石榴籽油及其游離脂肪酸的甲酯化研究

劉看看， 李道明， 周 端， 鐘小榮， 張佳浩， 劉 寧

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

石榴(PunicagranatumL.)為石榴科石榴屬落葉灌木或小喬木，廣泛種植于印度、伊朗、中國(guó)和美國(guó)等熱帶和亞熱帶國(guó)家，其世界年產(chǎn)量可達(dá)590萬(wàn)噸[1].石榴果肉晶瑩艷麗，營(yíng)養(yǎng)豐富，是古今中外備受人們歡迎的一類多汁漿果.當(dāng)前市場(chǎng)上以石榴為特色的水果加工工藝不斷改進(jìn)，涌現(xiàn)出石榴乳酸飲料、石榴冰茶、石榴養(yǎng)生酒、石榴保健醋、石榴果醬等石榴系列產(chǎn)品[2,3].隨著其加工工藝的成熟，對(duì)于石榴籽，平均含量102.8～119.5 g/kg，約占果實(shí)總重量10%，常以廢料棄之，不僅造成了環(huán)境污染，而且造成了資源的浪費(fèi).

研究發(fā)現(xiàn)，石榴籽中含12%～24%的石榴籽油，與常見的大豆油、花生油、芝麻油和玉米油等植物油相比，石榴籽油富含多不飽和脂肪酸(90%左右)，尤其是含有多不飽和共軛亞麻酸——石榴酸(9c,11t,13c-CLNA)，約70%以上[4,5].此外，石榴籽油中還含有豐富的脂類伴隨物如生育酚、甾醇以及角鯊烯等，其中生育酚包括α、β、δ-生育酚，甾醇有β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾烷醇以及Δ5-燕麥甾醇等[5,6].

石榴酸(Punicic acid,PA)是石榴籽油中主要共軛亞麻酸，此外在石榴籽油中還鑒定出α-桐酸(9c,11t,13t-CLNA)、β-桐酸(9t,11t,13t-CLNA)和梓樹酸(9t,11t,13c-CLNA)這些位置或幾何構(gòu)型不同的共軛亞麻酸異構(gòu)體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示.研究表明，石榴酸具有清除體內(nèi)自由基[7]、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化[8]、提高機(jī)體免疫力[9]、促進(jìn)皮膚細(xì)胞新陳代謝[10]、抗癌[11]、抗肥胖[12]、抗糖尿病[13]以及抗炎[14]等多種生理功效，是石榴籽油發(fā)揮功能特性的主要活性成分.

(a)石榴酸(順-9，反-11，順-13-18∶3)

石榴籽油中石榴酸的含量主要受石榴的品種、產(chǎn)地、種植環(huán)境及采收時(shí)間等影響.對(duì)石榴籽油的脂肪酸含量進(jìn)行分析時(shí)，分析結(jié)果除了受石榴籽油的提取方法等因素影響外，還與檢測(cè)前采用的甲酯化方法有關(guān)[5].油脂甲酯化是指利用酸/堿的催化作用將高沸點(diǎn)、難以揮發(fā)的脂肪酸酯，在甲醇介質(zhì)中，催化生成低沸點(diǎn)、易揮發(fā)、更穩(wěn)定的脂肪酸甲酯[15].當(dāng)前常見的甲酯化方法有堿法甲酯化、酸法甲酯化、三氟化硼法及酶法甲酯化等，不同甲酯化方法的適用范圍和特點(diǎn)各不相同[16-18].

石榴酸由于其獨(dú)特的共軛三烯結(jié)構(gòu)，在甲酯化過(guò)程中容易發(fā)生異構(gòu)，從而降低了油脂中這一生物活性成分的含量.孫瀟輝[19]比較了堿催化甲酯化法、酸催化甲酯化法以及三氟化硼甲酯化法對(duì)瓜蔞籽油脂肪酸組成測(cè)定的影響，通過(guò)GC-MS分析發(fā)現(xiàn)堿法甲酯化和三氟化硼法對(duì)瓜蔞酸(亦稱石榴酸)的影響較小，測(cè)得石榴酸的含量分別為31.24%和27.17%，總異構(gòu)體含量分別為4.94%和6.36%，而酸催化甲酯化法對(duì)石榴酸的破壞較為嚴(yán)重，測(cè)得石榴酸含量?jī)H有6.43%，較多異構(gòu)為α-桐酸、梓樹酸、γ-亞麻酸和α-亞麻酸，總異構(gòu)體達(dá)23.84%.袁高峰等[20]以栝樓籽油為原料，比較和優(yōu)化了兩種脂質(zhì)形式的共軛亞麻酸的甲酯化方法，發(fā)現(xiàn)采用堿法甲酯化(0.5 mol/L 甲醇鈉-甲醇)，55 ℃反應(yīng)20 min，測(cè)得石榴酸含量為32.27%，而異構(gòu)體總量低于5%；而采用酸法催化甲酯化(1 mol/L H2SO4-甲醇)，高溫(>60 ℃)，長(zhǎng)時(shí)間(>40 min)反應(yīng)，導(dǎo)致栝樓籽油中的石榴酸嚴(yán)重異構(gòu)為α-桐酸和梓樹酸，異構(gòu)體總量達(dá)10%以上；此外發(fā)現(xiàn)游離脂肪酸形式的共軛亞麻酸適合采用酸法催化甲酯化，50 ℃反應(yīng)10 min，測(cè)得石榴酸含量為31.40%.袁高峰等[21]以酸法甲酯化(1 mol/L H2SO4-甲醇)研究了栝樓、石榴、苦瓜種子油的脂肪酸組成，結(jié)果表明栝樓籽油中石榴酸32.60%，總異構(gòu)體3.90%(α-桐酸與梓樹酸)；石榴籽油中石榴酸73.4%～77.5%，總異構(gòu)體9.4%～10.0%(梓樹酸與β-桐酸)；苦瓜籽油富含α-桐酸，含量56.0%～63.7%，總異構(gòu)體8.0%～10.0%(梓樹酸與β-桐酸).Zaouay等[22]采用堿法甲酯化(2 mol/L氫氧化鉀-甲醇)處理石榴籽油，通過(guò)GC-FID檢測(cè)到石榴籽油中14種脂肪酸，其中石榴酸占72.31%～79.57%，總不飽和脂肪酸占90.49%～95.92%.Kaseke等[23]采用酸法甲酯化(20% H2SO4-甲醇)處理石榴籽油，通過(guò)GC-MS測(cè)得石榴籽油中棕櫚酸5.64%～7.74%、硬脂酸2.34%～3.08%、油酸7.43%～9.62%、亞油酸11.59%～16.64%，石榴酸62.75%～70.51%，其中多不飽和脂肪酸占79.16%～82.60%.針對(duì)當(dāng)前甲酯化方法對(duì)分析富含石榴酸的植物油脂組分存在的石榴酸異構(gòu)嚴(yán)重、各脂肪酸組分分析尚不全面、且含量差異顯著等問題，系統(tǒng)性開展富含石榴酸的植物油脂的甲酯化方法研究具有重要意義.

植物油脂中石榴酸組分的測(cè)定，不僅取決于甲酯化方法的選擇，而且與甲酯化溫度、時(shí)間等有關(guān).由于三氟化硼有劇毒，且操作繁瑣，不適合大批量脂肪酸的檢測(cè)，本文以石榴籽油為研究對(duì)象，比較了堿法和酸法甲酯化對(duì)石榴籽油及其混合游離脂肪酸各組分含量的影響，以期建立適宜于不同脂質(zhì)形式的共軛亞麻酸的甲酯化方法，最大程度地避免石榴酸的異構(gòu)，更完整地表征石榴籽油的脂肪酸譜，該研究對(duì)以石榴酸為特征性脂肪酸的油脂的表征及進(jìn)行功能性油脂的改性具有重要指導(dǎo)意義.

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 原料與試劑

2020年10月份采購(gòu)陜西臨潼凈皮甜石榴.氯化鈉，無(wú)水硫酸鈉，氫氧化鈉，氫氧化鉀，甲醇鈉，濃硫酸，濃鹽酸，37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司)，正己烷(色譜純)，甲醇，95%乙醇，乙醚，冰乙酸，正己烷均為分析純，GF254薄層色譜硅膠板.

1.1.2 儀器與設(shè)備

分析天平(賽多利斯，BSA224S)，干式氮吹儀(ZGDCY-12)，氣相色譜儀(島津 GC-2010 Pro)，液相色譜儀(島津 LC-16)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA)，多功能高速粉碎機(jī)，高速臺(tái)式離心機(jī)，手動(dòng)榨汁機(jī)，層析缸，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石榴籽油提取的工藝流程及操作要點(diǎn)

(1)工藝流程

新鮮石榴→剝皮、去囊衣→收集假種皮→壓榨去汁→石榴籽→水洗→烘干→粉碎→溶劑振蕩浸提→抽濾分離→真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→石榴籽油.

(2)操作要點(diǎn)

參照Z(yǔ)hong J等[24]的方法，略有改動(dòng).采購(gòu)的新鮮石榴經(jīng)過(guò)篩選、剝皮、去囊衣以及收集假種皮，然后用手動(dòng)榨汁器去汁，將所得的濕石榴籽水洗3～4遍，去除表面殘留的果肉；置于40 ℃烘箱中烘干至水分含量3.80 wt%～4.90 wt%，冷卻后用高速粉碎機(jī)粉碎，得石榴籽粉.將石榴籽粉和正己烷溶劑，按照1∶4料液比裝于500 mL錐形瓶中，混合均勻，放入氣浴搖床中，在轉(zhuǎn)速200 rpm，溫度40 ℃條件下，振蕩浸提2 h.浸提結(jié)束后，用抽濾瓶抽濾，分離溶劑混合物與殘?jiān)?，用正己烷洗滌濾渣2次，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸餾，回收溶劑，得到石榴籽油.

1.2.2 石榴籽油出油率

出油率=石榴籽油的質(zhì)量(g)/石榴籽粉的質(zhì)量(g)×100%

1.2.3 石榴籽油品質(zhì)指標(biāo)

(1)色澤：按照GB/T 5492-2008[25]執(zhí)行.

(2)氣味、透明度：按照GB/T 5525-2008[26]執(zhí)行.

(3)過(guò)氧化值：按照GB 5009.227-2016執(zhí)行[27].

(4)酸價(jià)：按照美國(guó)油脂檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)AOCS Ca 5a-40，游離脂肪酸含量以油酸面積比乘以1.99來(lái)計(jì)算[28].

1.3 脂肪酸組成的測(cè)定

1.3.1 石榴籽油甲酯化方法

由于三氟化硼有劇毒，本文就堿法甲酯化和酸法甲酯化對(duì)石榴籽油脂肪酸組成的影響進(jìn)行研究.

(1)堿法甲酯化

根據(jù)文獻(xiàn)[17]，選用甲酯化溫度、時(shí)間、催化劑的種類、催化劑的濃度為考察因子，以石榴酸的含量為試驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表1所示.

表1 單因素水平表

取20μL石榴籽油于20 mL具塞試管中，加入1 mL色譜純正己烷，混勻以溶解試樣，然后加入2 mL一定濃度氫氧化鈉-甲醇溶液(三種常用的堿法甲酯化的催化劑種類：氫氧化鈉、氫氧化鉀、甲醇鈉；催化劑的濃度：0.1 mol/L、0.25 mol/L、0.50 mol/L、0.75 mol/L、1.0 mol/L).往試管中充入氮?dú)?，蓋上塞子充分振搖，置于室溫或不同水浴溫度下(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃)甲酯化一定時(shí)間(5 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min).再加入2 mL正己烷充分搖勻以提取脂肪酸甲酯，最后加入1 mL飽和氯化鈉溶液，靜置分層.吸取1 mL上清液于裝有0.5 g無(wú)水硫酸鈉的離心管中，渦旋混勻，10 000 rpm離心2 min.取上清液于色譜瓶中待測(cè).

(2)酸法甲酯化

取20μL石榴籽油于20 mL具塞試管中，加入1 mL色譜純正己烷，混勻以溶解試樣，然后加入2 mL 1.0mol/L H2SO4-甲醇溶液，往試管中充入氮?dú)?，蓋上塞子充分振搖，室溫下甲酯化20 min.再加入2 mL正己烷充分搖勻以提取脂肪酸甲酯，最后加入1 mL飽和氯化鈉溶液，靜置分層.吸取1 mL上清液于裝有0.5 g無(wú)水硫酸鈉的離心管中，渦旋混勻，10 000 rpm離心2 min.取上清液于色譜瓶中待測(cè).

1.3.2 石榴籽油的皂化和混合游離脂肪酸的制備

參照鄭平玉[29]的皂化法制備游離脂肪酸，稍作改動(dòng).具體操作方法：稱取10 g石榴籽油于250 mL圓底燒瓶中，加入4.4 mL蒸餾水、2.30 g KOH和26.40 mL 95%乙醇，于80 ℃水浴鍋中皂化回流1 h，冷卻后加入20 mL蒸餾水，混勻后轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入40 mL正己烷，用分液漏斗萃取不皂化物，去除上層己烷層，連續(xù)萃取兩次，得到的水層用3 mol/L的鹽酸酸化到pH為1，此時(shí)，脂肪酸全部析出.加入20 mL正己烷，用分液漏斗萃取析出的脂肪酸，去除水層.得到的己烷層用無(wú)水硫酸鈉除水，過(guò)濾后濾液于40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去殘留的溶劑.參照李琳琳[30]的方法，并稍作修改，對(duì)制備的游離脂肪酸混合物采用HPLC-RID進(jìn)行分析確認(rèn)無(wú)甘油三酯殘留后，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.3.3 石榴酸混合脂肪酸的甲酯化

皂化后的石榴籽油的混合游離脂肪酸分別采用酸法和堿法甲酯化法分析混合游離脂肪酸的脂肪酸組成.堿法甲酯化按照章節(jié)1.3.1中(1)所述最終優(yōu)化的方法進(jìn)行；酸法甲酯化按照章節(jié)1.3.1中(2)所述的方法進(jìn)行，并對(duì)酸法甲酯化的時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，即甲酯化5 min、10 min、20 min、30 min、40 min.

1.4 甲酯化期充氮?dú)鈱?duì)石榴籽油及其混合游離脂肪酸組成的影響

為進(jìn)一步簡(jiǎn)化甲酯化方法，本文對(duì)氮?dú)庠诩柞セ陂g的必要性做進(jìn)一步研究.在最佳條件下分別比較了甲酯化期間充入氮?dú)夂筒怀涞獨(dú)鈱?duì)石榴籽油及混合游離脂肪酸中各脂肪酸組分的影響，通過(guò)分析石榴籽油及混合游離脂肪酸的脂肪酸組成來(lái)確定甲酯化時(shí)充氮?dú)獾谋匾?

1.5 薄層色譜分析甲酯化是否反應(yīng)完全

參照朱東奇[31]的方法，并稍作修改.以未進(jìn)行甲酯化的石榴籽油為標(biāo)樣與石榴籽油的5 min、10 min、20 min的堿法甲酯化反應(yīng)產(chǎn)物以及石榴籽油經(jīng)皂化后游離脂肪酸的5 min、10 min、20 min的酸法甲酯化反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行點(diǎn)板比較，石榴籽油標(biāo)樣與正己烷和乙醚混合液(8∶2，v/v)，按照10∶1(μL·mL-1)的比例混合均勻備用.展開劑組成：正己烷/乙醚/乙酸=80∶20∶1(v/v/v)，硅膠板在層析杠中展開、取出、自然晾干，然后置于紫外燈254 nm下觀察各甘油酯和脂肪酸以及脂肪酸甲酯所對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)，判斷石榴籽油及其混合游離脂肪酸分別在短時(shí)間內(nèi)是否甲酯化完全.

1.6 GC-FID法測(cè)定脂肪酸組成

氣相色譜條件：FBX-10毛細(xì)管柱(100 m×0.25 mm×0.20μm)，氣化室溫度：250 ℃，檢測(cè)器溫度：280 ℃.進(jìn)樣量1μL，進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比100∶1.以N2為載氣，N2流量35 mL/min，H2流量40 mL/min ，空氣流量400 mL/min.程序升溫條件：初始溫度 120 ℃，保留3 min，然后以5 ℃/min，升溫到140 ℃ ，保留3 min；再以3 ℃/min，升溫到200 ℃，保留3 min；再以3 ℃/min，升溫到230 ℃，保留40 min.程序升溫時(shí)間合計(jì)83 min，檢測(cè)結(jié)束時(shí)間為87 min.

1.7 數(shù)據(jù)處理

定性：對(duì)照37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，根據(jù)各脂肪酸甲酯出峰的保留時(shí)間對(duì)石榴籽油脂肪酸色譜峰進(jìn)行定性，確定所測(cè)石榴籽油及其混合游離脂肪酸中的脂肪酸甲酯成分.

定量：通過(guò)GC-FID色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，依據(jù)色譜峰的峰面積，采用面積歸一化法進(jìn)行定量，得出所測(cè)石榴籽油及其混合游離脂肪酸中各脂肪酸組分的相對(duì)百分含量.

采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，小寫字母表示同一方法不同處理參數(shù)的差異顯著性(P<0.05).

2 結(jié)果與討論

2.1 石榴籽油品質(zhì)指標(biāo)

按照1.2.1所述的方法，提取的石榴籽油呈金黃色，澄清透明，如圖2所示.石榴籽油的出油率、色澤、氣味、酸價(jià)、過(guò)氧化值等如表2所示.

圖2 石榴籽油

表2 石榴籽油的品質(zhì)指標(biāo)

2.2 堿法甲酯化的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 甲酯化的溫度對(duì)各脂肪酸組分的影響

取20μL石榴籽油于具塞試管中，先加入1 mL色譜純正己烷，搖勻以溶解試樣.再加入2 mL 0.5 mol/L甲醇鈉-甲醇溶液，分別置于室溫以及30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃水浴溫度下甲酯化30 min，不同溫度對(duì)石榴籽油堿法甲酯化各脂肪酸組分的影響如表3所示.由表3可知，不同溫度下，石榴籽油中石榴酸(83.42%～83.83%)、總單不飽和脂肪酸(4.85%～4.97%)、總多不飽和脂肪酸(89.83%～90.08%)以及總飽和脂肪酸(5.07%～5.24%)之間沒有顯著差異(P<0.05).此外除石榴酸外的其它共軛亞麻酸異構(gòu)體總量不足1%，揭示了高溫對(duì)石榴酸的異構(gòu)化影響不大，與袁高峰等[20]報(bào)道的采用堿法甲酯化處理栝樓籽油，溫度對(duì)石榴酸的異構(gòu)化程度影響較低的結(jié)論一致.為簡(jiǎn)化操作，提高效率，后續(xù)選擇在室溫下對(duì)甲酯化方法作進(jìn)一步優(yōu)化.

表3 甲酯化溫度對(duì)石榴籽油各脂肪酸組分的影響(%)

2.2.2 甲酯化的時(shí)間對(duì)各脂肪酸組分的影響

取20μL石榴籽油于具塞試管中，先加入1 mL色譜純正己烷，搖勻以溶解試樣.再加入2 mL 0.5 mol/L甲醇鈉-甲醇溶液，分別于室溫下甲酯化5 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，期間不時(shí)混勻.不同甲酯化時(shí)間對(duì)石榴籽油堿法甲酯化各脂肪酸組分的影響如表4所示.由表4可知，室溫下甲酯化5～50 min，石榴籽油中石榴酸(82.97%～83.44%)、總單不飽和脂肪酸(4.98%～5.10%)，總多不飽和脂肪酸(89.47%～89.80%)以及總飽和脂肪酸(5.22%～5.43%)之間沒有顯著差異(P<0.05)；當(dāng)甲酯化60 min，石榴酸含量顯著降低(82.44%)，且其他共軛亞麻酸異構(gòu)體總量達(dá)1.16%，顯著高于甲酯化5～50 min各組，說(shuō)明甲酯化60 min后，石榴酸有異構(gòu)化趨勢(shì).另外整體上隨著甲酯化時(shí)間的增加，總多不飽和脂肪酸呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)，因此為節(jié)約時(shí)間，同時(shí)保證石榴籽油中總多不飽和脂肪酸的含量以及避免石榴酸的異構(gòu)，選擇5 min為最佳甲酯化時(shí)間，對(duì)石榴籽油堿法甲酯化方法作進(jìn)一步優(yōu)化.

表4 甲酯化時(shí)間對(duì)石榴籽油各脂肪酸組分的影響(%)

2.2.3 催化劑的種類對(duì)各脂肪酸組分的影響

堿法甲酯化常用的三種堿性催化劑，即甲醇鈉、氫氧化鈉和氫氧化鉀.取20μL石榴籽油于具塞試管中，先加入1 mL色譜純正己烷，搖勻以溶解試樣，再分別加入2 mL的0.5 mol/L甲醇鈉-甲醇溶液、0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液以及0.5 mol/L KOH-甲醇溶液，室溫下甲酯化5 min，這里比較了三種堿性催化劑對(duì)石榴籽油堿法甲酯化各脂肪酸組分的影響，結(jié)果如表5所示.由表5可以看出，三種催化劑催化的甲酯化反應(yīng)中，測(cè)得總異構(gòu)體(1.07%～1.14%)之間無(wú)顯著差異，而以NaOH和KOH為催化劑測(cè)得石榴酸含量分別達(dá)83.63%和83.23%，顯著高于甲醇鈉(82.90%).考慮到NaOH更廉價(jià)易得，后續(xù)選擇NaOH作為最佳催化劑對(duì)石榴籽油堿法甲酯化作進(jìn)一步優(yōu)化.

表5 甲酯化的催化劑種類對(duì)石榴籽油各脂肪酸組分的影響(%)

2.2.4 催化劑的濃度對(duì)各脂肪酸組分的影響

取20μL石榴籽油于具塞試管中，先加入1 mL色譜純正己烷，搖勻以溶解試樣.分別加入2 mL的0.1 mol/L、0.25 mol/L、0.5 mol/L、0.75 mol/L、1.0 mol/L NaOH-甲醇溶液，室溫下甲酯化5 min.考察催化劑濃度對(duì)石榴籽油堿法甲酯化各脂肪酸組分的影響，結(jié)果如表6所示.由表6可知，催化劑的濃度過(guò)低(0.1 mol/L)或者過(guò)高(1.0 mol/L)，都會(huì)導(dǎo)致一定程度的石榴酸異構(gòu)，從而降低了石榴酸的含量(82%左右)，增加了其他共軛亞麻酸異構(gòu)體的總量(>1%).當(dāng)濃度為0.75 mol/ L時(shí)，測(cè)得石榴酸的含量達(dá)84.05%，其他共軛亞麻酸異構(gòu)體的總量為0.85%，總多不飽和脂肪酸含量達(dá)90.19%，因此選擇0.75 mol/L作為催化劑的最佳濃度.

表6 NaOH-甲醇溶液濃度對(duì)石榴籽油各脂肪酸組分的影響(%)

2.2.5 石榴籽油堿法甲酯化的最佳條件

經(jīng)過(guò)單因素優(yōu)化，確定石榴籽油堿法甲酯化的最佳條件：取20μL石榴籽油，以0.75 mol/L NaOH-甲醇溶液為溶劑，室溫下甲酯化5 min.甲酯化產(chǎn)物經(jīng)過(guò)GC-FID檢測(cè)分析，參考37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖和文獻(xiàn)中石榴籽油脂肪酸組成的色譜圖[32,33]，對(duì)本研究石榴籽油的氣相色譜圖進(jìn)行定性，其結(jié)果如圖3所示.石榴籽油中主要脂肪酸含量從大到小依次是：石榴酸>亞油酸>油酸>棕櫚酸>硬脂酸，其中石榴酸含量在84%～85%左右.石榴籽油中還檢測(cè)到石榴酸的另外3種共軛亞麻酸異構(gòu)體，即α-桐酸、梓樹酸和β-桐酸，這些共軛亞麻酸異構(gòu)體總量合計(jì)不足1%，說(shuō)明石榴籽油適宜采用堿法甲酯化，不僅能測(cè)得較高的石榴酸含量，而且測(cè)得的石榴酸較穩(wěn)定，很少發(fā)生異構(gòu)，這與Natolino等[34]采用2 mol/L KOH-甲醇溶液分別處理由超臨界CO2萃取和索氏萃取的石榴籽油的石榴酸含量一致(85.40%和84.20%).石榴籽油中檢測(cè)到多不飽和脂肪酸含量達(dá)90%左右，棕櫚酸、硬脂酸、十七碳酸、二十碳酸、二十二碳酸等飽和脂肪酸含量合計(jì)約5%.油酸是主要的單不飽和脂肪酸，占4%～5%左右.

圖3 石榴籽油堿法甲酯化的脂肪酸色譜圖

2.3 石榴籽油的酸法甲酯化

石榴籽油采用酸法甲酯化的報(bào)道也有不少.武鵬凱等[35]采用5% H2SO4-甲醇催化石榴籽油甲酯化，70 ℃振蕩60 min，通過(guò)GC-MS分析，僅檢測(cè)出5種脂肪酸.Kaseke等[23]采用酸法甲酯化(20% H2SO4-甲醇)處理石榴籽油，通過(guò)GC-MS分析，測(cè)得不同品種間石榴籽油中石榴酸的含量62.75%～70.51%，此外還檢測(cè)到油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸等脂肪酸.袁高峰等[21]采用酸法甲酯化(H2SO4-甲醇)處理石榴籽油，共檢測(cè)到12種脂肪酸，其中石榴酸含量達(dá)73.4%～77.5%，梓樹酸7.8%～8.4%，β-桐酸1.1%～2.2%.本文采用酸法甲酯化處理石榴籽油，其結(jié)果如圖4所示.采用酸法甲酯化共檢測(cè)到11種脂肪酸，與堿法甲酯化相比，酸法甲酯化不僅對(duì)石榴酸的異構(gòu)化程度影響較大，總異構(gòu)體2.67%～6.21%(α-桐酸、梓樹酸與β-桐酸)；而且對(duì)石榴籽油中石榴酸、油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸等主要脂肪酸組分的破壞較為嚴(yán)重，尤其對(duì)石榴酸，測(cè)得石榴酸含量?jī)H38.93%～42.01%.因此石榴籽油脂肪酸組分分析不適合采用酸法甲酯化.

圖4 石榴籽油酸法甲酯化的脂肪酸氣相色譜圖

2.4 混合游離脂肪酸的制備

石榴籽油經(jīng)皂化后油樣的液相色譜圖如圖5所示.由表7可知，石榴籽油中游離脂肪酸含量?jī)H1.02%，經(jīng)過(guò)皂化后，混合游離脂肪酸含量達(dá)98.90%，說(shuō)明石榴籽油的皂化完全.

圖5 石榴籽油皂化后油樣的液相色譜圖

表7 石榴籽油皂化前后各甘油酯組分含量(%)

2.4.1 混合游離脂肪酸的堿法甲酯化

石榴籽油皂化后的混合游離脂肪酸由于皂化較為徹底，產(chǎn)物中接近99%的游離脂肪酸，在堿法甲酯化處理過(guò)程中，多數(shù)游離脂肪酸與堿反應(yīng)生成了皂，因此無(wú)法用GC-FID檢測(cè)出各類脂肪酸組分.

2.4.2 混合游離脂肪酸的酸法甲酯化

取20μL混合游離脂肪酸于具塞試管中，先加入1 mL色譜純正己烷，搖勻以溶解試樣.再加入2 mL 1.0 mol/L H2SO4-甲醇溶液，充入氮?dú)夂髶u勻，分別于室溫下甲酯化5 min、10 min、20 min、30 min、40 min，期間不時(shí)振蕩混勻.不同甲酯化時(shí)間對(duì)石榴酸混合游離脂肪酸各脂肪酸組分的影響如表8所示.由表8可知，室溫下甲酯化5～40 min，石榴籽油中石榴酸(83.88%～84.35%)、總單不飽和脂肪酸(4.66%～5.04%)，總多不飽和脂肪酸(90.12%～90.43%)以及總飽和脂肪酸(4.75%～5.08%)之間沒有顯著性差異(P<0.05)；說(shuō)明室溫下采用酸法甲酯化，對(duì)石榴酸影響較小，為節(jié)約時(shí)間以及確保甲酯化完全，選擇5 min為最佳甲酯化時(shí)間.

表8 時(shí)間對(duì)混合游離脂肪酸酸法甲酯化的影響(%)

2.5 混合游離脂肪酸的酸法甲酯化的最佳條件

取20μL混合游離脂肪酸于具塞試管中，先加入1 mL色譜純正己烷，搖勻以溶解試樣.再加入2 mL 1.0 mol/L H2SO4-甲醇溶液，充入氮?dú)夂髶u勻，于室溫下甲酯化5 min，期間不時(shí)振蕩混勻，加入2 mL色譜純正己烷，充分振搖均勻.石榴籽油皂化后的混合游離脂肪酸的氣相色譜圖如圖6所示.最佳條件下酸法甲酯化，測(cè)得混合游離脂肪酸中主要脂肪酸組成依次：石榴酸>亞油酸>油酸>棕櫚酸>硬脂酸；其中混合游離脂肪酸中的石榴酸(83.59%～84.68%)、油酸(4.27%～4.52%)、亞油酸(4.26%～4.54%)、棕櫚酸(2.45%～2.62%)、硬脂酸(1.81%～1.93%)等組分的含量與石榴籽油中對(duì)應(yīng)的石榴酸(83.30%～84.92%)、油酸(4.37%～4.69%)、亞油酸(4.58%～4.78%)、棕櫚酸(2.37%～2.71%)、硬脂酸(1.85%～2.10%)等組分基本一致.值得注意的是，酸法甲酯化測(cè)定的混合游離脂肪酸中α-桐酸的含量(0.08%～0.18%)顯著高于堿法甲酯化測(cè)定的石榴籽油中的α-桐酸(0～0.03%)，但測(cè)得的總異構(gòu)體(包括α-桐酸、梓樹酸以及β-桐酸)之間沒有顯著性差異(P<0.05).此外，酸法甲酯化測(cè)定的混合游離脂肪酸中總多不飽和脂肪酸(90.12%～90.47%)、總共軛亞麻酸(84.75%～85.02%)、總飽和脂肪酸(4.75%～5.15%)，總單不飽和脂肪酸(4.66%～5.04%)也同堿法甲酯化測(cè)定的石榴籽油中的組分一致，說(shuō)明石榴籽油皂化后的混合游離脂肪酸適合采用酸法甲酯化法.

圖6 石榴籽油經(jīng)皂化后混合游離脂肪酸的氣相色譜圖

2.6 氮?dú)鈱?duì)石榴籽油及其混合游離脂肪酸甲酯化的影響

甲酯化過(guò)程中是否充入氮?dú)鈱?duì)石榴籽油及混合游離脂肪酸的脂肪酸組分的影響，如表9所示.由表9可知，甲酯化期間是否充入氮?dú)鈱?duì)石榴籽油中石榴酸等脂肪酸組分沒有影響(石榴酸：充入氮?dú)?4.25±0.27%、不充氮?dú)?4.13±0.25%)，但會(huì)影響混合游離脂肪酸的石榴酸及其共軛亞麻酸異構(gòu)體的含量.充入氮?dú)鈺?huì)一定程度上保護(hù)游離脂肪酸形式的石榴酸避免異構(gòu)(83.59±0.21%)；而不充氮?dú)猓瑢?dǎo)致一定量的石榴酸異構(gòu)為α-桐酸、梓樹酸以及β-桐酸這些共軛亞麻酸異構(gòu)體，從而降低了石榴酸的含量(81.09±0.32%)，增加了總異構(gòu)體的含量(3.72±0.32%).這里體現(xiàn)了甘油三酯形式的石榴酸比游離脂肪酸形式的更加穩(wěn)定，因此對(duì)于檢測(cè)石榴籽油這種甘油三酯形式石榴酸組分，可以省去氮?dú)?，以?jiǎn)化甲酯化的步驟；但對(duì)于游離脂肪酸形式的石榴酸，在不充氮?dú)獾那闆r下，僅甲酯化5 min就有明顯的異構(gòu)現(xiàn)象，因此對(duì)于檢測(cè)游離脂肪酸形式的石榴酸組分，甲酯化過(guò)程中充入氮?dú)馐菧?zhǔn)確檢測(cè)石榴酸組分避免其異構(gòu)的關(guān)鍵，不能省去.

表9 氮?dú)鈱?duì)石榴籽油及其混合游離脂肪酸組成的影響

2.7 薄層色譜結(jié)果

石榴籽油及其混合游離脂肪酸甲酯化產(chǎn)物的薄層色譜圖如圖7所示.由圖7可知，石榴籽油和其皂化后混合游離脂肪酸甲酯化5～20 min的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)薄層色譜分析，均只有脂肪酸甲酯斑點(diǎn)出現(xiàn)，而沒有甘油三酯斑點(diǎn)，說(shuō)明甲酯化完全，驗(yàn)證了最佳條件下堿法甲酯化和酸法甲酯化的準(zhǔn)確可靠性.石榴籽油和混合游離脂肪酸在各自最佳條件下僅甲酯化5 min就能完全甲酯化，體現(xiàn)甲酯化反應(yīng)是一個(gè)快速的反應(yīng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了本文采用的堿法甲酯化和酸法甲酯化能較好地適用于石榴籽油及其混合游離脂肪酸的脂肪酸組分分析.

圖7 石榴籽油及其混合游離脂肪酸甲酯化產(chǎn)物的薄層色譜圖

3 結(jié)論

(1)比較了酸法和堿法兩種甲酯化方法對(duì)分析石榴籽油中各脂肪酸組分的影響，發(fā)現(xiàn)制備石榴籽油脂肪酸甲酯適宜采用堿法甲酯化，而不適宜采用酸法甲酯化，主要由于酸法甲酯化對(duì)石榴籽油中各脂肪酸組分，尤其對(duì)石榴酸的破壞較嚴(yán)重，影響石榴籽油中脂肪酸組分的測(cè)定.本研究就堿法甲酯化的工藝條件進(jìn)行單因素優(yōu)化，考察了甲酯化的溫度、時(shí)間、催化劑的種類、催化劑的濃度4個(gè)因素對(duì)石榴籽油甲酯化處理中各脂肪酸組分的影響.確定了石榴籽油堿法甲酯化的最佳條件：室溫下，甲酯化5 min，催化劑為NaOH，催化劑濃度為0.75 mol/L NaOH-甲醇溶液.通過(guò)GC-FID檢測(cè)分析，石榴籽油中脂肪酸組成：以石榴酸為主，占84.05%、亞油酸4.67%、油酸4.42%、棕櫚酸2.45%、硬脂酸1.89%、α-亞麻酸0.45%等，此外還測(cè)得少量的共軛亞麻酸異構(gòu)體，即α-桐酸0.01%、梓樹酸0.58%以及β-桐酸0.26%.石榴籽油中多不飽和脂肪酸占90.19%，共軛亞麻酸接近85%的，主要是石榴酸.本法測(cè)定的石榴籽油脂肪酸組成結(jié)果重現(xiàn)性好，不僅操作簡(jiǎn)便，省去了冷凝回流器或水浴鍋加熱等步驟，還縮短了甲酯化處理時(shí)間，提高了脂肪酸檢測(cè)的效率.

(2)本文還對(duì)石榴籽油皂化后混合游離脂肪酸的甲酯化方法進(jìn)行了簡(jiǎn)單的篩選和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)混合游離脂肪酸不適合采用堿法甲酯化，主要由于游離脂肪酸與堿會(huì)生成了皂；但適合采用酸法甲酯化，在1.0 mol/L H2SO4-甲醇溶液中，于室溫下甲酯化5 min.通過(guò)GC- FID檢測(cè)分析，混合游離脂肪酸中石榴酸84.35%，亞油酸4.76%、油酸4.63%、棕櫚酸2.39%、硬脂酸1.70%、α-亞麻酸0.46%，α-桐酸0.08%、梓樹酸0.37%以及β-桐酸0.17%等脂肪酸.其中共軛亞麻酸84.97%，多不飽和脂肪酸90.21%，單不飽和脂肪酸5.04%，整體來(lái)講，混合游離脂肪酸與石榴籽油中各脂肪酸組分及含量基本一致，均能檢測(cè)到15種脂肪酸組分，不同點(diǎn)在于酸法甲酯化處理的混合游離脂肪酸的α-桐酸(0.08%～0.24%)顯著高于石榴籽油堿法甲酯化處理的α-桐酸(<0.03%).

(3)為進(jìn)一步簡(jiǎn)化甲酯化步驟，本文以容易異構(gòu)的石榴酸為研究對(duì)象，考察了氮?dú)鈱?duì)石榴籽油及其混合游離脂肪酸甲酯化反應(yīng)的必要性.結(jié)果表明，是否充入氮?dú)鈱?duì)石榴籽油各脂肪酸組分沒有顯著影響，對(duì)混合游離脂肪酸中油酸、亞油酸、亞麻酸等常見的不飽和脂肪酸組分也沒有顯著影響，但對(duì)共軛亞麻酸組分，尤其對(duì)石榴酸有顯著影響(P<0.05)，不充氮?dú)獾那闆r下進(jìn)行甲酯化，會(huì)導(dǎo)致石榴酸異構(gòu)為α-桐酸、梓樹酸以及β-桐酸這些共軛亞麻酸異構(gòu)體，從而降低了原有的石榴酸含量，影響測(cè)定脂肪酸組分的準(zhǔn)確性.因此甲酯化反應(yīng)是否要充入氮?dú)?，不僅取決于所測(cè)脂肪酸的脂質(zhì)形式，還取決于所測(cè)脂肪酸的種類.對(duì)于測(cè)定石榴酸這種稀有的、容易異構(gòu)的多不飽和脂肪酸，甘油酯形式的在甲酯化期間可以不通氮?dú)?，而游離脂肪酸形式的則需要通入氧氣.