苯乙雙胍聯合己糖激酶抑制劑誘導三陰性乳腺癌細胞凋亡

葉琳嵐，賀春暉，朱旭婷，李 霞 （江南大學附屬醫(yī)院藥學部, 江蘇 無錫 214122）

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）臨床特點表現為轉移能力強、復發(fā)率高和患者預后差，是目前威脅女性健康常見的惡性腫瘤之一[1-3]。由于其細胞表面不表達孕酮受體、雌激素受體以及表皮生長因子受體，使得常規(guī)靶向療法對TNBC 收效甚微，目前臨床治療手段仍以傳統(tǒng)的化療為主。然而TNBC 除了不表達多種激素受體外，往往也伴隨著乳腺癌基因（breast cancer gene，BRCA）等多種基因的突變[4-6]，導致其成為一種高度異質性的腫瘤類型，易對化療藥物產生抗性，進一步增加了治療難度。

代謝旺盛的腫瘤細胞能量供應高度依賴有氧糖酵解產生的ATP，越來越多的研究表明，線粒體氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）對腫瘤細胞糖類、脂類及蛋白質類三大營養(yǎng)物質的相互轉化和氧化還原反應的平衡有著重要的作用[7-8]。在多種流行病學、臨床和實驗室研究中證實，糖代謝抑制劑、線粒體呼吸鏈阻滯劑等具有顯著的抗腫瘤作用[9]。因此，在正常細胞可承受范圍內，靶向破壞腫瘤細胞的糖代謝以及干擾呼吸鏈的電子傳遞，是目前腫瘤治療的新策略。

二甲雙胍以其良好的安全性和耐受性，在糖尿病臨床治療中被廣泛應用[10]。越來越多的研究表明，以二甲雙胍為代表的雙胍類藥物對多種腫瘤具有抑制作用[11-12]。苯乙雙胍是比二甲雙胍作用強50 倍的線粒體復合物I 抑制劑[13]。然而，苯乙雙胍作為一種抗腫瘤藥物卻難以獲得各國藥品管理部門的批準，主要原因是其副作用會產生大量的乳酸，易引起嚴重的乳酸性酸血癥[14-16]。因此，聯用其他輔助藥物以降低苯乙雙胍的使用劑量，在可控的不良反應內達到有效的抗腫瘤作用，是目前腫瘤臨床治療研究的新策略。

筆者將以腫瘤細胞能量代謝為突破點，研究低劑量的苯乙雙胍聯合己糖激酶抑制劑2-DG 對TNBC的治療作用，為將來針對TNBC 的耐藥和復發(fā)而進行的臨床治療提供新的策略。

1 材料

1.1 實驗動物及細胞

40 只SPF 級雌性6 周齡BALB/c 小鼠，體質量（20±2）g，購自浙江省實驗動物中心，許可證號：SCXK（浙）2016-0002。小鼠三陰性乳腺癌細胞系4T1 和人三陰性乳腺癌細胞系MBA-MD-231（中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心）。

1.2 實驗試劑

苯乙雙胍（Selleck 公司）；2-脫氧葡萄糖（Sigma公司）；RNA 反轉錄試劑盒（ABI 公司）；FITCannexin Ⅴ/PI 凋亡染色試劑盒（BD 公司）；葡萄糖含量檢測試劑盒、乳酸含量（LA）檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；海馬細胞線粒體壓力檢測試劑盒（Agilent 公司）。

2 方法

2.1 細胞分組及藥物處理

分別將1×105個4T1 或MDA-MB-231 細胞接種到6 孔板中，每組設3 個復孔。實驗分為空白對照組、苯乙雙胍（100 μmol/L）組、2-DG（2 mmol/L）組和聯用組（苯乙雙胍：10 μmol/L；2-DG：200 μmol/L）。作用48 h 后，用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，獲得單細胞懸液，用于后續(xù)的細胞增殖和凋亡檢測。

2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡

藥物處理細胞48 h 后，收集各組細胞懸液，4℃ 500×g離心5 min。棄上清液，每管加入1 ml冷PBS 重懸細胞，離心后棄上清液，清洗細胞。加入100 μl 1×偶聯緩沖液重懸細胞，然后每管分別加入2 μl annexin Ⅴ和PI，4℃避光孵育30 min。加入400 μl PBS 重懸細胞，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡的情況。

2.3 葡萄糖和乳酸濃度的測定

各組細胞處理48 h 后，收集細胞培養(yǎng)上清液，分別用葡萄糖含量檢測試劑盒和乳酸含量檢測試劑盒測定葡萄糖和乳酸濃度，同時收集細胞并計數。

2.4 線粒體耗氧量（OCR）的測定

用海馬細胞線粒體壓力檢測試劑盒測定4T1或MDA-MB-231 細胞的線粒體OCR。細胞用藥物預處理24 h，在評估前8 h，以6×105個細胞/孔的最佳培養(yǎng)密度將細胞轉移到XF 微板上，使細胞貼壁。用調節(jié)好pH 7.4 的培養(yǎng)基對細胞進行清洗，在無CO2培養(yǎng)箱中平衡1 h。ABC 孔分別加入寡霉素、線粒體解偶聯劑（FCCP）、魚藤酮和抗霉素A 后，上機檢測。

2.5 動物實驗的分組及處理

分為空白（PBS）組、苯乙雙胍（1 mg/kg）組、2-DG（5 mg/kg）組和聯用組（苯乙雙胍：0.1 mg/kg；2-DG：0.5 mg/kg），每組10 只小鼠。1×105個 4T1 細胞原位接種到BALB/c 小鼠乳腺脂肪墊內，待腫瘤生長至5 mm×5 mm 左右時，荷瘤小鼠開始給藥治療，并每天測量腫瘤的大小。各給藥組小鼠按50 μl體積瘤內注射給予，對照組給予等體積的PBS，每2 d 給藥1 次。連續(xù)給藥10 次后，觀察荷瘤小鼠的腫瘤大小并記錄各組小鼠的死亡時間。

3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗數據用(±s)表示，兩組間比較用t檢驗，多組的組間比較采用單因素方差分析，動物生存時間比較采用Kaplan-Meier 法。

4 結果

4.1 苯乙雙胍下調4T1 或MDA-MB-231 細胞線粒體OCR

為檢測苯乙雙胍對線粒體呼吸的影響，將100 μmol/L 苯乙雙胍分別作用于4T1 和MDAMB-231 細胞，24 h 后收獲細胞，海馬生物能量分析儀檢測細胞OCR 水平。結果表明，苯乙雙胍孵育24 h 后，MDA-MB-231 或4T1 細胞線粒體OCR 與空白組相比顯著降低（圖1）。

圖1 苯乙雙胍對三陰性乳腺癌細胞OCR 的影響

4.2 苯乙雙胍對4T1 或MDA-MB-231 細胞有氧糖酵解的影響

100 μmol/L 苯乙雙胍處理4T1 和MDA-MB-231 細胞48 h 后，檢測細胞上清液中己糖激酶表達量、葡萄糖以及乳酸濃度。結果顯示，4T1 和MDA-MB-231 細胞上清液中己糖激酶表達量，苯乙雙胍給藥組（4.6±0.17，3.73±0.21，n=3）明顯高于空白組（1±0.15，1±0.12,n=3），組間有顯著性差異（P＜0. 001），表明苯乙雙胍可在基因水平顯著上調己糖激酶的表達（圖2A）；4T1 和MDA-MB-231 細胞上清中葡萄糖消耗量，苯乙雙胍給藥組（356±31，397±42，n=3）μg/105個 細 胞 明 顯 高 于 空 白 組（289±25，301±32，n=3）μg/105細胞，組間有顯著性差異（P＜ 0. 05），表明苯乙雙胍能促進細胞攝取更多的葡萄糖，致使培養(yǎng)基中葡萄糖含量顯著增加（圖2B）；4T1 和MDA-MB-231 細胞上清中乳酸濃度，苯乙雙胍給藥組（5.59±0.52, 7.83±0.78,n=3）μmol/L明顯高于空白組（2.37±0.18，4.01±0.45，n=3）μmol/L，組間有顯著性差異（P＜ 0.01），表明苯乙雙胍能顯著促進培養(yǎng)上清液中乳酸的產生（圖2C）。

圖2 苯乙雙胍對MDA-MB-231 和4T1 細胞有氧糖酵解的影響 (`±s, n = 3)

4.3 苯乙雙胍聯合2-DG 誘導三陰性乳腺癌細胞凋亡

由于苯乙雙胍可上調4T1 和MDA-MB-231 細胞的有氧糖酵解，因此當我們聯用低劑量的己糖激酶抑制劑2-DG 時，三陰性乳腺癌細胞會發(fā)生什么變化呢？結果顯示，與空白組相比，單用苯乙雙胍或2-DG 均能顯著降低4T1 與MDA-MB-231 細胞存活率（P＜0.01）（表1，圖3）；與苯乙雙胍或2-DG單藥組相比，苯乙雙胍聯用2-DG，即使降低90%劑量，仍然可以顯著降低4T1 與MDA-MB-231 細胞的存活率（P＜0.001）（表1，圖3），以上結果表明，苯乙雙胍聯用2-DG 能顯著促進三陰性乳腺癌細胞的凋亡。與此同時，檢測細胞上清液中的乳酸含量，相比苯乙雙胍組（5.59±0.52，7.83±0.78，n=3）μmol/L，苯 乙 雙 胍 與2-DG 聯 用 組（3.46±0.37，5.18±0.62，n=3）μmol/L 細胞的乳酸產量也大幅下降（P＜ 0.01）（圖4）。

圖4 苯乙雙胍聯合2-DG 分別對MDA-MB-231 和4T1 細胞乳酸產生的影響(±s, n=3)

表1 苯乙雙胍聯合2-DG 對三陰性乳腺癌細胞凋亡的影響[`±s, n = 3，存活率(%)]

表1 苯乙雙胍聯合2-DG 對三陰性乳腺癌細胞凋亡的影響[`±s, n = 3，存活率(%)]

*P＜0. 05，**P＜0.01，***P＜0.001，與空白組比較

組別 4T1 MDA-MB-231空白組（PBS） 96.37±2.31 97.63±1.46苯乙雙胍組（100 μmol/L） 86.70±1.83 * 85.53±1.46 **2-DG（2 mmol/L） 81.27±2.16** 80.67±4.07**苯乙雙胍+2-DG組(苯乙雙胍:10 μmol/L，2-DG: 200 μmol/L) 64.63±2.28*** 51.97±2.29***

圖3 苯乙雙胍聯合2-DG 對三陰性乳腺癌細胞凋亡的影響 (`±s, n=3)

4.4 苯乙雙胍聯用2-DG 顯著抑制4T1 腫瘤的生長

為了進一步驗證苯乙雙胍聯合2-DG 在體內抗腫瘤的效果，我們將4T1 細胞原位接種到小鼠乳腺脂肪墊中，并分別給予單藥治療或聯合治療，觀察腫瘤的生長速度以及荷瘤小鼠的生存時間。結果顯示，與苯乙雙胍或2-DG 單藥組相比，苯乙雙胍聯合2-DG 組可顯著抑制荷瘤小鼠體內腫瘤的生長速度（P＜0.01）（圖5A）。此外，苯乙雙胍聯合2-DG 組荷瘤小鼠中位生存時間為72.5 d，高于苯乙雙胍組（57 d）、2-DG 組（55.5 d）、空白組組（50.5 d），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（圖5B），表明苯乙雙胍聯合2-DG 可以延長荷瘤小鼠生存時間。

圖5 苯乙雙胍聯合2-DG 對4T1 細胞造模小鼠腫瘤體積和生存時間的影響(`±s, n=10)

5 討論

二甲雙胍等雙胍類糖尿病治療藥物，能夠通過抑制線粒體復合物I 來降低細胞內ATP 水平。線粒體復合物I 的損傷會降低NADH 氧化為NAD+，這是維持TCA 循環(huán)功能的關鍵反應，并最終導致抑制氧化磷酸化。前期研究表明，二甲雙胍表現出顯著的抗腫瘤作用。苯乙雙胍與二甲雙胍具有非常相似的代謝特征，而苯乙雙胍的效力更強[17-18]。由于乳酸性酸中毒病死率高，2 型糖尿病臨床治療不再使用苯乙雙胍作為一線藥物[19]。 然而作為一種抗癌藥物，因其較低的有效劑量和較短的療程，與糖尿病臨床治療大有不同，苯乙雙胍被認為最有希望替代二甲雙胍的雙胍類藥物[20-22]。

本研究采用小鼠三陰性乳腺癌細胞系4T1 和人三陰性乳腺癌細胞系MBA-MD-231 作為研究對象，發(fā)現苯乙雙胍可顯著抑制其線粒體氧化磷酸化，并上調腫瘤細胞的糖酵解。當加入己糖激酶抑制劑2-DG 時，糖酵解途徑被阻斷，腫瘤細胞被迫使用氧化磷酸化來獲取ATP，在此情況下，細胞對苯乙雙胍更加敏感。基于該項發(fā)現，采用苯乙雙胍聯用2-DG 治療三陰性乳腺癌細胞。動物體內外結果表明，苯乙雙胍聯用2-DG 可顯著增加4T1 細胞和MBA-MD-231 細胞的死亡率，并延長荷瘤小鼠的生存時間。除了對這兩種糖代謝方式雙重抑制作用外，聯用2-DG 帶來的另一個優(yōu)勢是可大大降低苯乙雙胍的使用劑量，從而減輕苯乙雙胍代謝產生的乳酸對機體的不良作用。

綜上所述，通過苯乙雙胍聯用2-DG，可顯著增強苯乙雙胍對三陰性乳腺癌的凋亡作用，并降低其使用劑量，減輕不良反應，這一發(fā)現為三陰性乳腺癌的臨床治療提供新的策略。