取空白樣品粉末3 g，精密稱定，然后按照上文所述的自動QuEChERs法制備空白溶液。精密量取空白基質(zhì)溶液1.0 mL（6份），置氮吹儀上，40℃水浴濃縮至0.6 mL，分別加入混合對照品溶液10、20、50、100、150、200μL，加乙腈稀釋至1.0 mL，精密加入0.3 mL水，渦旋混勻，過0.22μm濾膜，待測。取標準曲線最低點，計算信噪比為10∶1時的相應(yīng)濃度，得到方法定量限（LOQ）。30種農(nóng)藥在3種基質(zhì)中的線性范圍、線性方程、線性相關(guān)系數(shù)（r）及定量限見表3。

表3 自動QuEChERs系統(tǒng)用于中藥中禁用農(nóng)藥分析的線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)和定量限

續(xù)表3

三、討論

（一）加樣回收率和精密度根據(jù)《中國藥典》四部《9101分析方法驗證指導原則》[3]和王曉蕾等[15]提出的中藥有害殘留物分析中質(zhì)量控制指導原則，殘留物檢測分析方法的準確度多采用加樣回收的方式進行確認。加樣回收試驗可采用最大殘留限量（MRL）所處的濃度進行6次平行試驗?；厥章蕬?yīng)在70%～120%之間，在滿足重復(fù)性要求的情況下（RSD一般應(yīng)≤15%），部分農(nóng)藥回收率可放寬至60%～130%[3，15]。

本研究分別從根莖類、花類、葉類藥材中選擇1種代表性藥材，即半夏、金銀花、紫蘇葉，進行加樣回收試驗，并將自動QuEChERs與手動QuEChERs方法對比，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，自動QuEChERs方法處理后，3種藥材中禁用農(nóng)藥的回收率為65.6%～103.7%，RSD為0.4%～9.8%；手動QuEChERs方法處理后，3種藥材中禁用農(nóng)藥的回收率為66.1%～105.6%，RSD為0.2%～9.8%。兩種方法的相對標準偏差（RSD）都＜15%，30種禁用農(nóng)藥的回收率均在60%～130%之間，能夠滿足分析方法的要求。

3種藥材中禁用農(nóng)藥的回收率結(jié)果分布情況見圖1和表2。半夏基質(zhì)中自動QuEChERs方法的回收率在65.6%～98.4%之間，手動QuEChERs方法的回收率在68.7%～101.0%之間，兩種方法的回收率范圍基本一致，但自動QuEChERs方法的回收率相對更加集中。金銀花基質(zhì)中自動QuEChERs方法的回收率在66.6%～103.7%之間，手動QuEChERs方法的回收率在66.1%～105.6%之間，兩種方法的回收率范圍基本一致，但與半夏基質(zhì)中不同的是，回收率結(jié)果分布均相對離散。紫蘇葉基質(zhì)中自動QuEChERs方法回收率在69.7%～97.8%之間，手動QuEChERs方法的回收率在68.0%～98.2%之間，兩種方法的回收率范圍基本一致，與半夏基質(zhì)類似的是，自動QuEChERs方法的回收率相對集中。綜上所述，在不同的基質(zhì)中，自動QuEChERs方法與手動QuEChERs方法的回收率范圍基本一致。

除了以上結(jié)果外，兩種方法的結(jié)果都表明，不同基質(zhì)中殺蟲脒（編號5）的回收率都相對偏低，甚至＜70%。除了提取過程存在損失外，可能是過量的凈化吸附劑會對部分農(nóng)藥產(chǎn)生吸附，造成回收率降低。因此建議中藥中禁用農(nóng)藥殘留分析方法建立時，對吸附劑種類和用量進行優(yōu)化，筆者也將在后續(xù)試驗中對凈化劑用量及吸附機理進行更深入的研究。

（二）自動QuEChERs方法的線性和定量限方法的線性和靈敏度是建立殘留分析方法的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。方法確認時，限量值所處的濃度一般應(yīng)在校準曲線的中間或者偏上的位置，線性范圍應(yīng)盡量覆蓋預(yù)期的濃度范圍，校準曲線的相關(guān)系數(shù)（r）一般不低于0.990。分析方法的靈敏度用檢出限（LOD）或者定量限（LOQ）表示。一般以信噪比為10∶1時的相應(yīng)濃度為定量限（LOQ），以信噪比為3∶1時的相應(yīng)濃度為檢測限（LOD）[3，15]。

在本研究中，方法的線性范圍參照《中國藥典》四部《2341農(nóng)藥殘留量測定法》第五法制備混合對照溶液進行考察，方法的線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)（r）和方法定量限結(jié)果見表3。半夏基質(zhì)中r在0.995 0～0.999 8之間，金銀花基質(zhì)中r在0.995 5～0.999 8之間，紫蘇葉基質(zhì)中r在0.995 2～0.999 9之間，3種不同基質(zhì)中的禁用農(nóng)藥的線性相關(guān)系數(shù)都大于0.990，有較好的線性，能夠滿足分析方法的要求。自動QuEChERs方法用于30種禁用農(nóng)藥分析的定量限（LOQ）結(jié)果見表3。結(jié)果表明，采用該方法處理后，不同基質(zhì)中所有農(nóng)藥的LOQ都小于農(nóng)藥的限量值，能夠用于中藥中禁用農(nóng)藥殘留的定量檢測。

（三）方法自動化手動QuEChERs方法需要完成3次振蕩（藥典方法振蕩時間分別為5 min、3 min和5 min）和兩次離心（各5 min）過程，雖然目前已經(jīng)有批量振蕩的多管渦旋振蕩儀器，但仍需要手動完成振蕩和離心步驟的樣品轉(zhuǎn)移，此外還需要手動將提取液定量轉(zhuǎn)移至分散固相萃取凈化管中，10個樣品的處理過程約為60 min。

自動QuEChERs樣品制備系統(tǒng)在主機上能夠通過自動程序控制，可單次有效地實現(xiàn)樣品中待測成分的振蕩提取和離心分離[14]。與其配套使用的樣品制備管，包括內(nèi)管和外管兩部分，外管用于樣品提取，內(nèi)管中有凈化吸附劑，內(nèi)管壁上有0.22μm的聚四氟乙烯膜，由于疏水作用，乙腈提取液在離心作用下進入內(nèi)管，實現(xiàn)定量的轉(zhuǎn)移和凈化。該系統(tǒng)一次處理10個樣品，整個流程時間約為25 min。在此過程中無需人工操作，儀器自動完成振蕩、離心和提取液的定量轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究采用的自動QuEChERs樣品制備系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)QuEChERs方法的自動化，節(jié)約時間，降低勞動強度。

四、結(jié)論

本研究將一種新型的自動QuEChERs樣品制備系統(tǒng)用于中藥中禁用農(nóng)藥殘留測定的樣品制備，該方法與手動QuEChERs方法的準確性結(jié)果一致，且重復(fù)性、線性、定量限滿足分析方法要求。除此之外，該系統(tǒng)能夠自動完成提取和凈化過程，無需人工操作，能夠節(jié)省時間、減少勞動力、減少人為操作誤差，在中藥農(nóng)藥殘留檢測方面有著良好的應(yīng)用前景。