杏鮑菇液體菌種的細(xì)胞固定化技術(shù)及其保藏條件研究

周婷婷，周榮翔，張 瑤，陳文才，李霽虹，馬桂珍

（1. 江蘇海洋大學(xué)，江蘇 連云港222005；2. 南京醫(yī)科大學(xué) 康達(dá)學(xué)院，江蘇 連云港 222000；3. 河北永清縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局種植業(yè)技術(shù)推廣站，河北 永清 065600）

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）屬側(cè)耳科側(cè)耳屬（Pleurotus）食用菌，營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)和脂肪含量高，富含多種植物維生素、礦物質(zhì)以及微量元素和寡糖，具有抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗腫瘤[1-6]等方面的作用，深受消費(fèi)者青睞。隨著杏鮑菇工廠化生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴(kuò)大[7]，生產(chǎn)上應(yīng)用液體菌種已成為一種趨勢(shì)[8]，液體菌種相較于傳統(tǒng)固體菌種，具有制作周期短、染菌風(fēng)險(xiǎn)低、萌發(fā)出菇快等優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用越來(lái)越廣泛[9-11]。液體菌種優(yōu)勢(shì)明顯，但也存在不足，生產(chǎn)出來(lái)的液體菌種保藏時(shí)間短，如馬立芝[12]研究認(rèn)為，杏鮑菇液體菌種室溫（16～20 ℃）條件下僅可保藏10 d。目前，有關(guān)杏鮑菇液體菌種的研究主要集中于液體菌種制備的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化[8，13-15]。有關(guān)延長(zhǎng)液體菌種保藏時(shí)間的研究也有報(bào)道，馬世玉等[16]和劉映淼等[17]通過將杏鮑菇液體菌種與固化基質(zhì)按不同比例混合，實(shí)現(xiàn)液體菌種的再固化，再固化后菌種的保藏時(shí)間分別達(dá)35 d 和30 d，這種再固化方法雖然延長(zhǎng)了液體菌種的保藏時(shí)間，但再固化菌種制備過程中菌絲球分散困難，菌絲球在基質(zhì)中分散不均，影響接種效果。液體菌種的固定化是將液體菌種包埋于固定化載體內(nèi)，此技術(shù)既可以延長(zhǎng)菌種保藏時(shí)間，也可以彌補(bǔ)再固化的不足。本試驗(yàn)通過篩選適合杏鮑菇液體菌種細(xì)胞固定化的載體種類，優(yōu)化固定化條件，建立液體菌種的細(xì)胞固定化技術(shù)，延長(zhǎng)液體菌種的保藏時(shí)間，為杏鮑菇液體菌種的普及和規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試菌種及培養(yǎng)基

杏鮑菇菌種由江蘇中翰食用菌有限公司提供。

杏鮑菇菌種活化培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。

杏鮑菇母種培養(yǎng)基[13]：馬鈴薯100 g，麥麩30 g，蔗糖27 g，蛋白胨1.40 g，KH2PO40.85 g，MgSO41 g，蒸餾水1 L（固體培養(yǎng)基添加20 g瓊脂）。

栽培培養(yǎng)基[18]：棉籽殼86 g，麥麩10 g，葡萄糖1 g，CaSO41 g，CaCO32 g，純水110 mL。

1.2 杏鮑菇液體菌種制備

取直徑為0.5 cm 活化的杏鮑菇菌種菌苔7 塊，接入含有80 mL 母種培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，25 ℃、180 r/min 培養(yǎng)6 d，以菌絲球達(dá)到4.5×105個(gè)/L為發(fā)酵終點(diǎn)，制得液體菌種。

1.3 杏鮑菇液體菌種固定化初始條件

制備質(zhì)量濃度為80 g/L 的固定化載體，滅菌后與等體積的杏鮑菇液體菌種混合，用無(wú)菌注射器緩慢滴入到20 g/L 的CaCl2溶液中，靜置4 h，棄去CaCl2溶液，用無(wú)菌水清洗3遍，得到固定化菌種。

1.4 杏鮑菇液體菌種固定化條件的優(yōu)化

1.4.1 處理設(shè)置 對(duì)杏鮑菇液體菌種固定化初始條件中固定化載體種類、2種載體混合配比、混合載體的質(zhì)量濃度、混合載體與液體菌種的體積比、CaCl2質(zhì)量濃度、交聯(lián)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，分別設(shè)定不同梯度，每個(gè)優(yōu)化條件均在前一個(gè)優(yōu)化條件基礎(chǔ)上進(jìn)行，每條件優(yōu)化重復(fù)3 次，每次制備約700 個(gè)固定化小球，通過觀察不同條件制備的固定化小球的成球狀態(tài)，測(cè)定機(jī)械強(qiáng)度、傳質(zhì)性和菌絲增長(zhǎng)率，選取最適的制備條件。

載體種類分別設(shè)置為80 g/L 海藻酸鈉（SA）、40 g/L SA+40 g/L 聚乙烯醇（PVA）、40 g/L SA+40 g/L CaCO3、40 g/L SA+40 g/L 硅藻土（DE）、40 g/L SA+40 g/L 活性炭（AC）；2 種載體混合配比設(shè)置為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1；混合載體質(zhì)量濃度設(shè)置為40、60、80、100、120 g/L，杏鮑菇液體菌種與混合載體體積比設(shè)置為3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3；CaCl2溶液質(zhì)量濃度設(shè)置為10、20、30、40、50 g/L，交聯(lián)時(shí)間設(shè)置為2、4、6、8、10 h。以上條件下分別制備固定化小球。

1.4.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.2.1 形態(tài)觀察及其劃分標(biāo)準(zhǔn) 能夠成球，且球體大小一致，形態(tài)規(guī)則，記為“+++”；可成球但形態(tài)不規(guī)則，記為“++”；可成球，形態(tài)不規(guī)則，且稍有拖尾現(xiàn)象，記為“+”；不成球，記為“-”。

1.4.2.2 機(jī)械強(qiáng)度的測(cè)定 隨機(jī)取4 顆粒徑大小一致的固定化菌種小球，在桌面上呈正方形擺放，小球上面放一個(gè)塑料平皿，緩慢加入粉末狀物質(zhì)，觀察固定化菌種小球的形態(tài)變化，至開始變形停止加入，記錄固定化菌種所能承受的最大質(zhì)量，以此表示固定化菌種的機(jī)械強(qiáng)度大小。

1.4.2.3 傳質(zhì)性的測(cè)定 選取不同條件下制備的大小均勻的固定化菌種小球20 顆，浸入20 mL 體積分?jǐn)?shù)為10%的惰性紅墨水溶液中，每隔5 min 取出固定化菌種進(jìn)行切片，在解剖鏡下觀察固定化菌種小球內(nèi)部顏色，記錄固定化菌種完全變紅色的時(shí)間，以此表示固定化菌種的傳質(zhì)性，時(shí)間越短說明傳質(zhì)性越快。

1.4.2.4 菌絲增長(zhǎng)率的測(cè)定 取不同條件下制備的固定化菌種小球30 顆，加入到裝有60 mL 母種培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，25 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)6 d，測(cè)量每個(gè)固定化菌種小球的直徑，每個(gè)固定化條件為1個(gè)處理，每處理接種3瓶，為3次重復(fù)，計(jì)算培養(yǎng)前后小球直徑比值，即菌絲增長(zhǎng)率。

1.5 杏鮑菇固定化菌種保藏穩(wěn)定性測(cè)定

將制備好的固定化菌種小球分裝于含有15 mL無(wú)菌水的離心管中，每管約600個(gè)固定化菌種小球，以加入等量的液體菌種為對(duì)照（CK），密封，分別置于20、4 ℃條件下保藏。另外，在裝有固定化小球的離心管中加入無(wú)菌液體石蠟15 mL，于-20 ℃保藏，分別在0、10、20、30 d 取樣，測(cè)定菌種成活率、菌絲萌發(fā)時(shí)間、菌絲生長(zhǎng)速度、呼吸強(qiáng)度和纖維素酶活性。

1.5.1 菌種成活率、菌絲萌發(fā)時(shí)間和菌絲生長(zhǎng)速度的測(cè)定 將保藏不同時(shí)間的固定化菌種及液體菌種接到PDA 平板上，接種20 個(gè)平板為20 個(gè)重復(fù)，25 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔1 h 觀察菌球是否萌發(fā)，有1 個(gè)平板萌發(fā)后，改為每0.5 h 觀測(cè)一次，記錄不同保藏條件下固定化菌種的萌發(fā)時(shí)間，培養(yǎng)7～10 d，觀察菌落狀態(tài)，計(jì)算成活率。觀察記錄菌絲體在平板上的直線生長(zhǎng)距離，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度。

1.5.2 呼吸強(qiáng)度的測(cè)定 分別稱取保藏不同時(shí)間的固定化菌種10 g，采用小籃子法[19]測(cè)定固定化菌種的呼吸強(qiáng)度，每個(gè)保藏時(shí)間為1個(gè)處理，每處理重復(fù)3次。

1.5.3 纖維素酶活性的測(cè)定 取保藏不同時(shí)間的固定化菌種10 g，分別接種于裝有50 g 栽培培養(yǎng)基的250 mL 三角燒瓶中，每個(gè)保藏時(shí)間為1 個(gè)處理，每個(gè)處理接種3 瓶，為3 次重復(fù)。25 ℃培養(yǎng)10 d，取培養(yǎng)物10 g，用5 倍水浸泡、搗碎，30 ℃浸提1 h，用4層紗布過濾后于3 000 r/min 離心10 min，取上清液，依據(jù)QB2583—2003 的方法分別測(cè)定固定化菌種的羧甲基纖維素酶（CMC）和濾紙酶（FPA）活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏鮑菇液體菌種固定化條件的優(yōu)化

2.1.1 固定化載體種類 由表1 可知，不同載體以及不同組合對(duì)杏鮑菇液體菌種的固定化性能有不同影響。40 g/L SA+40 g/L PVA 的菌絲增長(zhǎng)率最高，達(dá)185.3%；40 g/L SA+40 g/L CaCO3的成球狀態(tài)較好，機(jī)械強(qiáng)度較強(qiáng)，菌絲增長(zhǎng)率為138.4%；再者是80 g/L SA 和40 g/L SA+40 g/L DE，而40 g/L SA+40 g/L AC 不能形成小球。綜合成球狀態(tài)、機(jī)械強(qiáng)度、傳質(zhì)性、菌絲增長(zhǎng)率等不同指標(biāo)，選擇SA+PVA作為杏鮑菇液體菌種固定化的載體。

表1 不同固定化載體種類對(duì)杏鮑菇液體菌種固定化性能的影響Tab.1 Effects of different kinds of immobilized carriers on the performance of immobilized strain

2.1.2 固定化載體組合配比 由表2 可知，SA 與PVA 質(zhì)量比在1∶9～5∶5，隨著SA 比例的增加，固定化菌種成球狀態(tài)越來(lái)越好，質(zhì)量比為3∶7、4∶6、5∶5的成球狀態(tài)均為最佳狀態(tài)，傳質(zhì)性越來(lái)越慢，機(jī)械強(qiáng)度越來(lái)越大。菌絲增長(zhǎng)率隨著SA 比例的增加逐漸提高，比例為3∶7 時(shí)最高，達(dá)197.3%，隨著SA 比例繼續(xù)增加，菌絲增長(zhǎng)率開始下降。質(zhì)量比高于5∶5時(shí)不能形成小球。SA 濃度影響固定化菌種孔徑的大小，濃度過低導(dǎo)致顆粒內(nèi)的菌絲容易流失，而濃度過高則顆?？讖教。z增長(zhǎng)受到限制[20]。綜合分析成球狀態(tài)、機(jī)械強(qiáng)度、傳質(zhì)性及菌絲增長(zhǎng)率等不同指標(biāo)，選擇SA與PVA質(zhì)量比為3∶7作為杏鮑菇液體菌種固定化的載體組合配比。

表2 不同SA與PVA質(zhì)量比對(duì)杏鮑菇液體菌種固定化性能的影響Tab.2 Effects of different mass ratio of SA and PVA on the performance of immobilized strain

2.1.3 固定化載體質(zhì)量濃度 由表3 可知，固定化載體質(zhì)量濃度在40～100 g/L，隨著質(zhì)量濃度的增加，固定化菌種成球狀態(tài)越來(lái)越好，質(zhì)量濃度為80、100 g/L 成球狀態(tài)最佳；傳質(zhì)性越來(lái)越慢，機(jī)械強(qiáng)度越來(lái)越大。質(zhì)量濃度高于100 g/L時(shí)不能形成小球。菌絲增長(zhǎng)率隨著載體質(zhì)量濃度的增加逐漸提高，質(zhì)量濃度為80 g/L 時(shí)最高，達(dá)194.7%，質(zhì)量濃度繼續(xù)增加則菌絲增長(zhǎng)率逐漸下降。綜合分析成球狀態(tài)、機(jī)械強(qiáng)度、傳質(zhì)性及菌絲增長(zhǎng)率等不同指標(biāo)，選擇80 g/L作為杏鮑菇液體菌種固定化載體質(zhì)量濃度。

表3 不同固定化載體質(zhì)量濃度對(duì)杏鮑菇液體菌種固定化性能的影響Tab.3 Effects of different mass concentration of immobilized carrier on the performance of immobilized strain

2.1.4 液體菌種與固定化載體體積比 由表4 可見，杏鮑菇液體菌種與固定化載體體積比在3∶7、4∶6、5∶5時(shí)，固定化菌種均可形成形態(tài)規(guī)則的小球，傳質(zhì)性相同，隨著液體菌種比例增加，機(jī)械強(qiáng)度逐漸減弱，而菌絲增長(zhǎng)率逐漸增加，當(dāng)二者比例為5∶5時(shí)，菌絲增長(zhǎng)率最高，達(dá)196.1%。當(dāng)液體菌種所占比例大于50%時(shí)，固定化菌種結(jié)構(gòu)過于疏松，無(wú)法成球。這可能是因?yàn)橐后w菌種含量過高，阻礙了海藻酸鈉與Ca2+的交聯(lián)作用[21]。綜合分析成球狀態(tài)、機(jī)械強(qiáng)度、傳質(zhì)性及菌絲增長(zhǎng)率等不同指標(biāo)，選擇杏鮑菇液體菌種與固定化載體體積化為5∶5。

表4 不同液體菌種與固定化載體比例對(duì)杏鮑菇液體菌種固定化性能的影響Tab.4 Effects of different ratio of liquid strain and immobilized carrier on the performance of immobilized strain

2.1.5 CaCl2質(zhì)量濃度 由表5可見，CaCl2質(zhì)量濃度為20、30、40 g/L時(shí)，固定化菌種成球狀態(tài)最好，質(zhì)量濃度大于40 g/L 或小于20 g/L，固定化菌種的小球略有拖尾，成球狀態(tài)變差。隨著CaCl2質(zhì)量濃度的增加，固定化菌種傳質(zhì)性越來(lái)越慢，機(jī)械強(qiáng)度越來(lái)越強(qiáng)；CaCl2質(zhì)量濃度為20 g/L 時(shí)菌絲增長(zhǎng)率最高，達(dá)199.8%，CaCl2質(zhì)量濃度高于或低于20 g/L 菌絲增長(zhǎng)率下降。這可能是因?yàn)镃aCl2質(zhì)量濃度低于20 g/L時(shí)，交聯(lián)程度不夠，固定化菌種機(jī)械強(qiáng)度太小，菌絲容易從其中溢漏出來(lái)，CaCl2質(zhì)量濃度高于20 g/L時(shí)，固定化菌種交聯(lián)程度變強(qiáng)，導(dǎo)致其空隙減少，影響菌絲的傳質(zhì)[22]。綜合分析成球狀態(tài)、機(jī)械強(qiáng)度、傳質(zhì)性及菌絲增長(zhǎng)率等不同指標(biāo)，確定杏鮑菇液體菌種固定化時(shí)CaCl2質(zhì)量濃度為20 g/L。

表5 不同CaCl2質(zhì)量濃度對(duì)杏鮑菇液體菌種固定化性能的影響Tab.5 Effects of different mass concentration of CaCl2 on the performance of immobilized strain

2.1.6 交聯(lián)時(shí)間 不同交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化菌種的成球狀態(tài)無(wú)影響，對(duì)其他指標(biāo)有明顯的影響。隨著交聯(lián)時(shí)間的增加，傳質(zhì)性逐漸變慢，機(jī)械強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；菌絲增長(zhǎng)率呈先升后降趨勢(shì)，交聯(lián)時(shí)間6 h時(shí)，菌絲增長(zhǎng)率最高，達(dá)200.1%，交聯(lián)時(shí)間高于6 h菌絲增長(zhǎng)率下降。結(jié)果見表6。綜合分析成球狀態(tài)、機(jī)械強(qiáng)度、傳質(zhì)性及菌絲增長(zhǎng)率等不同指標(biāo)，選擇6 h作為杏鮑菇液體菌種固定化的交聯(lián)時(shí)間。

表6 不同交聯(lián)時(shí)間對(duì)杏鮑菇液體菌種固定化性能的影響Tab.6 Effects of different cross-linking time on the performance of immobilized strain

2.2 固定化菌種保藏穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

2.2.1 固定化菌種活力

2.2.1.1 成活率 隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照液體菌種的成活率逐漸下降，20 ℃保藏10 d 僅下降2 個(gè)百分點(diǎn)，保藏20 d 迅速下降至55%，至30 d 成活率僅為10%；4 ℃保藏至10 d 時(shí)，成活率未發(fā)生改變，20 d時(shí)成活率開始下降，為97%，保藏至30 d成活率降至88%。相同溫度下固定化菌種保藏30 d，成活率保持穩(wěn)定，仍為100%，結(jié)果見圖1a—b。-20 ℃保藏10 d，液體菌種對(duì)照和固定化菌種的成活率分別降至40%和50%，保藏至20 d，成活率均降至0，結(jié)果見圖1c。說明液體菌種固定化后保藏時(shí)間由10 d延長(zhǎng)到了30 d以上。

圖1 不同保藏溫度和時(shí)間對(duì)液體菌種與固定化菌種成活率的影響Fig.1 Effects of different storage temperature and time on the survival rate of liquid strain and immobilized strain

2.2.1.2 萌發(fā)時(shí)間 對(duì)照液體菌種保藏0 d 菌絲萌發(fā)時(shí)間均為15.0 h，隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，萌發(fā)時(shí)間均逐漸延長(zhǎng)。20 ℃保藏10、20、30 d，萌發(fā)時(shí)間分別為17.0、18.0、23.5 h，比保藏0 d分別延長(zhǎng)了2.0、3.0、8.5 h。4 ℃保藏相同時(shí)間，萌發(fā)時(shí)間分別為16.5、18.5、20.0 h，比保藏0 d 分別延長(zhǎng)了1.5、3.5、5.0 h。固定化菌種萌發(fā)時(shí)間穩(wěn)定，20 ℃保藏10 d，菌絲萌發(fā)時(shí)間仍為15.0 h，保藏30 d為16.0 h，比0 d僅延長(zhǎng)了1.0 h；4 ℃保藏10、20 d 菌絲萌發(fā)時(shí)間均為16.0 h，延長(zhǎng)0.5 h，保藏30 d延長(zhǎng)了1.0 h。說明液體菌種固定化后在4 ℃和20 ℃條件下保藏30 d 菌種的萌發(fā)時(shí)間變化較小。-20 ℃保藏10 d，對(duì)照液體菌種與固定化菌種菌絲萌發(fā)時(shí)間分別延長(zhǎng)了5.0 h和7.0 h，說明-20 ℃保藏對(duì)菌種的萌發(fā)時(shí)間影響較大，不利于菌種保藏，結(jié)果見圖2。

圖2 不同保藏溫度和時(shí)間對(duì)液體菌種與固定化菌種菌絲萌發(fā)時(shí)間的影響Fig.2 Effects of different storage temperature and time on the hyphae germination time of liquid strain and immobilized strain

2.2.1.3 生長(zhǎng)速度 隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照液體菌種的菌絲生長(zhǎng)速度逐漸變慢。20 ℃保藏10 d，菌絲生長(zhǎng)速度開始減少，為6.0 mm/d；保藏20 d，降低最快，為4.6 mm/d；保藏30 d，菌絲生長(zhǎng)速度降至3.6 mm/d。4 ℃保藏液體菌種10、20、30 d，菌絲生長(zhǎng)速度分別為6.0、5.6、4.8 mm/d。固定化菌種4、20 ℃保藏，菌絲生長(zhǎng)速度較穩(wěn)定，保藏30 d 與保藏0 d 的固定化菌種菌絲生長(zhǎng)速度無(wú)顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果見圖3a—b。-20 ℃保藏的液體菌種與固定化菌種的菌絲生長(zhǎng)速度迅速下降，保藏10 d，菌絲生長(zhǎng)速度分別降低了70.15%、72.73%，說明杏鮑菇菌種不能在-20 ℃條件下保藏。20、4 ℃溫度下，液體菌種固定化后保藏30 d 菌種的成活率、菌絲萌發(fā)時(shí)間及菌絲生長(zhǎng)速度等具有很好的穩(wěn)定性。

圖3 不同保藏溫度和時(shí)間對(duì)液體菌種與固定化菌種菌絲生長(zhǎng)速度的影響Fig.3 Effects of different storage temperature and time on the growth rate of liquid strain and immobilized strain

2.2.2 固定化菌種生理穩(wěn)定性

2.2.2.1 呼吸強(qiáng)度 如圖4 所示，固定化菌種的呼吸強(qiáng)度隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸減弱。4 ℃保藏10 d，固定化菌種呼吸強(qiáng)度迅速降低，從0 d 的0.088 mg/（g·h）降 至0.028 mg/（g·h）；保 藏20 d，20 ℃保藏的固定化菌種呼吸強(qiáng)度降低較快，從10 d的0.079 mg/（g·h）降至0.021 mg/（g·h）；保藏30 d時(shí)，20 ℃和4 ℃保藏固定化菌種的呼吸強(qiáng)度分別比保藏0 d 時(shí)降低78.65%和88.76%。-20 ℃保藏10 d的固定化菌種，呼吸強(qiáng)度比0 d時(shí)降低85.39%，僅為0.013 mg/（g·h）。結(jié)合2.2.1 可知，4、20 ℃溫度下保藏的固定化菌種具有穩(wěn)定的菌種活力，-20 ℃保藏的固定化菌種活力低。綜上所述，4 ℃和20 ℃保藏的固定化菌種呼吸強(qiáng)度降低，說明保藏期間菌絲生長(zhǎng)緩慢，有利于保持菌種活力，延長(zhǎng)菌種保藏時(shí)間[18]。

圖4 不同保藏溫度和時(shí)間對(duì)固定化菌種呼吸強(qiáng)度的影響Fig.4 Effects of different storage temperature and time on the respiration intensity of immobilized strain

2.2.2.2 FPA 活性 如圖5 所示，隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，20、4 ℃保藏固定化菌種的FPA 活性逐漸增高，20、4 ℃保藏30 d的固定化菌種FPA 活性比保藏0 d 分別高出8.10、8.86 U。這可能與固定化菌種從相對(duì)休眠狀態(tài)轉(zhuǎn)入富含纖維素成分的栽培培養(yǎng)基中FPA 被誘導(dǎo)形成有關(guān)。-20 ℃保藏10 d，F(xiàn)PA 活性由開始的28.01 U降至16.81 U。

圖5 不同保藏溫度和時(shí)間對(duì)固定化菌種FPA活性的影響Fig.5 Effects of different storage temperature and time on FPA activity of immobilized strain

食用菌分泌酶的量與食用菌生長(zhǎng)速度及子實(shí)體的形成和發(fā)育密切相關(guān)[23]，較高的纖維素酶活性有利于杏鮑菇分解基質(zhì)中的纖維素，促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)。綜上所述，4、20 ℃保藏的固定化菌種有利于維持杏鮑菇FPA活性。

2.2.2.3 CMC 活性 如圖6 所示，隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，20、4 ℃保藏的杏鮑菇固定化菌種CMC 活性先增強(qiáng)后衰弱，呈拋物線變化，在保藏10 d 時(shí)，兩者酶活性最高，分別為11.60、12.37 U。固定化菌種保藏30 d，20 ℃溫度下CMC 活性比保藏0 d 時(shí)高11.24%；4 ℃溫度下CMC 活性與保藏0 d 相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。-20 ℃保藏的固定化菌種CMC活性顯著降低，從0 d 的9.01 U 降至10 d 的5.23 U。說明4、20 ℃保藏的固定化菌種有利于維持杏鮑菇CMC活性。

圖6 不同保藏溫度和時(shí)間對(duì)固定化菌種CMC活性的影響Fig.6 Effects of different storage temperature and time on CMC activity of immobilized strain

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，杏鮑菇液體菌種的固定化最佳條件：海藻酸鈉與聚乙烯醇質(zhì)量比3∶7，固定化載體質(zhì)量濃度80 g/L，液體菌種與固定化載體溶液體積比5∶5，CaCl2質(zhì)量濃度20 g/L，交聯(lián)時(shí)間6 h。杏鮑菇液體固定化菌種在20 ℃和4 ℃環(huán)境下，保藏30 d，菌種的生長(zhǎng)特性和生理特性穩(wěn)定，液體菌種固定化能有效延長(zhǎng)杏鮑菇液體菌種的保藏期。杏鮑菇液體菌種固定化后在室溫（20 ℃）和4 ℃條件下保藏30 d，成活率均為100%，菌絲生長(zhǎng)速度不變，菌絲萌發(fā)時(shí)間分別為16.0、17.0 h，低于相應(yīng)對(duì)照液體菌種的23.5、20.0 h，明顯低于李鳳美等[24]用海藻酸鈣包埋法制備的固定化菌種的萌發(fā)時(shí)間72.0 h。優(yōu)化的固定化菌種的呼吸強(qiáng)度低于低溫保藏液體菌種和基質(zhì)固化的液體菌種[18]，其原因可能是固定化載體中營(yíng)養(yǎng)缺乏，菌絲生長(zhǎng)緩慢[12]。固定化菌種20 ℃條件下保藏30 d，F(xiàn)PA 與CMC 活性都高于保藏0 d的固定化菌種；4 ℃保藏30 d，F(xiàn)PA活性高于保藏0 d 的固定化菌種，CMC 活性與保藏0 d 的固定化菌種無(wú)顯著性差異，該結(jié)果與香菇斜面保藏菌種CMC活性趨勢(shì)相同[25]。說明20 ℃及4 ℃環(huán)境下，固定化菌種的纖維素酶活性保持相對(duì)穩(wěn)定。-20 ℃保藏的固定化菌種，至20 d時(shí)成活率已降到0，這可能與低溫下形成的冰晶結(jié)構(gòu)破壞了杏鮑菇菌絲，影響菌絲生長(zhǎng)和繁殖等有關(guān)[12]。

本研究結(jié)果有效延長(zhǎng)了杏鮑菇液體菌種的保藏時(shí)間，今后將進(jìn)一步系統(tǒng)研究杏鮑菇液體固定化菌種在生產(chǎn)上的應(yīng)用效果，開展出菇試驗(yàn)，為液體菌種的推廣普及提供技術(shù)支撐。