隔藥餅灸對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊兔RhoA/ROCK1/MMP-9信號(hào)通路的影響

馬逸杰，廖意娟，饒澤華，宋家薇，易麗貞，吳雪芬，劉欣，岳增輝

湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是臨床常見的以血管彈性下降甚至消失為特點(diǎn)的血管性疾病，通常由于脂質(zhì)沉積于血管內(nèi)壁形成斑塊所致。AS后期形成的斑塊可根據(jù)其是否具有破裂出血傾向分為穩(wěn)定斑塊和不穩(wěn)定斑塊，其中不穩(wěn)定斑塊又稱易損斑塊。易損斑塊通常具有薄的纖維帽、大的脂質(zhì)核心及大量炎癥相關(guān)細(xì)胞。當(dāng)斑塊膠原纖維含量下降導(dǎo)致纖維帽變薄時(shí)，斑塊的不穩(wěn)定性增加，易損斑塊形成。研究表明，AS的形成和發(fā)展與Ras同源物基因組成員A（RhoA）/Rho相關(guān)卷曲形成蛋白激酶（ROCK）信號(hào)通路及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）關(guān)系密切。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，隔藥餅灸在降低血脂、調(diào)節(jié)膽固醇、治療AS及穩(wěn)定易損斑塊方面具有明顯作用。因此，本研究通過檢測(cè)AS易損斑塊兔血脂水平，腹主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜形態(tài)和RhoA、ROCK1、MMP-9蛋白表達(dá)，以及膠原纖維含量，探討隔藥餅灸穩(wěn)定AS易損斑塊可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

雄性普通級(jí)新西蘭大耳白兔70只，體質(zhì)量（2±0.2）kg，湖南太平生物科技有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2020-0005。于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室單籠飼養(yǎng)，溫度18～24 ℃，濕度50%～70%，12 h明暗周期，自由飲水。實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處置嚴(yán)格遵照中華人民共和國2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（LL2019081905）。造模用高脂飼料（含1%膽固醇、10%蛋黃粉、5%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶、83.8%基礎(chǔ)飼料），湖南嘉泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.2 藥物及制備

丹參、山楂、郁金、澤瀉、大黃藥粉，購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。藥餅制作：每次灸前按等比例取各藥粉3～5 g，用陳醋調(diào)成糊狀，制成厚2～3 mm、直徑0.8～1.2 cm的藥餅。阿托伐他汀鈣片，美國輝瑞公司，批號(hào)1237304。Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾，上海源葉生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)S32087。艾炷，南陽昊翔藥業(yè)有限公司，貨號(hào)hx-0258，規(guī)格0.4 cm×0.8 cm。

1.3 主要試劑與儀器

Ad5-p53重組載體，深圳賽百諾，批號(hào)20130602；斑點(diǎn)蝰蛇毒，廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所制備；組胺，上海三杰生物，批號(hào)20110901；MMP-9、RhoA抗體，湖南艾方生物，貨號(hào)分別為AF300248、AF03289；ROCK1、羊抗兔IgG抗體，武漢賽維爾，貨號(hào)分別為GB11265、GB23303；DAB顯色劑、HE染液、天狼猩紅染液，武漢賽維爾，貨號(hào)分別為G1211、G1005、G1018。E100顯微鏡（日本Nikon公司），JB-P5石蠟包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司），RM2016病理切片機(jī)（德國徠卡儀器有限公司），Pannoramic DESK全景切片掃描儀（匈牙利3DHISTECH公司），D3024R型臺(tái)式高速冷凍微量離心機(jī)（北京大龍儀器）。

1.4 造模及分組

參照文獻(xiàn)[9]方法，采用高脂飼料喂養(yǎng)＋球囊損傷＋基因轉(zhuǎn)染＋藥物觸發(fā)的方式進(jìn)行造模。將70只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為空白組10只、手術(shù)組60只。手術(shù)組高脂飼料喂養(yǎng)2周后，行腹主動(dòng)脈球囊損傷術(shù)：20%烏拉坦耳緣靜脈注射（5 mL/kg）麻醉，肝素鈉200 U/kg抗凝，沿兔右側(cè)腹股溝下緣股動(dòng)脈搏動(dòng)處剔除毛發(fā)，切開皮膚及肌肉組織，將右股動(dòng)脈與其他組織及靜脈血管分離，將股動(dòng)脈下緣結(jié)扎，結(jié)扎上緣行穿刺術(shù)，逆行插入導(dǎo)引導(dǎo)絲約20 cm，再插入帶有球囊的導(dǎo)引導(dǎo)管，當(dāng)球囊導(dǎo)管完全插入血管后，撤出導(dǎo)引導(dǎo)絲，繼續(xù)插入球囊導(dǎo)管約20 cm，手推式球囊擴(kuò)張壓力泵注入生理鹽水，轉(zhuǎn)動(dòng)壓力泵使大氣壓保持在607.98～810.64 kPa，自近心端將球囊向外緩慢回拉，反復(fù)抽拉3次，以達(dá)到損傷腹主動(dòng)脈內(nèi)皮的目的。撤出導(dǎo)管，結(jié)扎右側(cè)股動(dòng)脈，逐層縫合肌肉、皮膚。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素（40萬U/d）防止感染。

手術(shù)過程5只兔死亡，存活55只，將存活兔隨機(jī)分為模型組、直接灸組、隔藥餅灸、西藥組和抑制劑組，每組11只。術(shù)后各組兔繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)并進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)，連續(xù)8周。

干預(yù)結(jié)束后，對(duì)除空白組外的所有實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染：20%烏拉坦耳緣靜脈注射（5 mL/kg）麻醉兔，剃除兔左側(cè)腹股溝下緣股動(dòng)脈搏動(dòng)處毛發(fā)，常規(guī)消毒，按球囊損傷的方法將球囊送入需轉(zhuǎn)染部位，用球囊注入滴度為1.0×10VP/mL的Ad5-p53重組載體20 μL，撤出球囊并結(jié)扎左側(cè)股動(dòng)脈，逐層縫合肌肉、皮膚。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素（40萬U/d）預(yù)防感染?；蜣D(zhuǎn)染時(shí)間為2周，同時(shí)改為普通飼料喂養(yǎng)。

分別于兔處死前48、24 h進(jìn)行2次藥物觸發(fā)，具體操作：腹腔注射斑點(diǎn)蝰蛇毒0.15 mg/kg，30 min后耳緣靜脈注射組胺0.02 mg/kg，以誘發(fā)斑塊破裂。

1.5 干預(yù)

參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》及擬人比照法取穴，第1組為“巨闕”、雙側(cè)“天樞”“豐隆”，第2組為雙側(cè)“心俞”“肝俞”“脾俞”。對(duì)兔取穴定位后剪毛，固定于兔臺(tái)，直接灸組將艾炷直接粘于穴位上（下有厚3 mm、直徑10 mm的紙質(zhì)墊盤），點(diǎn)燃施灸，每穴連續(xù)灸3壯（約30 min），每日1次，2組穴位隔日交替施灸；隔藥餅灸組將藥餅粘于穴位上，再將艾炷放置于藥餅上點(diǎn)燃施灸，其余操作同直接灸組；西藥組每日抓取固定30 min后，將阿托伐他汀鈣片研磨成粉，按1.96 mg/（kg·d）拌入高脂飼料中喂食；抑制劑組每日抓取固定30 min后，經(jīng)耳緣靜脈分2次注射鹽酸法舒地爾10 mg/（kg·d），間隔3 h；空白組和模型組每日抓取固定30 min，不干預(yù)。連續(xù)8周。

1.6 取材

耳緣靜脈注射20%烏拉坦（5 mL/kg）麻醉兔，腹部正中切口，腹主動(dòng)脈采血2～3 mL，3 000 r/min離心15 min，吸取血清，置于-80 ℃冰箱保存。取主動(dòng)脈弓至髂總動(dòng)脈分叉處腹主動(dòng)脈組織，置于4%多聚甲醛中固定。

1.7 檢測(cè)指標(biāo)

1.7.1 ELISA檢測(cè)

取離心后血清，按ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量。

1.7.2 HE染色

將固定于4%多聚甲醛中的腹主動(dòng)脈組織取出，石蠟包埋，切片（厚度4 μm），常規(guī)HE染色，脫水后中性樹脂封片。顯微鏡下觀察腹主動(dòng)脈內(nèi)膜和中膜形態(tài)。

1.7.3 免疫組化染色

取腹主動(dòng)脈組織石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（pH 6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，加3%過氧化氫溶液室溫避光孵育25 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加3%BSA封閉1 h，滴加稀釋的RhoA（1∶100）、ROCK1（1∶100）、MMP-9（1∶50）一抗，4 ℃孵育過夜，滴加羊抗兔IgG二抗，室溫孵育50 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，脫水，封片，顯微鏡下觀察，以棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，采用Aipathwell圖像分析軟件計(jì)算陽性表達(dá)的平均光密度。

1.7.4 天狼猩紅染色

將腹主動(dòng)脈組織石蠟切片置于天狼猩紅染液中染色8～10 min，脫水，封片，顯微鏡下觀察膠原纖維分布情況，以紅色染色為膠原纖維陽性表達(dá)，采用Aipathwell圖像分析軟件計(jì)算膠原纖維面積，以膠原纖維面積占組織總面積百分比計(jì)算膠原纖維含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±表示，滿足正態(tài)分布多組間比較采用方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊用Tamhane’s T2檢驗(yàn)，不滿足正態(tài)分布用秩和檢驗(yàn)。＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

最終存活50只兔，其中空白組8只、模型組9只、直接灸組9只、隔藥餅灸組7只、西藥組9只、抑制劑組8只。

2.1 隔藥餅灸對(duì)模型兔血脂水平的影響

與空白組比較，模型組兔血清HDL-C含量顯著減少（＜0.01），LDL-C含量顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，直接灸組、隔藥餅灸組和西藥組兔血清HDL-C含量顯著增加（＜0.01，＜0.05），LDL-C含量顯著減少（＜0.01）。見圖1。

圖1 各組兔血清HDL-C和LDL-C含量比較（±s，每組7～9只）

2.2 隔藥餅灸對(duì)模型兔腹主動(dòng)脈病理變化的影響

空白組兔腹主動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜光滑完整，內(nèi)皮細(xì)胞排列緊密；模型組兔腹主動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)膜明顯增厚形成斑塊，表面粗糙，斑塊處有大量脂質(zhì)沉積及少量紅細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，內(nèi)膜、中膜界限模糊；各治療組腹主動(dòng)脈病理改變均有不同程度改善。見圖2。

圖2 各組兔腹主動(dòng)脈組織形態(tài)（HE染色，×200）

2.3 隔藥餅灸對(duì)模型兔腹主動(dòng)脈組織RhoA、ROCK1、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組兔腹主動(dòng)脈組織RhoA、ROCK1、MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，直接灸組、隔藥餅灸組、西藥組和抑制劑組兔腹主動(dòng)脈組織RhoA和ROCK1蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.01），隔藥餅灸組、西藥組和抑制劑組兔腹主動(dòng)脈組織MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.01）。見圖3～圖6。

圖3 各組兔腹主動(dòng)脈組織RhoA蛋白陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖4 各組兔腹主動(dòng)脈組織ROCK1蛋白陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖5 各組兔腹主動(dòng)脈組織MMP-9蛋白陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖6 各組兔腹主動(dòng)脈組織RhoA、ROCK1、MMP-9蛋白表達(dá)比較（±s，每組7～9只）

2.4 隔藥餅灸對(duì)模型兔腹主動(dòng)脈組織膠原纖維含量的影響

與空白組比較，模型組兔腹主動(dòng)脈組織膠原纖維含量顯著減少（＜0.01）；與模型組比較，直接灸組、隔藥餅灸組和西藥組兔腹主動(dòng)脈組織膠原纖維含量顯著增加（＜0.01，＜0.05），抑制劑組兔腹主動(dòng)脈組織膠原纖維含量呈增加趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義異（＞0.05）。見圖7、圖8。

圖7 各組兔腹主動(dòng)脈組織膠原纖維陽性表達(dá)（天狼猩紅染色，×100）

圖8 各組兔腹主動(dòng)脈組織膠原纖維含量比較（±s，每組7～9只）

3 討論

《素問?痹論篇》云：“脈痹不已，復(fù)感于邪，內(nèi)舍于心……所謂痹者，各以其時(shí)重感于風(fēng)寒濕之氣也……痹在于脈則血凝而不流?！盇S屬中醫(yī)學(xué)“脈痹”范疇，主要由痰瘀痹阻血脈而成，故以疏肝理氣通絡(luò)、益氣活血祛瘀為主要治法。艾灸主要有溫經(jīng)通絡(luò)、散寒驅(qū)邪等功效。藥餅由丹參、山楂、郁金、澤瀉和大黃組成，有活血祛瘀止痛、清心除煩、養(yǎng)血安神之功。現(xiàn)代研究表明，上述藥物有調(diào)節(jié)血脂的功效。本實(shí)驗(yàn)選擇“巨闕”“天樞”“豐隆”及“心俞”“肝俞”“脾俞”2組穴位交替進(jìn)行治療，其中“巨闕”“天樞”為心與大腸之募穴，“心俞”“肝俞”“脾俞”分別為其臟腑之背俞穴，“豐隆”為治痰之要穴。因此，選穴采取俞募配伍加治痰的方式以達(dá)血脈充盈、疏肝健脾、調(diào)理腸胃功效，進(jìn)而起到活血祛瘀、化痰調(diào)脂作用。

AS是眾多心血管疾病的病理基礎(chǔ)，其早期主要以血脂水平升高、脂質(zhì)在血管內(nèi)壁沉積為特點(diǎn)。HDL-C、LDL-C含量是反映機(jī)體脂質(zhì)代謝情況的重要指標(biāo)。HDL-C能將膽固醇從肝外組織轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟進(jìn)行代謝，降低血液膽固醇含量，抑制AS形成。LDL-C能將膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到肝外組織細(xì)胞，造成血液膽固醇含量增加，促進(jìn)AS形成與發(fā)展。既往研究發(fā)現(xiàn)，隔藥餅灸能有效降低AS兔血清HDL-C、LDL-C、三酰甘油及膽固醇含量。本研究結(jié)果表明，經(jīng)隔藥餅灸干預(yù)后，模型兔血清HDL-C含量顯著增加，LDL-C含量顯著減少，提示隔藥餅灸能有效調(diào)節(jié)AS兔血脂水平。

易損斑塊是在AS末期出現(xiàn)的不穩(wěn)定性斑塊，易損斑塊破裂將誘導(dǎo)血栓形成，導(dǎo)致血管堵塞，進(jìn)而引起急性心血管疾病。與穩(wěn)定斑塊相比，易損斑塊表面纖維帽更薄、脂質(zhì)核更大，易損斑塊附近炎性因子更多。當(dāng)斑塊中膠原纖維含量降低時(shí)，斑塊的纖維帽變薄，同時(shí)，斑塊不穩(wěn)定性增加形成易損斑塊。RhoA/ROCK信號(hào)通路與心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)損傷性疾病和腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展密切聯(lián)系。RhoA是Rho GTP酶的一個(gè)分支，其可以在活性GTP結(jié)合形式和非活性GDP結(jié)合形式之間循環(huán)。ROCK是RhoA下游靶蛋白之一，可分為ROCK1和ROCK2亞型，ROCK1在應(yīng)力纖維形成中起關(guān)鍵作用，ROCK2在吞噬和細(xì)胞收縮中起重要作用。MMP-9是一種鋅依賴性內(nèi)切蛋白酶，主要由內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等分泌產(chǎn)生，參與斑塊纖維帽中膠原纖維的降解，促進(jìn)穩(wěn)定斑塊向易損斑塊轉(zhuǎn)化，MMP-9的表達(dá)受RhoA/ROCK信號(hào)通路的調(diào)控，抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路則MMP-9表達(dá)降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)隔藥餅灸治療后，AS兔腹主動(dòng)脈組織RhoA、ROCK1、MMP-9蛋白表達(dá)均顯著降低，表明隔藥餅灸能抑制RhoA/ROCK1/MMP-9信號(hào)通路。當(dāng)MMP-9蛋白表達(dá)降低時(shí)，膠原纖維含量明顯增加，提示抑制MMP-9表達(dá)能通過減少膠原纖維降解起到穩(wěn)定斑塊的作用。抑制劑組MMP-9蛋白表達(dá)最低，但其膠原纖維含量較其他治療組并未體現(xiàn)升高趨勢(shì)，可能由于各治療組能通過多途徑對(duì)膠原纖維含量進(jìn)行調(diào)控，具體機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，隔藥餅灸可能通過抑制RhoA/ROCK1/MMP-9信號(hào)通路，增加膠原纖維含量，進(jìn)而增加纖維帽厚度，延緩AS發(fā)展，穩(wěn)定易損斑塊。