我國(guó)草莓膠孢炭疽菌的多基因聯(lián)合鑒定與致病性分析

侯圣凡 華戰(zhàn)迎 劉峻杰 董振飛 馮澤坤 閆佳琪 王紅清

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，北京 100193)

草莓(Fragaria×ananassaDuch)是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，因其種植周期短、結(jié)果早且經(jīng)濟(jì)效益高，所以在地方特色經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位[1]。我國(guó)草莓主產(chǎn)區(qū)有山東、安徽、遼寧、河北和江蘇等地。近年來(lái)，山西和云南等地的草莓產(chǎn)業(yè)也得到迅速發(fā)展。我國(guó)草莓主要是依靠設(shè)施栽培，由于多年連續(xù)種植，導(dǎo)致草莓根部病害近年來(lái)頻繁發(fā)生，其中以真菌性病害對(duì)草莓的影響最為顯著，對(duì)我國(guó)草莓產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展造成了巨大的危害[2]。

炭疽病是一種寄主廣泛且種類繁多的常見(jiàn)植物病害，而且此類真菌存在的地域范圍廣，可侵染多種農(nóng)作物。1931年，Brooks等[3]最先報(bào)道了侵染草莓匍匐莖和葉柄的病原菌為草莓炭疽菌，早期草莓炭疽病只是零星分布，后蔓延至整個(gè)佛羅里達(dá)州，經(jīng)鑒定引起炭疽病的病原為草莓炭疽菌(Colletotrichumfragariae)。1965年，澳大利亞等地公布了草莓炭疽菌和尖孢炭疽菌(C.acutatum)的存在[4]。1978年Mass等[5]根據(jù)對(duì)馬里蘭的草莓病害研究調(diào)查認(rèn)為草莓炭疽病病原主要為膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、草莓炭疽菌和尖孢炭疽菌。近年來(lái)，炭疽病在草莓生長(zhǎng)中危害日趨嚴(yán)重，已經(jīng)成為草莓苗期甚至整個(gè)生長(zhǎng)期的主要病害。設(shè)施環(huán)境下，草莓炭疽病大多不在地上部表現(xiàn)癥狀，而是在定植后的緩苗期危害根頸，引起根部腐爛，導(dǎo)致植株萎蔫和枯死。其致死率一般在10%～20%，有的可達(dá)到80%以上[6-7]。葉正文等[8]于1997年首次在我國(guó)報(bào)道草莓炭疽病并初步鑒定草莓炭疽病病原菌有尖孢炭疽菌和草莓炭疽菌2種，且以尖孢炭疽菌為主。2007年張海英等[9]經(jīng)過(guò)鑒定發(fā)現(xiàn)引起撫順草莓炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌和草莓炭疽菌。

尖孢炭疽菌與草莓炭疽菌通常對(duì)草莓地上部葉片及果實(shí)產(chǎn)生危害，地上部癥狀容易發(fā)現(xiàn)，可以及時(shí)防治。但膠孢炭疽菌引起的根部病害難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)與控制，對(duì)草莓危害較重。本研究通過(guò)對(duì)草莓炭疽根腐病病原菌膠孢炭疽菌分離純化發(fā)現(xiàn)，菌株在PDA平板上呈現(xiàn)不同的形態(tài)特征，因此對(duì)膠孢炭疽菌展開(kāi)進(jìn)一步的分析研究。膠孢炭疽菌分布地理范圍廣泛，寄主眾多，具有復(fù)合種和種群集合的特征[10]，傳統(tǒng)的使用單一ITS序列鑒定真菌有時(shí)會(huì)出現(xiàn)混淆錯(cuò)誤，結(jié)果不可靠。Crouch等[11]通過(guò)對(duì)炭疽菌ITS序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤率可高達(dá)86%。因此本研究將通過(guò)菌落形態(tài)鑒定、分離純化與分子鑒定、多基因序列(ITS-ACT-GAPDH-CAL-TUB2-CHS)聯(lián)合鑒定以及致病性鑒定的方法，對(duì)我國(guó)草莓主產(chǎn)區(qū)的草莓炭疽病病原菌膠孢炭疽菌復(fù)合種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育與致病性分析，以期為病害防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究于2017—2019年進(jìn)行。樣品采自草莓主產(chǎn)區(qū)山東臨沂、山東聊城、河北懷來(lái)、遼寧東港、江蘇徐州、安徽合肥、北京昌平、北京順義、四川成都、甘肅定西、云南玉溪和山西晉城12個(gè)地區(qū)，采集草莓根腐病樣品480株。經(jīng)過(guò)對(duì)草莓病樣的歸類整理得到109株菌株進(jìn)行后續(xù)研究(表1)。供試草莓品種有‘紅顏’‘哈尼’‘寧玉’‘香野’‘妙香’‘甜查理’。

表1 草莓根腐病病樣菌株采集信息Table 1 Collection information of strawberry root rot disease strains

表1(續(xù))

表1(續(xù))

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1病原菌分離與純化

取草莓根頸部病健交界處的組織(0.5～1 cm2左右)，用75%酒精滅菌30 s，無(wú)菌水洗滌3次；之后用2%的次氯酸鈉消毒6～8 min，無(wú)菌水洗滌3～4次；晾干置于PDA培養(yǎng)基，在25 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱生長(zhǎng)5～7 d。從菌落邊緣處挑取菌落菌絲置于PDA液體培養(yǎng)基中，在25 ℃搖床中培養(yǎng)1 d。采用單孢劃線分離法將單孢菌轉(zhuǎn)移到PDA平板上用于鑒定和后續(xù)保存。

1.2.2DNA提取及多基因序列擴(kuò)增

根據(jù)BufferA和BufferB溶液進(jìn)行DNA的快速提取[12]。挑取少量菌絲放于裝有50 μL BufferA溶液的PCR管中，之后置于PCR儀內(nèi)，95 ℃裂解10 min；再向每個(gè)PCR管內(nèi)加入50 μL Buffer B溶液，震蕩混勻，12 000 r/min離心20 s，取上清液50 μL于新PCR管中，即獲得所需DNA并測(cè)定其濃度?；诙嗷蛐蛄懈饕?表2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(25 μL)包括：PCR mix 12.5 μL、上下游引物(10 μmol)各1 μL、DNA模板1 μL,加dd H2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min。放于4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物送擎科公司測(cè)序。把測(cè)序成功的目的序列登錄到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，下載同源性序列(表3)。用MEGA 7.0軟件進(jìn)行多重比對(duì)并修正[13]，利用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[14]。

表2 各引物及PCR循環(huán)條件Table 2 Primers and PCR cycle conditions

1.2.3真菌致病性測(cè)定

選取生長(zhǎng)狀況一致的草莓苗‘紅顏’進(jìn)行噴霧法接種。將不同菌株的分生孢子制成1.0×106個(gè)/mL孢子懸浮液，均勻噴灑于草莓葉片上(以有水滴流下為度)，以噴灑無(wú)菌水為對(duì)照，每處理噴灑5株，重復(fù)3次。接種后草莓植株置于培養(yǎng)箱(25 ℃)中黑暗覆膜保濕培養(yǎng)24 h。之后揭膜，在25 ℃，光周期為12 h/12 h下培養(yǎng)。

參考王豐等[15]方法，并稍加改動(dòng)，對(duì)接種草莓苗病情分級(jí)與菌株致病性進(jìn)行等級(jí)劃分。0級(jí)：無(wú)病；1級(jí)：葉片枯萎面積占葉面積5%以下；3級(jí)：葉片枯萎面積占葉面積5.1%～15%；5級(jí)：葉片枯萎面積占葉面積15.1%～30%；7級(jí)：葉片枯萎面積占葉面積30.1%～50%;9級(jí)：葉片枯萎面積占葉面積50%以上或葉片枯死。發(fā)病率(DR)=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查株數(shù)×100%，病情指數(shù)(DI)=[(各級(jí)發(fā)病株數(shù)×病級(jí)數(shù))/(最高發(fā)病級(jí)數(shù)×調(diào)查株數(shù))]×100。利用SPSS 26.0軟件進(jìn)行致病性分析，采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行差異顯著性檢測(cè)，并完成柯赫氏法則驗(yàn)證[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓炭疽根腐病田間癥狀

草莓定植初期，炭疽根腐病病原菌通過(guò)侵染草莓根部，分泌相應(yīng)毒素。其孢子在維管系統(tǒng)中定植，破壞水分傳導(dǎo)的木質(zhì)部導(dǎo)管，導(dǎo)致植物萎蔫、干枯直至死亡(圖1(a));切開(kāi)病株短縮莖會(huì)發(fā)現(xiàn)根頸褐變、腐爛(圖1(b))。

(a)感病植株萎蔫癥狀;(b)感病植株根頸橫切面癥狀。(a) Symptoms of wilting of infected plants; (b) Transverse section of the Crown of infected plants.圖1 草莓炭疽根腐病田間癥狀Fig.1 Field symptoms of strawberry anthracnose crown rot

2.2 草莓炭疽根腐病病原菌鑒定

2.2.1病原菌形態(tài)觀察

暹羅炭疽菌菌株：在培養(yǎng)過(guò)程中菌落正面呈現(xiàn)白色，后期白色變暗，略微出現(xiàn)灰色；菌絲稀疏呈絮狀，后期會(huì)產(chǎn)生孢子泥和分生孢子盤；菌落背面中間區(qū)域?yàn)楹诤稚?，從中間到邊緣顏色逐漸變淡(圖2(a))。分生孢子柱狀、兩端鈍圓，尺寸為(11.73～13.99) μm×(3.00～5.02) μm(圖2(b))。隱秘炭疽菌菌株：菌落正面呈現(xiàn)乳白色，菌絲較為致密；菌落背面呈白色，其中間區(qū)域出現(xiàn)較小的褐色圓圈(圖3(a))。分生孢子柱狀、兩端鈍圓，大小較為均一，尺寸為(16.56～17.90) μm×(4.32～5.50) μm(圖3(b))。果生刺盤孢菌菌株：初始菌落正面邊緣為白色，中間略微顯現(xiàn)灰色，生長(zhǎng)到第8天時(shí)，菌落正面出現(xiàn)大面積灰褐色，菌絲稀疏，氣生菌絲較為茂盛，菌落背面出現(xiàn)大面積灰黑色(圖4(a))。分生孢子柱狀、兩端鈍圓，尺寸為(9.96～13.03) μm×(3.30～3.81) μm(圖4(b))。暹羅炭疽菌附著胞(圖2(c))、隱秘炭疽菌附著胞(圖3(c))和果生刺盤孢菌附著胞(圖4(c))分別由是相應(yīng)的3種分生孢子在水中萌發(fā)芽管后形成的梨形和卵形等暗褐色結(jié)構(gòu)，其形態(tài)穩(wěn)定且大小不均一。其中暹羅炭疽菌和隱秘炭疽菌菌株中有一定數(shù)量的分生孢子會(huì)產(chǎn)生多個(gè)附著胞，隱秘炭疽菌的附著胞芽管偏短。

(a)菌落形態(tài)特征；(b)孢子形態(tài)特征；(c)附著胞形態(tài)特征。(a) Morphological characteristics of colony; (b) Morphological characteristics of conidia; (c) Morphological characteristics appressorium.圖2 暹羅炭疽菌形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of C.siamense

(a)菌落形態(tài)特征；(b)孢子形態(tài)特征；(c)附著胞形態(tài)特征。(a) Morphological characteristics of colony; (b) Morphological characteristics of conidia; (c) Morphological characteristics appressorium.圖3 隱秘炭疽菌形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of C.aenigma

(a)菌落形態(tài)特征；(b)孢子形態(tài)特征；(c)附著胞形態(tài)特征。(a) Morphological characteristics of colony; (b) Morphological characteristics of conidia; (c) Morphological characteristics appressorium.圖4 果生刺盤孢菌形態(tài)特征Fig.4 Morphological characteristics of C.fructicola

2.2.2病原菌多基因序列聯(lián)合鑒定

提取真菌基因組DNA后，采用真菌ITS1和ITS4通用引物序列，成功從不同菌株DNA樣品中獲得DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。以rDNA-ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明，分離純化的109個(gè)菌株中有30個(gè)菌株歸類于膠孢炭疽菌復(fù)合種。30個(gè)膠孢炭疽菌復(fù)合種可根據(jù)不同菌株形態(tài)特征分為3類。從3類菌株中各選1株代表菌株SCD26、LND07和SCD15進(jìn)行多基因序列鑒定，構(gòu)建膠孢炭疽菌的多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖5)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠孢炭疽菌代表菌株聚類為3個(gè)分支，其中SCD26病原菌聚類于暹羅炭疽菌；LND07病原菌聚類于隱秘炭疽菌；SCD15病原菌聚類于果生刺盤孢菌。

SCD15、SCD26和LND07為膠孢炭疽菌復(fù)合種代表菌株。SCD15, SCD26 and LND07 are representative strains of C.gloeosporioides complex.圖5 膠孢炭疽菌復(fù)合種多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of the C.gloeosporioides complex based on multi-gene combination

2.3 草莓炭疽根腐病病原菌致病性試驗(yàn)

通過(guò)對(duì)代表性菌株隱秘炭疽菌、果生刺盤孢菌和暹羅炭疽菌進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在接種隱秘炭疽菌第9天、接種果生刺盤孢菌和暹羅炭疽菌第12和13天時(shí)草莓葉片開(kāi)始發(fā)黃萎蔫，3種炭疽菌引起的病害程度差異顯著。其中隱秘炭疽菌病情指數(shù)與致死率分別為82.2和66.7%，顯著高于果生刺盤孢菌和暹羅炭疽菌。隱秘炭疽菌發(fā)病較快，引起病害較重。本研究采用葉片噴霧法接種病原菌，但在感染病原菌早期，草莓葉片并沒(méi)有出現(xiàn)病斑，只出現(xiàn)葉片發(fā)黃萎蔫直到枯死，切開(kāi)草莓短縮莖，其橫截面出現(xiàn)大面積壞死褐變。隱秘炭疽菌感染的草莓，從短縮莖一側(cè)向髓感染(圖7(c))，而果生刺盤孢菌(圖8(c))和暹羅炭疽菌(圖6(c))感染的草莓，短縮莖髓處優(yōu)先發(fā)病。按柯赫氏法則，將上述感病草莓進(jìn)行組織分離，病原菌純化，鑒定其病原菌為暹羅炭疽菌、隱秘炭疽菌與果生刺盤孢菌，與最初各接種的病原菌相同，即完成了柯赫氏法則。

(a)接種第1天；(b)接種第18天；(c)患病植株根頸橫截面。(a) Day 1 of inoculation; (b) Day 18 of inoculation; (c) Cross section of rhizome of diseased plants.圖6 暹羅炭疽菌致病性測(cè)定Fig.6 Determination of pathogenicity of C.siamense

(a)接種第1天；(b)接種第18天；(c)患病植株根頸橫截面。(a) Day 1 of inoculation; (b) Day 18 of inoculation; (c) Cross section of rhizome of diseased plants.圖7 隱秘炭疽菌致病性測(cè)定Fig.7 Determination of pathogenicity of C.aenigma

(a)接種第1天；(b)接種第18天；(c)患病植株根頸橫截面。(a) Day 1 of inoculation; (b) Day 18 of inoculation; (c) Cross section of rhizome of diseased plants.圖8 果生刺盤孢炭疽菌致病性測(cè)定Fig.8 Determination of pathogenicity of C.fructicola

3 討論與結(jié)論

3.1 多基因聯(lián)合鑒定的必要性

草莓整個(gè)生育期都可發(fā)生炭疽根腐病。在草莓育苗期和定植初期，發(fā)病率可高達(dá)90%以上，給健康草莓苗的繁育造成巨大破壞[21]。草莓炭疽病的鑒定對(duì)該病害的防治有重要的參考價(jià)值。由于病原菌菌落形態(tài)特征穩(wěn)定性差且易受培養(yǎng)條件影響，單獨(dú)依靠形態(tài)特征進(jìn)行系統(tǒng)分析是不可靠的[22]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因序列鑒定成為一種常用的手段。目前草莓炭疽病的分類依據(jù)主要結(jié)合于前人的分類系統(tǒng)，以分生孢子和附著胞的形態(tài)特征、大小、純培養(yǎng)特征以及ITS基因序列進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)確定其歸屬。但是僅用1種基因的測(cè)序結(jié)果，一些親緣關(guān)系較近的種仍不能進(jìn)行有效區(qū)分，所以需要使用多基因序列進(jìn)行物種進(jìn)化的研究[23]。目前用于炭疽病鑒定分類的常用基因有ITS(核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))、TUB2(β-微管蛋白2)、ACT(肌動(dòng)蛋白)、GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)、CHS(幾丁質(zhì)合成酶)和CAL(鈣調(diào)蛋白)等。Weir等[20]通過(guò)多基因聯(lián)合建樹(shù)的方法將膠孢炭疽菌復(fù)合種劃分為22個(gè)種和1個(gè)亞種；宋麗麗等[24]利用多基因聯(lián)合建樹(shù)法對(duì)分離自上海和安徽的6個(gè)草莓炭疽菌菌株進(jìn)行分子鑒定，發(fā)現(xiàn)這6個(gè)炭疽菌菌株均為果生刺盤孢菌；韓永超等[25]通過(guò)多基因聯(lián)合分析明確了引起武漢地區(qū)草莓根頸腐病的病原為膠孢炭疽菌復(fù)合種內(nèi)的暹羅炭疽菌；張方博[26]通過(guò)對(duì)草莓根腐病研究也發(fā)現(xiàn)，暹羅炭疽菌是草莓根腐病病原之一；Zhang等[27]對(duì)草莓炭疽病進(jìn)行多基因聯(lián)合鑒定發(fā)現(xiàn)隱秘炭疽菌也屬于膠孢炭疽菌復(fù)合種。本研究發(fā)現(xiàn)草莓膠孢炭疽復(fù)合種目前包含3個(gè)小種即暹羅炭疽菌、隱秘炭疽菌和果生刺盤孢菌，與前人研究結(jié)果一致。

3.2 草莓炭疽根腐病優(yōu)勢(shì)菌種分析

同一寄主的炭疽病病原菌菌株之間，致病力存在差異。馮樂(lè)樂(lè)等[23]對(duì)浙江省鮮食大豆炭疽病病原平頭炭疽菌進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)分離出的9株病原菌株雖同屬于平頭炭疽菌，但致病力卻不同。郭艷春等[28]認(rèn)為不同地區(qū)引起黃麻炭疽病的病原菌致病能力也不同。草莓膠孢炭疽菌復(fù)合種下的暹羅炭疽菌、隱秘炭疽菌和果生刺盤孢菌可在不同程度上引起草莓根部腐爛、地上部萎蔫和干枯等癥狀。Chen等[29]認(rèn)為果生刺盤孢菌為浙江地區(qū)草莓炭疽菌的優(yōu)勢(shì)菌株，其致病力是膠孢炭疽菌復(fù)合種中最強(qiáng)的；Zhang等[27]研究結(jié)果表明在中國(guó)東部草莓栽培區(qū)中暹羅炭疽菌才是草莓炭疽病的優(yōu)勢(shì)菌株，致病力最強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)隱秘炭疽菌與果生刺盤孢菌和暹羅炭疽菌相比致病力最強(qiáng)。不同地區(qū)氣候、土壤條件、栽培品種以及栽培措施不同可能造成草莓炭疽根腐病病原菌優(yōu)勢(shì)種不同，具體是由于何種原因?qū)е聝?yōu)勢(shì)菌株不同，還有待進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)廣泛采集全國(guó)不同草莓主產(chǎn)區(qū)根部腐爛樣品發(fā)現(xiàn)，有27.5%的樣品是由膠孢炭疽菌復(fù)合種引起。膠孢炭疽菌復(fù)合種可分為3種生理小種，分別為隱秘炭疽菌、果生刺盤孢菌和暹羅炭疽菌，其中隱秘炭疽菌發(fā)病較快，引起的病癥較為嚴(yán)重。本研究還分離出43.4%的尖孢鐮刀菌?；?Fusariumoxysporumf. sp.fragariae)、11.1%的擬盤多毛孢(Neopestalotiopsisclavispora)以及其他病原菌，這些病原菌都可以加重草莓根腐病的發(fā)生。此外，關(guān)于草莓炭疽根腐病病原菌如何與其他病原菌復(fù)合侵染引起草莓病害也需進(jìn)一步研究。