多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)化金蕾顆粒水提醇沉工藝

曲馨，薄雙琴，柳娜，寇亮，陳暉，景明

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

膽囊炎通常是病原微生物感染和化學(xué)損傷引發(fā)的一系列膽系感染、膽汁刺激（膽紅素和類脂質(zhì)等代謝失調(diào)）、胰液反流進(jìn)入膽管等所致。膽囊炎大多與膽石癥合并發(fā)病，且具有反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)。金蕾復(fù)方是甘肅省名中醫(yī)張銀川主任中醫(yī)師的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由濕生扁蕾、金錢草組成，臨床用于膽囊炎具有良好療效。藏藥濕生扁蕾和金錢草具有清熱、祛濕、利膽功效，主治肝膽濕熱所致脅痛、口苦，急性膽囊炎、膽管炎等。課題組前期藥理研究表明，金蕾復(fù)方具有一定的鎮(zhèn)痛、抗炎、保肝、護(hù)肝作用，半數(shù)致死量（LD）＞120 g/kg（成人劑量的12倍），未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用。該方臨床用藥以湯劑為主，現(xiàn)遵循傳統(tǒng)水煎工藝，制成顆粒劑。濕生扁蕾的黃酮類成分具有抗菌、抗氧化等作用，其代表成分為當(dāng)藥黃素、木犀草素；金錢草的黃酮類成分能夠有效抑制并促進(jìn)結(jié)石排出，結(jié)合2020年版《中華人民共和國藥典》金錢草含量測定指標(biāo)及初期試驗(yàn)，確定山柰酚為指標(biāo)成分。故本研究以當(dāng)藥黃素、木犀草素、山柰酚及干浸膏得率為考察指標(biāo)，采用L（3）正交試驗(yàn)，熵權(quán)法進(jìn)行多指標(biāo)綜合加權(quán)評分優(yōu)選水提工藝，采用單因素試驗(yàn)結(jié)合大生產(chǎn)耗能、經(jīng)濟(jì)因素優(yōu)選醇沉工藝，為后續(xù)制劑成型奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

ST-501流水式中藥粉碎機(jī)（浙江省瑞安市賽特機(jī)電有限公司），XPE105型分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），HGZF-9203型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司），SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵（合肥予華儀器有限公司），EV351旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（北京萊伯泰科儀器股份有限公司），SB5200D超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司），1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）。

濕生扁蕾采自甘肅省定西市漳縣大草灘（2020年8月），經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院楊錫倉主任藥師鑒定為龍膽科扁蕾屬一年生草本植物濕生扁蕾（Munro）Ma.的干燥全草；金錢草購自甘肅省蘭州市黃河中藥材市場，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院楊錫倉主任藥師鑒定為報春花科珍珠菜屬植物過路黃Hance.的干燥全草。對照品木犀草素（批號B20888，HPLC純度≥98%）、當(dāng)藥黃素（批號B20281，HPLC純度≥98%）、山柰酚（批號B21126，HPLC純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分含量測定

2.1.1 色譜條件

采用Agilent SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.10%磷酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～10 min，70%～60%A；10～17 min，60%～50%A；17～40 min，50%～30%A；40～50 min，30%A），流速1.0 mL/min，檢測波長360 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

2.1.2 混合對照品溶液制備

精密稱定當(dāng)藥黃素、木犀草素、山柰酚對照品適量，以甲醇溶解并定容，得到濃度分別為0.10、0.21、0.03 mg/mL的混合對照品溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備

精密移取一定濃度水提濃縮液25 mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，分次用少量甲醇溶解，移入25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，稱定質(zhì)量，超聲（頻率40 kHz，功率900 W，時間40 min）溶解，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性對照溶液制備

分別稱取缺濕生扁蕾、金錢草處方藥物各10 g，分別加入12倍量水回流提取3次，每次0.5 h，合并濾液，濃縮后分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備缺濕生扁蕾、金錢草的陰性對照溶液。

2.1.5 專屬性試驗(yàn)

精密吸取上述混合對照品溶液、供試品溶液、濕生扁蕾陰性對照溶液、金錢草陰性對照溶液各10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖1。結(jié)果陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。

圖1 金蕾顆粒水提液中當(dāng)藥黃素、木犀草素、山柰酚HPLC圖

2.1.6 線性關(guān)系考察

分別配制系列濃度的當(dāng)藥黃素、木犀草素、山柰酚對照品溶液，精密吸取5 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。3種指標(biāo)成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 3種指標(biāo)成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.1.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對照品溶液5 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定并計(jì)算峰面積RSD，結(jié)果當(dāng)藥黃素、木犀草素、山柰酚峰面積RSD分別為0.83%、0.67%、0.98%。表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，室溫放置，分別于0、4、6、8、12、24 h精密吸取5 μL進(jìn)樣測定，結(jié)果當(dāng)藥黃素、木犀草素、山柰酚峰面積RSD分別為0.97%、1.69%、0.88%，表明供試品溶液中上述3種成分于室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算當(dāng)藥黃素、木犀草素、山柰酚含量RSD分別為1.24%、2.38%、1.64%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密吸取已測定含量的供試品溶液6份，按1∶1比例添加當(dāng)藥黃素、木犀草素、山柰酚對照品適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算各成分平均加樣回收率。結(jié)果當(dāng)藥黃素、木犀草素、山柰酚的平均加樣回收率分別為98.28%、99.53%、98.49%，表明方法準(zhǔn)確性良好。

2.1.11 樣品測定

精密吸取正交試驗(yàn)水提濃縮液樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行2份，進(jìn)樣測定，每份樣品重復(fù)測定2次，根據(jù)線性回歸方程，計(jì)算樣品中當(dāng)藥黃素、木犀草素、山柰酚含量平均值。

醫(yī)療設(shè)備是醫(yī)院影像科管理的重點(diǎn)，如CT影像設(shè)備、超聲影像設(shè)備、腹腔鏡等醫(yī)療設(shè)備等，隨著現(xiàn)代醫(yī)療衛(wèi)生條件的進(jìn)步，這些醫(yī)療設(shè)備的精密程度以及造價也不斷提高，因此，加強(qiáng)對設(shè)備的管理與維護(hù)，延長設(shè)備的使用壽命，是保證臨床治療效果，控制醫(yī)院運(yùn)行成本的關(guān)鍵。隨著現(xiàn)代信息技術(shù)的不斷發(fā)展，其在醫(yī)院影像科醫(yī)療設(shè)備管理中的運(yùn)用也得到了普及，因此，如何打造系統(tǒng)、完善的信息管理模式，推動影像科醫(yī)療設(shè)備的管理與維護(hù)是當(dāng)前醫(yī)院管理工作的重要內(nèi)容。

2.2 干膏得率測定

參照2020年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則2201出膏率測定方法。精密吸取已知原藥材濃度的水提濃縮液5.0 mL于恒重蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥3 h，干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算干膏得率。干膏得率（%）＝（M1－M2）÷CV×100%。式中，M1為恒重蒸發(fā)皿加干膏質(zhì)量，M2為恒重蒸發(fā)皿質(zhì)量，C為水提濃縮液含原藥材濃度，V為取樣體積。

2.3 提取工藝優(yōu)化

2.3.1 吸水量考察

按處方量稱取濕生扁蕾、金錢草共30 g，置于干燥帶塞廣口瓶中，加入200 mL蒸餾水，浸泡至全部透心，稱定濕重，計(jì)算得平均吸水量約為原藥材的2.9倍，即在提取過程中第2、3次加水量比第1次少3倍量原藥材。吸水率（%）＝（原藥材濕重－原藥材干重）×100%÷原藥材干重。

2.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于傳統(tǒng)水煎工藝，選擇水作為提取溶劑，由于處方藥物均為全草入藥，質(zhì)地較輕，故選擇加水量（A）為原藥材的12、14、16倍，提取時間（B）選擇0.5、1.0、1.5 h，提取次數(shù)（C）選擇常規(guī)的1、2、3次。為確定最佳水提工藝條件，擬定L（3）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，以當(dāng)藥黃素、木犀草素、山柰酚的提取量及干膏得率為評價指標(biāo)，采用熵權(quán)法對評價指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重系數(shù)分配，計(jì)算綜合評分，確定最優(yōu)水提工藝，因素水平見表2。

表2 金蕾顆粒提取工藝正交試驗(yàn)因素水平

2.3.3 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

信息熵是衡量系統(tǒng)不確定性的無序程度的度量，也可用于在多指標(biāo)系統(tǒng)中確定各指標(biāo)權(quán)重。評價指標(biāo)取值變異程度越大，數(shù)據(jù)越無序，提供信息量越多，該指標(biāo)就越重要，反之則越不重要。

表3 金蕾顆粒提取工藝評價指標(biāo)權(quán)重計(jì)算

根據(jù)各指標(biāo)權(quán)重計(jì)算評價指標(biāo)綜合評分，對正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析。綜合評分＝（當(dāng)藥黃素提取量/當(dāng)藥黃素最大提取量）×0.268 6×100＋（木犀草素提取量/木犀草素最大提取量）×0.278 6×100＋（山柰酚提取量/山柰酚最大提取量）×0.265 0×100＋（干膏得率/最大干膏得率）×0.187 7×100。正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。ABC、ABC、ABC綜合評分分別為85.27、87.24、97.55，直觀分析表明C因素（提取次數(shù)）對提取結(jié)果的影響最大。利用方差分析對最優(yōu)提取工藝進(jìn)行確定，結(jié)果見表5。

表4 金蕾顆粒提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 金蕾顆粒提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

由正交試驗(yàn)直觀分析可知，各因素對金蕾顆粒水提工藝的影響為C＞A＞B，各因素不同水平的影響為：A＞A＞A，B＞B＞B，C＞C＞C。方差分析發(fā)現(xiàn)，C因素三水平間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），根據(jù)LSD兩兩比較方差分析并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際確定最優(yōu)水平組合為ABC，即加12倍量水提取3次，每次0.5 h。

2.3.4 水提工藝驗(yàn)證

按處方量稱取濕生扁蕾、金錢草共30 g，平行3批，按最佳水提工藝ABC進(jìn)行提取，計(jì)算干膏得率和指標(biāo)成分提取量，結(jié)果見表6。表明該工藝穩(wěn)定可行，符合大生產(chǎn)要求。

表6 金蕾顆粒提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

2.4 醇沉工藝優(yōu)化

水提后醇沉除雜可提高藥物治療效果、減少服用量，適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。本研究選取對醇沉影響較大的醇沉終點(diǎn)乙醇濃度、藥液相對密度、靜置溫度為考察因素，以當(dāng)藥黃素、木犀草素、山柰酚的轉(zhuǎn)移率及干膏得率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)確定最佳醇沉工藝。指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率（%）＝醇沉前指標(biāo)成分含量÷醇沉后指標(biāo)成分含量×100%。

2.4.1 單因素試驗(yàn)

2.4.1.1 藥液密度

按最佳水提工藝提取得水提液，分為3等份，分別濃縮至相對密度為1.00～1.02、1.03～1.05、1.06～1.08（25 ℃），精密量取30 mL濃縮液，在攪拌速度為900 r/min條件下勻速滴入95%乙醇至乙醇濃度為70%，室溫靜置24 h，取上清液減壓旋蒸至無醇味，按上述方法測定當(dāng)藥黃素、木犀草素、山柰酚轉(zhuǎn)移率及干膏得率，結(jié)果見表7。隨著藥液相對密度增加，干膏得率逐漸減小，指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率在藥液相對密度為1.00～1.02、1.03～1.05時較高但相差不大，考慮工業(yè)大生產(chǎn)乙醇用量，選擇藥液密度為1.03～1.05。

表7 不同醇沉藥液密度的干膏得率及指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率比較（%）

2.4.1.2 醇沉終點(diǎn)乙醇濃度

精密量取30 mL相對密度為1.00（25 ℃）的水提濃縮液3等份，在攪拌速度為900 r/min條件下勻速滴入95%乙醇，使終點(diǎn)乙醇濃度分別達(dá)60%、70%、80%后密封，室溫靜置24 h，取上清液，減壓旋蒸至無醇味，按上述方法測定當(dāng)藥黃素、木犀草素、山柰酚轉(zhuǎn)移率及干膏得率，結(jié)果見表8。隨著醇沉終點(diǎn)乙醇濃度增加，干膏得率逐漸減小，各指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率在乙醇濃度為70%、80%時較高但相差不大，考慮后續(xù)成型的服用劑量及制劑成本，選擇醇沉終點(diǎn)乙醇濃度為70%。

表8 不同醇沉終點(diǎn)乙醇濃度的干膏得率及指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率比較（%）

2.4.1.3 靜置溫度

按“2.4.1.1”“2.4.1.2”項(xiàng)下優(yōu)選條件進(jìn)行醇沉后，分別于室溫、10 ℃、4 ℃環(huán)境靜置24 h，測定當(dāng)藥黃素、木犀草素、山柰酚的轉(zhuǎn)移率及干膏得率，結(jié)果見表9。不同靜置溫度的指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率均無明顯變化。隨著靜置溫度降低，顆粒沉降速度加快，醇沉上清液澄明度更好（表明藥液質(zhì)量更好），干膏得率逐漸減小，考慮藥液質(zhì)量及耗能因素，確定醇沉靜置溫度為10 ℃。

表9 不同醇沉靜置溫度的干膏得率及指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率比較（%）

2.4.2 醇沉工藝驗(yàn)證

對優(yōu)選的醇沉工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證，按處方量稱取90 g藥物飲片，按最佳水提工藝提取，濃縮至醇沉前藥液密度為1.03～1.05，在900 r/min轉(zhuǎn)速下勻速滴入95%乙醇至乙醇濃度為70%，密封，10 ℃靜置24 h，取上清液減壓旋蒸至無醇味，定容至一定體積，測定干膏得率及各指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表10。表明該醇沉工藝穩(wěn)定、可靠，符合大生產(chǎn)要求。

表10 金蕾顆粒醇沉工藝驗(yàn)證試驗(yàn)（%）

3 討論

將金蕾復(fù)方改為顆粒劑，既可保留湯劑吸收迅速、起效快的優(yōu)點(diǎn)，同時解決攜帶、貯存、服用不便的缺點(diǎn)。中藥復(fù)方所含成分復(fù)雜，藥理作用具有多層次、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，為避免破壞復(fù)方的整體性，采用傳統(tǒng)的水提工藝。中藥水提液中一般含有淀粉、蛋白質(zhì)等無效組分，為提高單位有效組分含量、增加藥液穩(wěn)定性、減小后續(xù)顆粒劑的服用劑量，本試驗(yàn)在水提工藝基礎(chǔ)上進(jìn)行醇沉。在醇沉過程中，醇沉前藥液密度過大會出現(xiàn)包合現(xiàn)象，造成有效成分轉(zhuǎn)移率下降，密度過小則乙醇用量大，增加制藥成本；醇沉終點(diǎn)乙醇密度過大會導(dǎo)致有效成分轉(zhuǎn)移率降低，過小則雜質(zhì)去除量減小，后續(xù)所得制劑無法顯著減小服用劑量；醇沉后靜置溫度可影響顆粒沉降速度，進(jìn)而影響醇沉上清液澄明度，故考察醇沉靜置溫度，可在保證最低耗能的前提下，提高藥液質(zhì)量和制藥效率。因此，醇沉工藝選擇醇沉前藥液密度、醇沉終點(diǎn)乙醇濃度、靜置溫度為考察因素具有一定的實(shí)際意義。根據(jù)課題組前期藥理研究，金蕾復(fù)方中黃酮類和■酮類成分為治療膽囊炎的主要藥效成分，在預(yù)試驗(yàn)中濕生扁蕾中■酮類成分以水為提取溶劑的條件下提取量極小，未達(dá)到最低定量要求，因此以當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、山柰酚為指標(biāo)成分；干膏得率對后續(xù)顆粒劑成型、服用劑量有一定影響，因此將干膏得率納入考察指標(biāo)具有實(shí)際意義。

綜上，本研究在中醫(yī)理論指導(dǎo)下結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，對金蕾復(fù)方水提醇沉工藝進(jìn)行優(yōu)化，更接近大生產(chǎn)實(shí)際情況，但指標(biāo)成分的確定僅依賴于目前相關(guān)藥材的藥理學(xué)研究，尚不全面，有待進(jìn)一步完善。