天麻芎苓止眩片對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠Atg8、LC3及p62表達(dá)的影響

邵樂(lè)，李蘇，雍蘇南

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球現(xiàn)有高血壓患者已超過(guò)10億，每年近200萬(wàn)人因血壓升高導(dǎo)致死亡。高血壓病已成為危及人類健康的首要疾病，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。已有研究表明，炎癥狀態(tài)下炎癥因子穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)改變，血管重塑明顯，從而引發(fā)高血壓。自噬與炎癥小體激活關(guān)系密切，可通過(guò)參與細(xì)胞器新陳代謝和能量產(chǎn)生，發(fā)揮調(diào)控炎癥作用。同時(shí)，自噬本身也是高血壓的病理因素之一，研究發(fā)現(xiàn)，在腎血管性高血壓模型中可見線粒體自噬增強(qiáng)，而使用纈沙坦干預(yù)可明顯抑制線粒體自噬，降低血壓，保護(hù)靶器官。天麻芎苓止眩片由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療高血壓經(jīng)驗(yàn)方復(fù)方七芍降壓片化裁而成。課題組前期研究表明，天麻芎苓止眩片降低血壓與減輕炎癥反應(yīng)、保護(hù)血管內(nèi)皮損傷、改善血管重塑、保護(hù)腎功能有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用天麻芎苓止眩片干預(yù)自發(fā)性高血壓大鼠，觀察其對(duì)大鼠血清炎癥因子白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-10含量和胸主動(dòng)脈組織Atg8、LC3、p62表達(dá)的影響，明確天麻芎苓止眩片治療高血壓的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用與后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性自發(fā)性高血壓大鼠30只，8周齡，體質(zhì)量180～200 g；雄性WKY大鼠10只，體質(zhì)量180～200 g，均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物及制備

天麻芎苓止眩片（天麻15 g，鉤藤15 g，野菊花12 g，川芎10 g，茯苓15 g，法半夏6 g，牡蠣6 g，地龍15 g，鉤藤10 g，羅布麻18 g，酸棗仁9 g，甘草6 g，香附10 g，丹參15 g），由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心制備，規(guī)格0.46 g/片，批號(hào)20200216，將藥物研磨成粉，加超純水溶解，配制成濃度為4.32 mg/mL藥液?？ㄍ衅绽匾凰帢I(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)20200518，規(guī)格25 mg/片，研磨成粉后加超純水溶解，配制成濃度為0.76 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

大鼠IL-1、IL-10 ELISA試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，批號(hào)分別為GR2020-06、GR2020-12），p62、LC3、Atg8一抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為AI48095842、CW88845705、EE74800668）。BP2010智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)，北京軟隆科技有限公司；PL-203電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BX50顯微鏡，日本OLYMPUS公司；CFX Connect型定量PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；SYSTEM GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4 分組及給藥

30只自發(fā)性高血壓大鼠隨機(jī)分為模型組、卡托普利組和天麻芎苓止眩片組，每組10只，另設(shè)10只WKY大鼠為正常對(duì)照組?？ㄍ衅绽M和天麻芎苓止眩片組分別予7.6、43.2 mg/kg相應(yīng)藥液灌胃，正常對(duì)照組及模型組予蒸餾水灌胃，給藥體積均為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)8周。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 收縮壓測(cè)定

1.5.2 炎癥因子檢測(cè)

干預(yù)結(jié)束后，腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置10～20 min，2 000 r/min離心20 min，收集血清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)IL-1、IL-10含量。

1.5.3 胸主動(dòng)脈病理形態(tài)觀察

分離大鼠胸主動(dòng)脈，取部分組織置于10%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水，透明，將已透明組織置于石蠟中浸蠟，包埋，切片（厚度5 μm），常規(guī)HE染色，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察胸主動(dòng)脈病理變化。

1.5.4 免疫組化檢測(cè)

取大鼠胸主動(dòng)脈組織石蠟切片，依次放入二甲苯、無(wú)水乙醇、95%乙醇、80%乙醇中脫蠟，10%山羊血清室溫封閉5～10 min，滴加Atg8、LC3、p62一抗（均為1∶100），4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗（1∶200），37 ℃孵育20 min，PBS洗滌3 min×3次，DAB染色5 min，蘇木素復(fù)染，分化，返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，采集圖像，以棕黃色染色為陽(yáng)性表達(dá)，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)的積分光密度（IOD）。

1.5.5 Western blot檢測(cè)

一是把自己的思想裝進(jìn)別人的腦袋，二是把別人的錢裝進(jìn)自己的口袋。前者成功了叫老師，后者成功了叫老板，兩者都成功了叫老婆。

取大鼠胸主動(dòng)脈組織，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。滴加Atg8、LC3、p62一抗（均為1∶1 000），室溫孵育1 h，PBST洗膜5 min×3次。加入HRP標(biāo)記二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，PBST洗膜5 min×3次，ECL發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH為內(nèi)參，采用AlphaEase FC軟件分析目的蛋白灰度值。

1.5.6 RT-PCR檢測(cè)

取大鼠胸主動(dòng)脈組織，加入Trizol試劑，4 ℃充分勻漿，室溫靜置5 min，加入0.2 mL氯仿振蕩15 s，室溫靜置5 min，取上清液于1.5 mL EP管中，加等體積異丙醇沉淀RNA，加入DEPC水溶解RNA沉淀，按試劑盒說(shuō)明書將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，95 ℃、10s，60 ℃、20 s，72 ℃、15 s，85 ℃、10 s，25 ℃、30 s，共45個(gè)循環(huán)，引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參，采用2法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±表示，多組間比較符合正態(tài)性及方差齊性采用方差分析，兩兩比較采用LSD-檢驗(yàn)，方差不齊采用秩和檢驗(yàn)。＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 天麻芎苓止眩片對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠收縮壓的影響

與同時(shí)點(diǎn)正常對(duì)照組比較，模型組大鼠收縮壓明顯升高（＜0.05）；給藥第1周開始，與模型組比較，卡托普利組大鼠收縮壓明顯降低（＜0.05）；給藥第3周開始，與模型組比較，天麻芎苓止眩片組大鼠收縮壓明顯降低（＜0.05）；給藥第6周后，天麻芎苓止眩片組與卡托普利組大鼠收縮壓差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠給藥不同時(shí)點(diǎn)收縮壓比較（±s，每組10只）

2.2 天麻芎苓止眩片對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血清白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-10含量的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IL-1含量明顯增加，IL-10含量明顯減少（＜0.05）；與模型組比較，卡托普利組和天麻芎苓止眩片組大鼠血清IL-1含量明顯減少，IL-10含量明顯增加（＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠血清IL-1、IL-10含量比較（±s，每組10只）

2.3 天麻芎苓止眩片對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠胸主動(dòng)脈病理形態(tài)的影響

HE染色顯示，正常對(duì)照組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜連續(xù)、平整，內(nèi)皮完整，平滑肌細(xì)胞整齊排列；模型組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜粗糙、斷裂，平滑肌細(xì)胞增多且排列紊亂，血管壁顯著增厚；天麻芎苓止眩片組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜損傷減輕，平滑肌細(xì)胞排列較為規(guī)則，管壁厚度正常。見圖3。

圖3 各組大鼠胸主動(dòng)脈形態(tài)（HE染色，×400）

2.4 天麻芎苓止眩片對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠胸主動(dòng)脈組織Atg8、LC3、p62蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠胸主動(dòng)脈組織Atg8、LC3、p62蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.05）；與模型組比較，卡托普利組和天麻芎苓止眩片組大鼠胸主動(dòng)脈組織Atg8、LC3、p62蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.05）。見表2、圖4。

表2 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織Atg8、LC3、p62蛋白表達(dá)比較（±s，IOD）

圖4 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織Atg8、LC3、p62蛋白陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠胸主動(dòng)脈組織Atg8、p62蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高（＜0.05）；與模型組比較，天麻芎苓止眩片組和卡托普利組大鼠胸主動(dòng)脈組織Atg8、p62蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯降低（＜0.05）。見圖5、圖6。

圖5 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織Atg8、LC3、p62蛋白免疫印跡

圖6 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織p62、LC3、Atg8蛋白表達(dá)比較（±s，每組10只）

2.5 天麻芎苓止眩片對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠胸主動(dòng)脈組織Atg8、LC3Ⅱ、p62 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠胸主動(dòng)脈組織Atg8、LC3Ⅱ、p62 mRNA表達(dá)明顯升高（＜0.05）；與模型組比較，卡托普利組和天麻芎苓止眩片組大鼠胸主動(dòng)脈組織Atg8、LC3Ⅱ、p62 mRNA表達(dá)明顯降低（＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織Atg8、LC3Ⅱ、p62 mRNA表達(dá)比較（±s）

3 討論

高血壓病屬中醫(yī)學(xué)“眩暈”“頭痛”范疇，其病機(jī)可用虛、瘀、風(fēng)概括，以肝腎陰虛為本，肝陽(yáng)上擾、瘀血阻絡(luò)為標(biāo)。天麻芎苓止眩片以天麻為君，平肝熄風(fēng)止痙，臣以鉤藤、川芎活血行氣、祛風(fēng)止痛，佐以茯苓、法半夏、野菊花健脾化痰、平肝清熱，全方共奏平肝熄風(fēng)、健脾逐瘀之效。

有研究表明，炎癥因子IL-1可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞，引起血管壁管腔狹窄，增加血管阻力，在高血壓發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。IL-10是一種與高血壓密切相關(guān)的抗炎因子，可以通過(guò)抑制IL-1、IL-8等促炎因子的產(chǎn)生減輕炎癥損傷，從而保護(hù)內(nèi)皮組織，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，進(jìn)而降低血壓，改善血管重塑。本研究中，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清炎癥因子IL-1含量增加，IL-10含量減少，大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜粗糙、斷裂，表明存在炎癥穩(wěn)態(tài)失衡及內(nèi)皮損傷。與模型組比較，天麻芎苓止眩片組大鼠血壓降低，血清炎癥因子IL-1含量減少，IL-10含量增加，胸主動(dòng)脈內(nèi)膜損傷及炎癥水平得到明顯改善。

線粒體應(yīng)激損傷與心血管疾病、炎癥反應(yīng)和代謝疾病聯(lián)系密切，線粒體自噬是通過(guò)溶酶體選擇性清除受損線粒體的質(zhì)量控制機(jī)制。Atg8是自噬體形成的關(guān)鍵蛋白，通過(guò)與磷脂酰乙醇胺結(jié)合參與自噬體膜的形成。LC3是Atg8的同源形式之一，定位在自噬體膜上，是目前檢測(cè)和研究自噬機(jī)制的標(biāo)志性蛋白。LC3是參與自噬小體形成的主要蛋白，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，胞質(zhì)型LC3（LC3Ⅰ）被APG7L/Atg7激活，轉(zhuǎn)變成膜型LC3（LC3Ⅱ）并附著于自噬體膜上，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可評(píng)估自噬水平的高低。

線粒體自噬過(guò)程中，LC3接頭蛋白和LC3受體發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其通過(guò)泛素依賴、獨(dú)立途徑或與受體直接作用的方式識(shí)別受損線粒體。泛素結(jié)合蛋白p62是LC3接頭蛋白之一。p62含泛素結(jié)合域（UBD）和LC3相互作用基序（LIR），在通過(guò)UBD結(jié)合耦聯(lián)于線粒體蛋白K63的多聚泛素化底物時(shí)，其LIR與自噬體膜上的LC3受體直接結(jié)合，誘導(dǎo)自噬。以p62為代表的LC3接頭蛋白是引導(dǎo)自噬體與泛素化分子結(jié)合的橋梁，自噬發(fā)生時(shí)，其作為泛素化底物被包裹進(jìn)自噬小體降解，通常p62水平與自噬活性成反比。

本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠胸主動(dòng)脈組織自噬相關(guān)蛋白Atg8、LC3、p62表達(dá)升高，推測(cè)在高血壓病理?xiàng)l件下，血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體自噬過(guò)度激活，進(jìn)而出現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙，導(dǎo)致高血壓發(fā)生；與模型組比較，天麻芎苓止眩片組大鼠胸主動(dòng)脈組織Atg8、LC3、p62表達(dá)降低，且與卡托普利組水平相當(dāng)，表明天麻芎苓止眩片能改善內(nèi)皮損傷，抑制線粒體過(guò)度自噬。通常情況下，p62水平與自噬程度成反比，而在本研究中，模型組p62和LC3Ⅱ表達(dá)同時(shí)升高，可能與自噬底物p62在自噬早期存在清除滯后現(xiàn)象，或p62與自噬體膜結(jié)合不牢固有關(guān)。天麻芎苓止眩片組和卡托普利組p62和LC3Ⅱ表達(dá)同時(shí)減少，可能是存在其他非自噬途徑參與p62的合成與降解，導(dǎo)致p62表達(dá)的滯后性。因此，將p62作為自噬標(biāo)記物可能無(wú)法真實(shí)反映自噬水平。

綜上所述，天麻芎苓止眩片能有效降低自發(fā)性高血壓大鼠血壓，其機(jī)制可能與改善炎癥穩(wěn)態(tài)失衡、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬、改善內(nèi)皮功能有關(guān)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，p62作為自噬標(biāo)記物可能無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)價(jià)細(xì)胞自噬的真實(shí)狀態(tài)。今后本課題組將繼續(xù)深化自噬與高血壓的關(guān)聯(lián)機(jī)制、炎癥與自噬相互作用及天麻芎苓止眩片的干預(yù)研究，以期為高血壓的中醫(yī)藥防治提供參考。