中藥海龍抗D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷作用研究

張警文，何旭輝，夏天爽，蔣益萍，辛海量 （. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 福建 福州350；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院, 上海 00433）

隨著人類預(yù)期壽命的延長，人口老齡化問題日趨嚴(yán)重，阿爾茲海默癥等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率也大幅上升[1]。學(xué)習(xí)記憶障礙作為阿爾茲海默癥的主要臨床表現(xiàn)之一，貫穿阿爾茲海默癥疾病發(fā)展的全過程，并呈進(jìn)行性加重，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量，成為亟待解決的公共衛(wèi)生問題[2]。海龍（Syngnathus）系為海龍科動(dòng)物刁海龍Solenognathus hardwickii（Gy）、尖海龍Syngnathoides biaculeatus（Bloch）、擬海龍Syngnathus acusLinnaeus 的干燥體，具有溫腎壯陽、散結(jié)消腫的作用[3]?，F(xiàn)代研究表明海龍富含多種脂肪酸、氨基酸以及甾體化合物，具有抗衰老、抗骨質(zhì)疏松、性激素樣等藥理作用[4]。DHA 作為海龍脂肪酸的重要成分之一，具有促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞生長發(fā)育、抑制神經(jīng)炎癥及氧化應(yīng)激的作用[5]。目前尚無治療阿爾茲海默癥的特效藥物，海龍?jiān)诟纳茖W(xué)習(xí)記憶損傷方面的研究亦屬空白。本研究擬探討海龍對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的保護(hù)作用，并測定海龍中DHA 含量，初步闡明海龍改善學(xué)習(xí)記憶損傷的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3 月齡雄性ICR 小鼠，體重（28±2）g，清潔級(jí)，購自昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司，合格證編號(hào)：No.202009910；許可證號(hào)：SCXK（蘇）2008-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)于海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫控制在（24±0.5） ℃，12 h 光照/12 h 黑暗，自由飲水、飲食。

1.2 試劑與儀器

D-半乳糖、羧甲基纖維素鈉（Sigma 公司）；脂質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA）試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、BCA 蛋白檢測試劑盒、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；AKT、p-AKT、FOXO1、SOD2、GAPDH 抗體（CST 公司）；二十二碳六烯酸（DHA，純度≥98%）購自上海麥克林生化科技有限公司。

2 方法

2.1 海龍?zhí)崛∥镏苽?/h3>

海龍（購自安徽亳州藥材市場）經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生藥學(xué)教研室辛海量教授鑒定為刁海龍。精密稱取干燥海龍生藥，剪碎，以料液比為1:10 的80%乙醇浸泡12 h，80%乙醇冷凝回流提取2 次，90%乙醇冷凝回流提取1 次，每次回流提取2 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮干燥為浸膏。

2.2 海龍中DHA 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：AcclaimTM120 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脫；流速：0.6 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：203 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2.2 樣品及對(duì)照品制備

精密稱定海龍乙醇提取物浸膏，配制成0.04 g/ml（以生藥計(jì)）乙醇溶液；精密稱取DHA 對(duì)照品，溶解配置成0.5 mg/ml 乙醇溶液。供試品溶液及對(duì)照品溶液均經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾除菌，備用。

2.3 動(dòng)物分組及處理

將24 只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、海龍低劑量組、海龍高劑量組，每組6 只。對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，其余3 組小鼠均腹腔注射D-gal（150 mg/kg），每周3 次，復(fù)制衰老動(dòng)物模型。海龍低、高劑量組給藥劑量為1、2 g/kg（以生藥計(jì)），空白組、模型組灌胃CMC-Na 溶液，每周灌胃給藥6 d。給藥體積為0.1 ml/10 g，每周稱重1 次，給藥量隨體重變化增減，連續(xù)造模給藥12 周。

2.4 Morris 水迷宮測試

水迷宮實(shí)驗(yàn)的前1～4 d 為定位航行測試，第5 天為空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行測試：將各組小鼠從水池4 個(gè)象限放入水中，記錄60 s 內(nèi)小鼠從入水至達(dá)平臺(tái)并停留超過3 s 所需時(shí)間（即逃避潛伏期），測試4 d，觀察各組小鼠逃避潛伏期時(shí)間變化?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：Morris 水迷宮測試第5 天，移除平臺(tái)后，將小鼠從原平臺(tái)對(duì)側(cè)象限放入水中，記錄小鼠60 s 內(nèi)的活動(dòng)軌跡，并分析數(shù)據(jù)。

2.5 小鼠海馬組織氧化抗氧化指標(biāo)檢測

水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，冰上迅速摘取小鼠海馬組織。取部分海馬組織加入生理鹽水勻漿、離心，收集勻漿上清液，BCA 法測定蛋白濃度后調(diào)整各樣本蛋白濃度至一致，嚴(yán)格按照說明書檢測小鼠海馬組織勻漿上清液中MDA 含量及SOD 活性。

2.6 蛋白免疫印跡法檢測海馬組織AKT/FOXO1/SOD相關(guān)蛋白表達(dá)

以細(xì)胞裂解液制備海馬組織勻漿，離心后收集上清液，并以BCA 法測定蛋白濃度。海馬組織上清液蛋白加熱變性后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），PVDF 膜轉(zhuǎn)印后，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h。一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，次日TBST 洗膜3 次，每次10 min。二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h 后，TBST 洗膜3 次，每次10 min。ECL 化學(xué)發(fā)光法顯影，ImageJ 軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 海龍中DHA 含量測定結(jié)果

取對(duì)照品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)、對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸處理，得DHA 回歸方程：Y=1 085.8X+4.799 9，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，線性范圍0.034～0.41 mg/ml；取供試品液，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定，并計(jì)得含量為7.761 3 mg/g（以生藥計(jì)），見圖1。

圖1 海龍HPLC 圖

3.2 小鼠Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與空白組相比，模型組小鼠在定位航行實(shí)驗(yàn)第4 天逃避潛伏期明顯延長（P＜0.01）；與模型組比較，海龍低劑量組、高劑量組小鼠逃避潛伏期均顯著縮短（P＜0.01），見圖2。

圖2 各組小鼠Morris 水迷宮逃避潛伏期比較(n=6， ±s )

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與空白組比較，模型組小鼠目標(biāo)象限游泳時(shí)間占比和游泳路程占比顯著降低；與模型組比較，海龍高劑量組穿臺(tái)次數(shù)顯著增加（P＜0.01）；海龍低劑量組、海龍高劑量組目標(biāo)象限游泳時(shí)間占比和游泳速度顯著提高（P＜0.01），見圖3。

圖3 各組小鼠Morris 水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(n=6， xˉ±s )

3.3 各組小鼠海馬組織MDA 含量及SOD 活力

與空白組相比，模型組海馬組織MDA 含量顯著升高，SOD 活力顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，海龍低劑量組、海龍高劑量組海馬組織MDA含量顯著降低（P＜0.01），SOD 活力顯著升高（P＜0.05,P＜0.01），且高劑量組小鼠海馬組織氧化損傷程度較低，見圖4。

圖4 各組小鼠海馬組織MDA 含量和SOD 活力(n=6， xˉ±s)

3.4 各組小鼠海馬組織AKT/FOXO1/SOD 蛋白表達(dá)

與空白組相比，模型組小鼠海馬組織p-AKT/AKT 比值、FOXO1、SOD2 蛋白表達(dá)降低；海龍給藥組可顯著上調(diào)D-gal 誘導(dǎo)記憶損傷小鼠海馬組織 中p-AKT、FOXO1、SOD2 蛋 白 表 達(dá)，激 活A(yù)KT/FOXO1/SOD2 通路（圖5A-C），改善學(xué)習(xí)記憶損傷小鼠海馬組織氧化損傷。

圖5 海龍對(duì)D-gal 損傷小鼠海馬組織AKT/FOXO1/SOD 通路的影響(n=3， xˉ±s)

4 討論

氧化應(yīng)激損傷與衰老密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激致機(jī)體衰老的主要機(jī)制是因過量的ROS 導(dǎo)致線粒體損傷、脂質(zhì)過氧化、抗氧化酶活力降低，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯甚至細(xì)胞凋亡[6-7]；同時(shí)自由基也會(huì)導(dǎo)致氧化損傷，并且自由基清除酶活力隨年齡增長而降低，進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷加劇[8-9]。海馬組織作為負(fù)責(zé)短時(shí)記憶儲(chǔ)存轉(zhuǎn)換與空間導(dǎo)航的器官[10]，與學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[11]，過量D-gal 可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激加劇，導(dǎo)致海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力降低。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)海龍給藥干預(yù)后，小鼠海馬組織MDA 含量顯著降低，SOD 活力顯著提高，學(xué)習(xí)記憶能力顯著提高。表明海龍可通過降低海馬組織氧化損傷改善D-gal 誘導(dǎo)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷。

PI3K/AKT/FOXO1 信號(hào)通路是經(jīng)典的抗氧化通路，能拮抗多種原因引起的氧化應(yīng)激。AKT 信號(hào)通過磷酸化活化激活下游mTOR、FOXOs 家族蛋白表達(dá)[12]，從而發(fā)揮抗氧化作用。FOXO1 作為PI3K/AKT 信號(hào)通路的重要作用底物，在細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1激活可以促進(jìn)其下游抗氧化蛋白SOD2、CAT 表達(dá)[13]。此外，F(xiàn)OXOs 轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的減少也增加了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的易感性[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，D-gal模型組小鼠海馬組織p-AKT/AKT 比值、FOXO1、SOD2 蛋白表達(dá)降低，海龍給藥組小鼠海馬組織p-AKT/AKT 比值、FOXO1、SOD2 蛋白表達(dá)顯著提高。表明海龍可通過激活A(yù)KT/FOXO1/ SOD2 信號(hào)通路改善小鼠海馬組織氧化損傷，進(jìn)而改善D-gal誘導(dǎo)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

海龍為海龍科硬骨魚類，富含多種脂肪酸、氨基酸、甾體類成分。研究發(fā)現(xiàn)[15-16]，魚類所含的不飽和脂肪酸類代表成分DHA 可促進(jìn)大腦神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)育，并通過激活Nrf2/HO-1 通路、FOXO3a/SOD通路，促進(jìn)抗氧化相關(guān)蛋白及基因表達(dá)，降低活性氧水平，從而減輕神經(jīng)元細(xì)胞氧化及炎癥損傷，改善記憶損傷。此外，DHA 可通過上調(diào)包括小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞AKT、Nrf2、HO-1 等氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)，提高抗氧化酶活性從而抑制細(xì)胞凋亡，間接防止神經(jīng)元細(xì)胞損傷[17-18]。本研究通過建立海龍HPLC 圖譜，發(fā)現(xiàn)DHA為海龍主要化學(xué)成分之一，約占總成分的47%，推測海龍改善小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷作用可能與其富含DHA 有關(guān)，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。