益腎養(yǎng)髓方對(duì)脊髓型頸椎病大鼠受損脊髓微血管再生的影響

唐彬，朱立國(guó)，陳忻，楊博文，秦曉寬，金哲峰，魏戌，劉志偉，孫凱，銀河

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102；

2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

脊髓型頸椎?。╟ervical spondylotic myelopathy，CSM）是由于椎間盤(pán)及頸椎小關(guān)節(jié)退變、椎體邊緣骨贅形成，對(duì)椎管形成占位并壓迫脊髓或支配脊髓的血管，造成脊髓受壓和/或缺血而引起的脊髓傳導(dǎo)功能障礙性疾病。CSM可導(dǎo)致患者明顯的肢體感覺(jué)或運(yùn)動(dòng)功能障礙。益腎養(yǎng)髓方針對(duì)該病本虛標(biāo)實(shí)病機(jī)，以益腎活血類(lèi)中藥為主，用于治療CSM早、中期病情平穩(wěn)、手術(shù)指征不明顯患者獲得比較滿(mǎn)意的療效。本研究針對(duì)CSM受壓后局部出現(xiàn)微循環(huán)障礙的病理特點(diǎn)，采用脊髓慢性壓迫法建立CSM大鼠模型，觀察益腎養(yǎng)髓方對(duì)模型大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、受損脊髓組織形態(tài)及微血管形態(tài)的影響，初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD大鼠30只，體質(zhì)量240～280 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2017-0033。飼養(yǎng)于室溫、通風(fēng)良好、自然光照環(huán)境，自由攝食飲水。喂食大鼠繁殖顆粒飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物及制備

益腎養(yǎng)髓方（巴戟天9 g，熟地黃12 g，鹿角霜12 g，白芍12 g，黃芪15 g，桂枝6 g，丹參9 g，鬼箭羽12 g，羌活6 g），飲片購(gòu)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院藥劑科，煎煮后水浴濃縮，用純凈水對(duì)濃縮后的藥液進(jìn)行等比稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛确謩e為0.419、0.837、1.674 g/mL的低、中、高濃度藥液，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3 主要試劑與儀器

HE染色試劑盒（貨號(hào)G1120）、CD34多克隆抗體（貨號(hào)K009406P）、中性樹(shù)膠（貨號(hào)G8590）、檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（貨號(hào)C1031）、蘇木素染色液（貨號(hào)G1080），北京索萊寶科技有限公司。刀柄、眼科剪、線剪、有齒鑷、無(wú)齒鑷、持針器、彎鉗、直鉗、單關(guān)節(jié)骨剪，上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司；電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司，型號(hào)KH-5000E），電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，型號(hào)AE160），組織脫水機(jī)（德國(guó)徠卡公司，型號(hào)ASP200S），組織包埋機(jī)（德國(guó)徠卡公司，型號(hào)EG1150C），石蠟切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司，型號(hào)RM2245）。

1.4 造模、分組及給藥

將大鼠分為假手術(shù)組（6只）和造模組（24只），采用吸水膨脹材料聚乙烯醇聚丙烯酰胺互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠（北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院提供）壓迫脊髓法制備CSM大鼠模型。2%戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）麻醉大鼠，剃除頸背部毛發(fā)，常規(guī)碘伏消毒，頸椎后正中切口3～4 cm，切開(kāi)皮膚，暴露頸肩部肌肉群，找到最高突起處及C棘突，自下向上正中切開(kāi)肌肉群并向兩側(cè)牽拉，用刀片剝離棘突兩側(cè)附著的肌肉，暴露頸椎椎板，剔除椎板間黃韌帶，從C～T間隙將吸水膨脹材料（1.5 mm×0.7 mm×0.3 mm）向上植入C～C椎板，植入后逐層縫合肌肉、皮膚。假手術(shù)組采用同樣方法暴露椎板，剔除椎板間黃韌帶，將同體積吸水膨脹材料植入C～C椎板后隨即取出，不造成持續(xù)脊髓壓迫。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素（8萬(wàn)U/d）預(yù)防感染，常規(guī)條件飼養(yǎng)，每日早晚人工擠壓膀胱協(xié)助排尿，至形成反射性排尿?yàn)橹?。為使大鼠脊髓急性壓迫轉(zhuǎn)為慢性壓迫，術(shù)后適應(yīng)性觀察2周后開(kāi)始灌胃給藥。根據(jù)Basso Beattie Bresnahan（BBB）評(píng)分將造模大鼠隨機(jī)分為模型組及益腎養(yǎng)髓方低、中、高劑量組，每組6只。給藥劑量以70 kg成人與200 g大鼠的體表面積進(jìn)行換算，分別灌胃4.19、8.37、16.74 g/kg（相當(dāng)于臨床成人用量的0.5、1、2倍）益腎養(yǎng)髓方藥液，模型組和假手術(shù)組灌胃等量0.9%氯化鈉注射液，體積均為1 mL/100 g，每日1次，連續(xù)4周。

1.5 行為學(xué)評(píng)分

BBB評(píng)分用于評(píng)估大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況。將大鼠置于平臺(tái)上，觀察記錄其后肢的行走及肢

體活動(dòng)，正常大鼠滿(mǎn)分21分。分別于灌胃前和灌胃第2、4周對(duì)大鼠進(jìn)行BBB評(píng)分。

1.6 取材

戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）麻醉大鼠，手術(shù)剪打開(kāi)大鼠胸腔，暴露心臟，將灌流針針頭從左心室靠近心尖搏動(dòng)處插入，用0.9%氯化鈉溶液250 mL沖洗，待肝臟和肺臟顏色轉(zhuǎn)白且右心房流出液體澄清，再用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行灌流，當(dāng)大鼠出現(xiàn)四肢抽搐、四肢及尾巴僵硬、全身強(qiáng)直時(shí)停止灌流。取C～C節(jié)段脊髓，置于4%多聚甲醛中固定，用于HE、免疫組化染色。

1.7 HE染色

將脊髓組織置于4%多聚甲醛中固定過(guò)夜，石蠟包埋，切片（厚度約5 μm），二甲苯脫蠟，梯度乙醇（100%、90%、80%、75%）浸泡脫水，每個(gè)梯度10 min，蘇木素染色，蒸餾水沖洗，伊紅染色，蒸餾水沖洗，梯度乙醇（75%、80%、90%、100%）脫水，二甲苯透明，自然晾干，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察脊髓組織病理變化。

1.8 免疫組化染色

石蠟切片按“1.7”項(xiàng)下步驟脫蠟后，3%HO浸泡10 min，自來(lái)水沖洗，檸檬酸緩沖液煮3 min×2次，進(jìn)行熱抗原修復(fù)，PBS沖洗2次，加6%山羊血清于37 ℃溫箱孵育30 min，滴加CD34一抗（1∶100），4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次，滴加二抗（1∶100），37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，DAB染色，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

參照Weidner方法進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)。先在40倍光鏡下觀察整張切片，尋找微血管密度較高區(qū)域，即“密集區(qū)”。隨后在400倍光鏡下計(jì)數(shù)被染成棕色的血管內(nèi)皮細(xì)胞簇，與鄰近微血管分開(kāi)且有微血管腔者計(jì)為1個(gè)微血管。每只大鼠微血管數(shù)以5個(gè)400倍視野下微血管數(shù)目平均值計(jì)算。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 益腎養(yǎng)髓方對(duì)模型大鼠行為學(xué)評(píng)分的影響

與同一時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組比較，模型組大鼠BBB評(píng)分明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，益腎養(yǎng)髓方高劑量組大鼠灌胃第2周BBB評(píng)分明顯升高（＜0.05），益腎養(yǎng)髓方高、中劑量組大鼠灌胃第4周BBB評(píng)分明顯升高（＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)BBB評(píng)分比較（±s，分）

2.2 益腎養(yǎng)髓方對(duì)模型大鼠脊髓組織病理形態(tài)的影響

假手術(shù)組大鼠脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完好，細(xì)胞核完整，脊髓組織結(jié)構(gòu)正常，無(wú)空泡樣改變；模型組大鼠脊髓組織可見(jiàn)大量神經(jīng)細(xì)胞核固縮，細(xì)胞腫脹、壞死，有大量纖維瘢痕組織及大空泡樣改變；益腎養(yǎng)髓方低劑量組大鼠脊髓組織可見(jiàn)大量小空泡樣改變及固縮的神經(jīng)細(xì)胞核呈游離狀態(tài)分布，存在形態(tài)正常的神經(jīng)細(xì)胞；益腎養(yǎng)髓方中劑量組大鼠脊髓組織空洞較小，有少量纖維瘢痕組織及固縮的神經(jīng)細(xì)胞核，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)趨于正常；益腎養(yǎng)髓方高劑量組大鼠脊髓組織可見(jiàn)少量空洞及纖維瘢痕組織，空洞周?chē)嬖诖罅可窠?jīng)細(xì)胞，有少量神經(jīng)細(xì)胞核固縮，細(xì)胞核分布逐漸集中。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠脊髓組織形態(tài)（HE染色，×400）

2.3 益腎養(yǎng)髓方對(duì)模型大鼠脊髓組織微血管數(shù)目的影響

免疫組化染色可見(jiàn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿被染成棕黃色，微血管呈梭形或分支狀分布。假手術(shù)組大鼠脊髓前動(dòng)、靜脈及微循環(huán)血管管腔清晰，形態(tài)正常；模型組大鼠脊髓慢性壓迫處脊髓前動(dòng)、靜脈受壓變扁，微血管稀疏、管壁變薄，邊界不清，白質(zhì)受壓嚴(yán)重處微血管數(shù)目減少，灰質(zhì)僅見(jiàn)少量微血管分布；益腎養(yǎng)髓方低劑量組大鼠脊髓前動(dòng)、靜脈受壓變形，受壓處白質(zhì)、灰質(zhì)微血管數(shù)目減少，但優(yōu)于模型組；益腎養(yǎng)髓方中、高劑量組大鼠脊髓前動(dòng)、靜脈受壓變形，受壓處白質(zhì)、灰質(zhì)有微血管分布，且微血管數(shù)目較益腎養(yǎng)髓方低量組有所增加。

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓組織微血管數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；與模型組比較，益腎養(yǎng)髓方中、高劑量組大鼠脊髓組織微血管數(shù)目明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。見(jiàn)圖2、表2。

表2 各組大鼠脊髓組織微血管數(shù)目比較（±s，個(gè)）

圖2 各組大鼠脊髓組織CD34陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

3 討論

根據(jù)臨床癥狀，CSM屬中醫(yī)學(xué)“痙證”“痿證”范疇，其病位在脊髓，病機(jī)主要為氣滯血瘀，阻滯經(jīng)絡(luò)而出現(xiàn)機(jī)體失用。與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為脊髓受壓、脊髓血供減少、脊髓神經(jīng)功能障礙觀點(diǎn)相符。脊髓微循環(huán)功能正常是維持脊髓神經(jīng)功能的基礎(chǔ)，脊髓血供的60%～70%由脊髓前正中縱行的脊髓前動(dòng)脈及相應(yīng)的溝動(dòng)脈提供。脊髓前動(dòng)脈最易受到椎體骨突、椎間盤(pán)的壓迫，機(jī)械壓迫導(dǎo)致脊髓血管內(nèi)皮細(xì)胞破裂，基底膜外露，血小板黏附，甚至形成微栓子，造成髓內(nèi)小動(dòng)脈與小靜脈阻塞。壓迫脊髓造成的脊髓微循環(huán)障礙不僅與應(yīng)激性激活凝血系統(tǒng)使血液處于高凝狀態(tài)有關(guān)，也與血管內(nèi)皮損傷有關(guān)，還與自由基引起微血管閉塞或痙攣，從而導(dǎo)致延遲性缺血等有關(guān)。缺血缺氧也可導(dǎo)致細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，進(jìn)而誘導(dǎo)或加重神經(jīng)細(xì)胞自噬。脊髓受壓除直接損傷血管外，也可能使脊髓后橫徑增大，橫向走行的血管被拉長(zhǎng)，血管口徑變小，脊髓微血管循環(huán)改變、脊髓血供減少而影響脊髓功能，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。可見(jiàn)，脊髓血供與脊髓微血管形態(tài)、面積是否正常相關(guān)，脊髓微循環(huán)功能又取決于神經(jīng)元的數(shù)量和功能。

CD34分子是一種高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，選擇性地表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，是血管內(nèi)皮細(xì)胞中較敏感的分子標(biāo)記物。CD34可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其在黏附分子和趨化因子的共同作用下發(fā)生遷移，有利于內(nèi)皮修復(fù)和血管重建。故CD34分子能較好地反映大鼠脊髓組織微循環(huán)的改善情況。

針對(duì)CSM氣滯血瘀致肝腎虧虛的病機(jī)特點(diǎn)，采用補(bǔ)益肝腎、活血通督為主要治法。益腎養(yǎng)髓方是課題組在經(jīng)典名方地黃飲子基礎(chǔ)上結(jié)合大量臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)提煉而成，方中巴戟天補(bǔ)腎溫陽(yáng)、強(qiáng)筋壯骨，熟地黃補(bǔ)血滋陰、益精填髓，二藥合而為君；臣藥鹿角霜溫腎助陽(yáng)，白芍養(yǎng)陰柔肝；佐使藥黃芪、桂枝益氣升陽(yáng)、溫經(jīng)通脈，鬼箭羽、丹參活血通經(jīng)、通絡(luò)止痛，羌活祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)，助太陽(yáng)氣化，暢督脈經(jīng)氣，使藥力達(dá)于頸部。針對(duì)CSM“本虛標(biāo)痹”的病機(jī)，共奏補(bǔ)肝益腎、活血通經(jīng)之效。益腎養(yǎng)髓方灌胃干預(yù)可顯著促進(jìn)大鼠脊髓壓迫后神經(jīng)功能的恢復(fù)。通過(guò)不同灌胃劑量比較發(fā)現(xiàn)，益腎養(yǎng)髓方高、中劑量效果較好。有研究顯示，溫陽(yáng)通督類(lèi)中藥可顯著降低家兔血液黏稠度，減少紅細(xì)胞壓積及降低紅細(xì)胞聚集指數(shù)，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，與本研究結(jié)果一致。益腎養(yǎng)髓方中丹參主要成分丹參酮ⅡA磺酸鈉可改善脊髓缺血再灌注損傷。黃芪能降低脊髓缺血損傷大鼠血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶濃度，降低水通道蛋白4表達(dá)，減輕脊髓水腫；還能緩解受壓后脊髓的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，改善微循環(huán)，從而起到保護(hù)脊髓的作用。以上研究為益腎養(yǎng)髓方的療效提供了相關(guān)藥理學(xué)證據(jù)。

綜上，益腎養(yǎng)髓方可提高CSM模型大鼠行為學(xué)評(píng)分，改善受損脊髓組織形態(tài)，減少纖維瘢痕組織產(chǎn)生，促進(jìn)脊髓慢性壓迫后神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)，同時(shí)增加脊髓微血管數(shù)目，具有改善脊髓血液循環(huán)、恢復(fù)血液供應(yīng)及脊髓功能的作用。