固定化乙酰膽堿酯酶的制備及其在中藥抑制劑篩選中的應(yīng)用*

唐 爽，張紅燕，吳仁安，鄧仕任，陳曉霞，夏林波

(1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600;2 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連 116023)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)又被稱為老年癡呆，是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一，對老年人的日常生活造成了嚴(yán)重的影響[1]。基于“膽堿能假說”而發(fā)掘的乙酰膽堿酯酶抑制劑(Acetylcholinesterase inhibitors，AChEI)也是目前臨床治療AD的最重要的靶點(diǎn)。

本研究以表面修飾羧基的納米級磁珠為基底材料，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)作為交聯(lián)劑，將AChE固定在磁珠表面，結(jié)合LC-MS/MS的技術(shù)，檢測與中藥提取液共孵育的固定化酶活性，并成功應(yīng)用到治療阿爾茨海默病的10種常見中藥[3]篩選中。該方法重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，為發(fā)現(xiàn)中藥活性成分提供了新的思路與途徑。

1 儀器與材料

QTrap 5500三重四極桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜，美國AB Sciex公司；ACQUITY UPLC超高效液相色譜，沃特世公司；JEOL 2000EX透射電子顯微鏡，日本電子株式會社；VERTEX 70v紅外光譜儀，德國Bruker Daltonics。

羧基磁珠，廈門普睿邁格生物科技有限公司；乙酰膽堿酯酶，北京索萊寶科技有限公司；溴化乙酰膽堿，上海麥克林生化科技有限公司；各中藥均購于六安市安竹堂生物科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 固定化酶制備及條件優(yōu)化

(1)固定化酶參考文獻(xiàn)[4]方法，在MES緩沖液中，通過EDC的交聯(lián)作用，將AChE固定在羧基修飾的磁珠表面，固定過程如圖1所示。

圖1 固定化乙酰膽堿酯酶的制備Fig.1 Preparation of immobilized AChE

(2)固定化酶條件的優(yōu)化從初始酶濃度(2、4、6、8 mg/mL)、孵育時間(1、2、3、4 h)、緩沖液pH(5、6、7、8)、孵育溫度(20、25、30、35 ℃)等四個方面進(jìn)行優(yōu)化。

(3)酶固載量測定以AChE為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，通過BCA法，利用酶標(biāo)儀測定在570 nm波長下標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、0.12、0.24、0.48、0.96、1.2 mg/mL)的吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；用同樣的方法測定反應(yīng)前、后以及清洗后溶液中AChE的含量，計算酶固載量。

(4)酶活性的測定溴化乙酰膽堿(ACh)在AChE的催化作用下會降解為溴化膽堿。參考文獻(xiàn)[5-6]方法對固定AChE進(jìn)行酶活實(shí)驗(yàn)，采用LC-MS/MS技術(shù)中MRM模式對所得上清液進(jìn)行檢測，選擇m/z 146.8→88.1離子對，測定與固定化AChE反應(yīng)前后的ACh峰面積，計算固定酶對底物的消耗量，并以消耗量最高者為酶活性100%，計算其他固定條件樣品的相對酶活性。

2.2 中藥提取液

按1:50的比例將中藥粉末用70%乙醇溶液超聲提取60 min，離心后取上清濃縮至干，將浸膏復(fù)溶于50%甲醇-乙酸銨緩沖液中，得50 mg/mL中藥樣品溶液；再將其用乙酸銨緩沖液稀釋10倍，以5 mg/mL為終濃度。

2.3 中藥的抑制性實(shí)驗(yàn)

先將固定的AChE與100 μL中藥提取液混合15 min，再對其進(jìn)行酶活實(shí)驗(yàn)，磁分離收集上清液，參照“2.1”檢測ACh反應(yīng)前后的峰面積變化情況。以不加中藥提取液的固定化AChE重復(fù)上述實(shí)驗(yàn),作為空白對照。

抑制率=(S樣品-S空白)/(S投入-S空白)×100%

式中：S投入為不加酶時ACh的色譜峰面積；S樣品為同時加入固定化AChE時和中藥提取液時底物ACh的色譜峰面積；S空白為僅加入固定化AChE時底物ACh的色譜峰面積。

3 結(jié)果與討論

3.1 固定化酶結(jié)構(gòu)表征

掃描電鏡結(jié)果如圖2所示，從圖2(a)中可以看出，未固定酶的磁珠粒徑均勻、分散性好；而圖2(b)中的磁珠表面模糊，并出現(xiàn)明顯的聚集現(xiàn)象，說明磁珠在AChE的作用下出現(xiàn)粘連情況，即AChE被固定在磁珠表面。

紅外光譜表征結(jié)果如圖3所示，1068.31 cm-1處的紅外吸收峰屬于羧基磁珠中Si-O的伸縮振動，圖3(b)中1548.47 cm-1、1644.89 cm-1處的紅外吸收峰分別為肽鍵中N-H的彎曲振動和C=O的伸縮振動，對比可知圖3(a)中并不具備肽鍵的吸收峰,說明AChE被成功的固定在磁珠表面。

圖2 羧基磁珠(a)和固定化AChE羧基磁珠的 透射電鏡表征圖固定化(b)Fig.2 Tem image of Carboxyl magnetic beads (a) and immobilized AChE (b)

圖3 羧基磁珠(a)和羧基磁珠(b)的 AChE的紅外光譜圖Fig.3 IR spectra of carboxyl magnetic beads(a) and immobilized AChE (b)

3.2 固定化酶條件的優(yōu)化

在AChE固定化過程中，初始酶濃度和緩沖液pH對酶固載量和酶活性影響較大，初始酶濃度的升高，引起酶固載量及催化效率的上升；而緩沖pH的提高，則導(dǎo)致酶固載量及酶活性的明顯下滑。孵育時間以及孵育溫度對酶固載量和酶活性的影響較小。最終確定的反應(yīng)條件為：AChE濃度8 mg/mL、孵育時間4 h、緩沖液pH值5.0、孵育溫度為20 ℃。

3.3 中藥的抑制活性

圖4 中藥抑制活性測試LC-MS/MSFig.4 LC-MS/MS of traditional Chinesemedicine inhibitory activity test

中藥抑制活性實(shí)驗(yàn)中底物ACh的LC-MS/MS檢測結(jié)果如圖4所示?？梢?，僅加入固定化酶和底物時，AChE面積很小，表明酶活性很高(圖4b)；當(dāng)同時加入固定化AChE時和川芎提取液時，ACh面積顯著增加，表明酶活性受到明顯抑制(圖4c)。

在10種用于治療AD的常用中藥中，我們成功篩選出石菖蒲、川芎、茯苓、當(dāng)歸等四種中藥具有較強(qiáng)的AChE抑制活性(圖5)。

圖5 治療AD常用中藥對固定化AChE的抑制率Fig.5 Inhibition rate of AChE immobilized by traditional Chinese medicine in treating AD

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以羧基磁珠為基底材料，通過EDC的交聯(lián)作用，將乙酰膽堿酯酶固定在磁珠表面，并對固定條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合LC-MS/MS的方法，最終將其運(yùn)用到治療老年癡呆常用的單味中藥中，通過酶活反應(yīng)得到石菖蒲、川芎、茯苓、當(dāng)歸對乙酰膽堿酯酶有較強(qiáng)的抑制作用。其中石菖蒲、當(dāng)歸中的AChEI已有明確報道，而川芎、茯苓中對乙酰膽堿酯酶有抑制性的活性成分卻鮮有提及，我們后續(xù)將進(jìn)一步對川芎、茯苓中的AChEI開展深入研究。