菸花苷對缺血性腦卒中大鼠的長期保護作用

嚴嘯東，王業(yè)晴，李炳鋒，郭美麗 （海軍軍醫(yī)大學藥學系, 上海200433）

腦卒中是危害人類健康的主要疾病之一。根據(jù)國家衛(wèi)健委最新頒布的《中國腦卒中防治指導(dǎo)規(guī)范（2021 年版）》顯示：腦卒中已成為我國居民第一大死因。缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，占我國腦卒中的69.6%～70.8%。我國住院急性缺血性腦卒中患者發(fā)病后1 個月內(nèi)病死率為2.3%～3.2%，發(fā)病后1 年內(nèi)病死率為14.4%～15.4%，死亡/殘疾率為33.4%～33.8%[1]，缺血性腦卒中的致死率和致殘率相當高。對于缺血性腦卒中的治療，我們熟知的靜脈溶栓、抗血小板、抗凝、降纖、擴容等方法，都是旨在改善腦血液循環(huán)，并非針對腦神經(jīng)細胞的保護[2]。目前針對神經(jīng)保護的藥物較少，且療效與安全性尚未被臨床廣泛接受。美國心臟病協(xié)會/美國卒中協(xié)會發(fā)布的《2019 年急性缺血性卒中患者早期管理指南》中表示：目前沒有任何假定具有神經(jīng)保護作用的藥物或非藥物治療能夠證明改善缺血性腦卒中的預(yù)后[3]。國內(nèi)最新腦卒中診治指南也認為神經(jīng)保護劑的療效與安全性尚需要更多高質(zhì)量臨床試驗來進一步證實[1]。目前的神經(jīng)保護藥物尚不能解決腦卒中患者遺留神經(jīng)功能障礙的問題。

菸花苷是課題組從傳統(tǒng)活血化瘀中藥紅花中研發(fā)的治療急性腦缺血性腦卒中的中藥1 類新藥，化學結(jié)構(gòu)式如圖1。課題組前期的研究表明，菸花苷對于動物缺血性腦卒中急性期具有預(yù)防和治療作用[4]，但是，菸花苷對腦缺血的長期治療效果尚未見報道，其抗腦缺血作用機制的研究也有待進一步深入。本實驗通過觀察菸花苷對于大鼠長期生存率、神經(jīng)系統(tǒng)功能、體重及腦神經(jīng)元的影響，進一步探討菸花苷對缺血性腦卒中的長期治療效果及可能的作用機制。

圖1 菸花苷的化學結(jié)構(gòu)

1 實驗材料

1.1 動物

SPF 級健康雄性Wistar 大鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，體重（250±20）g，手術(shù)開始前于清潔級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，自由進食、飲水，溫度（25±2） ℃，相對濕度40%～60%，人工照明模擬晝夜變化。實驗過程中，嚴格遵循動物倫理原則，遵守動物福利、動物保護的相關(guān)規(guī)定。

1.2 藥物

菸花苷注射液（菸花苷含量為10 mg/ml）及菸花苷注射液空白制劑，均由蘇中藥業(yè)集團股份有限公司提供。

1.3 試劑

通用型組織固定液（上海博光生物科技有限公司）；氯化鈉注射液（辰欣藥液股份有限公司）；尼氏染色液、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒（上海博谷生物科技有限公司）；水合氯醛、氯化鈉、無水乙醇、二甲苯（AR 級）（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.4 器械與設(shè)備

手術(shù)器械（上海醫(yī)療器械有限公司）；線栓（平頂山豫順生物科技有限公司）；蠕動泵（上海之信儀器有限公司）；Direct-Pure RO（上海迪發(fā)儀器儀表有限公司）；熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；EG1160一體式石蠟包埋機、ASP200S 全自動脫水機、RM2235 切片機、HI1210 水浴攤片機、HI1220 烘片機（德國Leica 公司）。

2 實驗方法

2.1 腦缺血損傷模型

2.1.1 分組及給藥

取健康雄性Wistar 大鼠，體重（250±20）g，分為假手術(shù)組、模型組、菸花苷組。其中假手術(shù)組大鼠10 只，模型組和菸花苷組各20 只。菸花苷組在手術(shù)當天缺血后1 h，以10 mg/kg 的劑量尾靜脈注射給藥，手術(shù)后第2～7 天，每天給藥1 次，此后每隔日給藥1 次。模型組以相同的給藥方法給予相同體積的菸花苷注射液空白制劑。

2.1.2 缺血性腦卒中模型的造模

選用MCAO 法進行缺血性腦卒中模型的造模，參考相關(guān)文獻中的MCAO 的方法[5-7]，并結(jié)合本實驗室改進措施，最終選用如下方式進行操作：術(shù)前將大鼠禁食8 h，按大鼠體重以350 mg/kg 的劑量，用10%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上。沿頸部正中線切開皮膚，鈍性分離腺體、筋膜及其他皮下組織，分離并暴露左側(cè)頸總動脈（CCA），繼而分離頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA）。用細線結(jié)扎CCA 近心端及ECA 基部。動脈夾暫時夾閉ICA，用顯微剪沿CCA 近心端斜向上45°剪一小口，將直徑約0.26 mm 的線栓小心插入CCA 血管腔中，用提前布于CCA 下方的細線微微固定（結(jié)扎過緊會造成進線困難，太松則易造成出血），在血管放松的前提下，向前輕推最終沿著ICA 插入顱內(nèi)，插入深度距ECA 與ICA 分叉處大約18 mm。缺血2 h 后將線栓輕輕拉出，造成再灌注損傷，此時注意拔栓速度不宜過快以免造成血管痙攣，隨后扎緊CCA 遠心端，縫合傷口。術(shù)后置大鼠于俯臥位，且稍稍抬高大鼠頸部。整個手術(shù)過程中室溫維持在25 ℃左右，并用保暖燈及電熱毯保持大鼠體溫恒定在37 ℃左右。假手術(shù)組大鼠分離暴露血管，并不插入線栓，也不結(jié)扎任何血管。術(shù)后待大鼠清醒后，放置單籠飼養(yǎng)觀察。

2.2 行為學觀察

從手術(shù)后第1 天開始，由不參與整個實驗的研究者觀察手術(shù)后各組大鼠在第1、2、3、5、7、10、15、20、25、30 天的行為學表現(xiàn)，評分并記錄。每只大鼠的行為學檢查在3～5 min 內(nèi)完成。行為學評分參照文獻中的經(jīng)典評分方法[8-10]，具體如下：

（1）輕輕將大鼠的尾部提起，至地面的垂直距離約0.5 m 高，觀察前肢情況，是否有內(nèi)收或者內(nèi)旋現(xiàn)象。正常實驗鼠的兩前肢平衡對稱，向下向前伸出。根據(jù)嚴重程度評分，最嚴重者為4 分，正常為0 分。

（2）將大鼠放于平穩(wěn)的地板上，推左肩向?qū)?cè)移動，再推右肩向?qū)?cè)移動，觀察大鼠抗推動的能力。正常大鼠左右兩側(cè)的抗推動能力相當，若大鼠左側(cè)抗推動能力下降，最嚴重為3 分，正常為0 分。

（3）將大鼠的左右前肢輕輕放于較大的金屬網(wǎng)上，觀察左右前肢抓金屬網(wǎng)的肌肉張力。正常大鼠的左右前肢抓金屬網(wǎng)的力量明顯且對稱。若大鼠左前肢張力下降，最嚴重為3 分，正常為0 分。

每只受試的大鼠，根據(jù)以上標準打分并累加，滿分為10 分。

2.3 體重觀察

手術(shù)前記錄各組大鼠體重作為起始體重。手術(shù)后，在每天的相同時段（相差不超過1h），將各組大鼠放于體重計上，待示數(shù)穩(wěn)定5 s 后，立刻記下體重數(shù)。由不參與整個實驗的研究者記錄手術(shù)后菸花苷組與模型組在第1、2、3、5、7、10、15、20、25、30 天的體重。每只大鼠的體重記錄在1～3 min 內(nèi)完成。

2.4 灌流取材固定

手術(shù)30 d 后，按大鼠體重以350 mg/kg 的劑量，用10%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。迅速打開胸腔，暴露心臟，用針頭從心尖部位插入左心室，剪開右心耳，針頭另一端連接生理鹽水，打開灌流泵，使生理鹽水通過血液循環(huán)將血液排出。待灌入150 ml 左右生理鹽水，且流出的液體幾乎為無色時，立刻將灌注液改為通用型組織固定液（4%多聚甲醛），此時注意速度為先快后慢。灌流時若大鼠全身不停抽動則代表4%多聚甲醛已進入全身循環(huán)，待灌入150 ml 左右固定液即可停止。將腦完整取出，在4%多聚甲醛中固定48 h。

2.5 腦組織病理切片觀察

2.5.1 石蠟切片

用ASP200S 全自動脫水機進行脫水處理，再用EG1160 一體式石蠟包埋機進行包埋。臨用前，切取3～5 mm 厚的石蠟切片附于載玻片上，用新鮮的二甲苯脫蠟2 次，每次10 min。隨后依次放入無水乙醇5 min；放入90%乙醇、70%乙醇、蒸餾水各2 min。

2.5.2 尼氏染色

將上述脫蠟后的石蠟切片參照試劑盒說明書進行如下操作：在37 ℃的烘箱中，用尼氏染色液染色7 min。隨后，用蒸餾水洗滌 2 次，每次5 s，再用95%乙醇洗滌5 s，至此完成尼氏染色。

2.5.3 HE 染色

將脫蠟后的石蠟切片參照試劑盒說明書進行如下操作：用蘇木素染色液染色6 min。浸于足夠的蒸餾水中沖去多余的染色液，這個過程大約持續(xù)10 min，再放于新鮮的蒸餾水內(nèi)數(shù)秒鐘潤洗一遍。然后，用1%鹽酸酒精溶液分化數(shù)秒（一般不超過5 s）。蒸餾水洗滌5 min 后，Scott 液返藍處理50 s，蒸餾水再次洗滌3 min，進入伊紅染色液中染色8 min，至此完成HE 染色。

2.5.4 脫水、透明、封片

將上述過程中的尼氏染色、HE 染色的切片分別用70%乙醇洗滌后，用95%乙醇脫水3 次，每次3 min。入二甲苯透明5 min，共計2 次。中性樹膠封片。

2.6 統(tǒng)計分析

利用軟件SPSS 18.0 進行統(tǒng)計學分析，所得計量數(shù)據(jù)以（±s）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用Studentt檢驗；生存資料以生存曲線表示，采用Log-rank(Mantel-Cox)檢驗。P＜0.05 具有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 菸花苷對缺血性腦卒中大鼠長期生存率的影響

觀察30 d 內(nèi)腦缺血損傷后大鼠的生存情況，發(fā)現(xiàn)手術(shù)后，模型組和菸花苷組大鼠均出現(xiàn)不同程度的死亡情況。菸花苷組大鼠于第8 天開始，存活的數(shù)目趨于穩(wěn)定，模型組于第16 天開始，無新增的死亡大鼠。截止到第30 天觀察結(jié)束時，假手術(shù)組生存率為100%，模型組生存率為30.4%，菸花苷組生存率為70%，較之模型組，菸花苷組的生存率顯著升高（P＜0.05），結(jié)果見圖2。

圖2 菸花苷對缺血性腦卒中大鼠長期生存率的影響

3.2 菸花苷對缺血性腦卒中大鼠30 d 內(nèi)行為學及體重的影響

由圖3A 可知，在手術(shù)后的各個觀察時間點，假手術(shù)組的行為學評分均為0，一直未出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷的體征。與模型組相比，菸花苷組在測評的各個時間點神經(jīng)功能損傷較輕，具有顯著的統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且整個觀察過程中，菸花苷組大鼠的行為學得分不斷降低，神經(jīng)功能趨向好轉(zhuǎn)。

由圖3B 可知，在體重變化方面，手術(shù)后，假手術(shù)組大鼠體重一直保持持續(xù)增長狀態(tài)。術(shù)后第1 天，模型組與菸花苷組大鼠的體重有不同程度的下降，菸花苷組大鼠在術(shù)后第3 天開始恢復(fù)體重增長狀態(tài)，模型組從術(shù)后第10 天開始恢復(fù)體重增長狀態(tài)。在初始體重差別不大的情況下，較之模型組，菸花苷組在術(shù)后各個時間點觀察得到的體重數(shù)值均明顯高于模型組大鼠的體重數(shù)值（P＜0.01）。

圖3 菸花苷對缺血性腦卒中大鼠30 d 內(nèi)行為學及體重的影響

3.3 菸花苷對缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)元的影響

由圖4A 可知，假手術(shù)組皮層和海馬區(qū)的細胞大小均一，結(jié)構(gòu)清晰，胞漿豐富，核質(zhì)比例適中，CA1 區(qū)的錐體細胞和DG 區(qū)的顆粒細胞排列整齊緊密，CA3 區(qū)錐體細胞體積較之CA1 區(qū)的略大，排列稍松散但整齊。模型組的神經(jīng)元大小不一，胞質(zhì)不規(guī)則淡染，胞核皺縮變形，部分細胞脫失明顯，CA1 區(qū)錐體細胞和DG 區(qū)的顆粒細胞排列松散，CA3 區(qū)錐體細胞排列散亂，表明造模后神經(jīng)細胞受損嚴重。與模型組相比，菸花苷組的神經(jīng)元雖也出現(xiàn)了細胞淡染，大小不均，部分胞體腫脹，CA1 區(qū)及DG 區(qū)排列稍顯混亂，但整體的形態(tài)接近正常，病理損傷明顯減輕。

圖4 菸花苷對缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)元的影響(200X)

由圖4B 可知，假手術(shù)組皮層和海馬區(qū)的尼氏體大且多，“虎斑”也不在少數(shù)，呈深藍色，表明神經(jīng)元功能良好。模型組整體淡染，皮層的尼氏體大大減少，海馬區(qū)尼氏體極少，表明造模后神經(jīng)元功能受到損傷。與模型組相比，菸花苷組皮層尼氏體數(shù)目更多，個體更大，染色較均勻，海馬區(qū)尼氏體雖多為顆粒狀，個體稍小，但數(shù)目明顯增多，說明神經(jīng)元蛋白合成有所增加，較為活躍。

4 討論

正如“卒中治療學術(shù)產(chǎn)業(yè)圓桌會議”中對神經(jīng)保護藥物的研究所提出的那樣[11]：較為理想的神經(jīng)保護類藥物的實驗室階段研究，應(yīng)該在至少兩個不同實驗室中展開，運用在至少兩種動物身上，兼顧在永久缺血模型和短暫局灶性缺血模型，既要考察短期內(nèi)的組織和功能上的結(jié)果，也需要考察長期作用的影響。在本研究中，我們在前期證明菸花苷對急性永久性缺血模型和短暫局灶性缺血模型均具有良好的保護作用的基礎(chǔ)上[12-13]，通過建立大鼠腦缺血再灌注模型，從功能和組織層面證明了菸花苷對缺血性腦卒中的長期保護作用。

長期生存率是藥效結(jié)果最直觀的體現(xiàn)，體重可以反映出大鼠在發(fā)生缺血性腦卒中后整體的預(yù)后情況，而行為學的變化可以間接反應(yīng)出大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的功能。我們通過連續(xù)30 d 觀察實驗大鼠的生存率、行為學以及體重變化，發(fā)現(xiàn)造模后給予菸花苷顯著地提高了大鼠生存率，并能逐漸降低行為學得分，改善神經(jīng)功能，體重也在術(shù)后第3 天開始恢復(fù)增長狀態(tài)。這些結(jié)果表明菸花苷可以改善缺血性腦卒中的預(yù)后，促進神經(jīng)系統(tǒng)的遠期功能恢復(fù)。

海馬區(qū)是大腦中負責記憶與學習的重要區(qū)域，與認知功能密切相關(guān)，也是研究卒中后認知障礙等腦卒中并發(fā)癥的重點關(guān)注區(qū)域，其中CA1 區(qū)的神經(jīng)元對腦缺血缺氧較為敏感，容易受到損傷，而CA3 區(qū)及DG 區(qū)的神經(jīng)元則相對耐受[14]。尼氏體是神經(jīng)元胞體和樹突內(nèi)的嗜堿性顆?；蛐“邏K，由游離的核糖體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)構(gòu)成，對缺血變化非常敏銳[15]。病理組織學研究表明，菸花苷給藥后大鼠海馬區(qū)的尼氏體數(shù)目有所增加，蛋白合成更為活躍，腦組織恢復(fù)更好，整體趨向正常。提示菸花苷對神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)和功能具有長期保護作用。

綜上所述，菸花苷對缺血性腦卒中大鼠具有長期保護作用，可維持神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)功能處于相對良好的狀態(tài)，并能促進神經(jīng)系統(tǒng)遠期功能的恢復(fù)，可以作為一種潛在的神經(jīng)保護劑，其作用機制有待進一步研究。