壺瓶碎米薺多糖的提取、分離及抗氧化活性研究

李美東，黃秀芳，羅 凱

（湖北民族大學生物科學與技術學院 湖北 恩施 445000）

多糖 （Polysaccharide） 是由大量通過糖苷鍵（α-或β-） 脫水聚合相互連接而成的單糖殘基組成的一種生物大分子物質[1]。自然界中，幾乎所有活的生物體中都含有多糖。人們習慣上把從生物體中提取的并通過研究證明具有一定生理活性的多糖稱為生物活性多糖 （Bioactive polysaccharides）。近年來，由于人們日常生活水平的提高和對身體健康知識的逐步了解，生物活性多糖因本身的低毒性、廣泛性和高效性等特點而被作為營養(yǎng)補充劑被大量的研究。多糖的生物活性主要包括增強免疫調節(jié)[2-3]、抗氧化[4-5]、抗病毒[6-7]、抗腫瘤[8-9]、降血糖[10]、降血脂[11]、抗凝血[12]等。

壺瓶碎米薺（Cardamine hupingshanensis），十字花科碎米薺屬，別名雀兒菜、白帶草，1年到2年生草本植物，常見于海拔1 km 以下的低地草叢中，在全中國分布廣泛[13]。壺瓶碎米薺具有較強富硒能力?，F(xiàn)有研究中，對碎米薺屬的基因組學研究主要有：①基因組學研究，如：Bleeker 等[14]對德國的碎米薺種屬的DNA 序列進行研究，得出結論：此種碎米薺是來自于亞洲的物種；②蛋白質組學研究，如：Both 等[15]通過檢測壺瓶碎米薺中的無機硒、有機硒，得出壺瓶碎米薺生物體內無機硒占20%，有機硒以硒代半胱氨酸和硒代甲硫氨酸的形式存在；③硒耐受能力測試[16-17]，Zhou 等[2]從壺瓶碎米薺中組裝48 989 個單基因，分別在根和葉中表達39 579 個和33 510 個。通過差異表達分析鑒定出位于4 個不同路徑中的25 個基因，這些路徑對壺瓶碎米薺中的亞硒酸鹽有顯著響應；④品種改良[18]等方面研究。

本試驗中采用超聲波與酶輔助提取壺瓶碎米薺多糖，采用Sevag 法除蛋白，通過DEAE-52 纖維素分級醇沉，采用Sephadex G-100 和紫外光譜法進行純度鑒定，并研究其體外抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壺瓶碎米薺，采自湖北省恩施市新塘鄉(xiāng)漁塘壩。自然風干后粉碎過100 目篩，貯存于試劑瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

纖維素酶、標準葡萄糖、DEAE-52 纖維素、Sephadex G-100 葡聚糖、乙醇、苯酚、硫酸、三氯甲烷、正丁醇均為分析純級。

1.2 儀器與設備

Nicolet iS5 紅外分析儀，賽默飛世爾公司；KQ5200 型超聲波儀，北京中儀匯豐科技有限公司；BS-100A 自動部分收集器、HL-2 恒流泵，北京佳航博創(chuàng)科技有限公司；BC-W203 旋轉蒸發(fā)儀，上海耀特儀器設備有限公司；真空冷凍干燥箱，上海啟前電子科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取 稱取1.0 g 壺瓶碎米薺粉末，適當條件下經(jīng)超聲波、酶處理后進行熱水提取，收集濾液后，4 000 r/min 離心15 min，旋轉蒸發(fā)，加入95%乙醇4 ℃醇沉至少10 h，4 000 r/min 離心10 min，冷凍干燥得到壺瓶碎米薺粗多糖。

1.3.2 單因素實驗設計 液料比：15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1；纖維素酶添加量：0%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%；超聲波時間：10，15，20，25，30 min；提取時間：30，60，90，120，150 min；提取溫 度：60，70，80，90，100 ℃。

1.3.3 響應面試驗設計 根據(jù)單因素實驗結果，選擇料液比、纖維素酶添加量、超聲波時間、提取時間、提取溫度為考察因素，以碎米薺多糖得率為考察目標，利用Design-Expert.V8.0.6 軟件進行5 因素3 水平的響應面試驗設計，因素水平表見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Level table of experimental factors for response surface

1.3.4 多糖含量的測定 多糖含量測定均使用苯酚-硫酸法[19]。以葡萄糖為標準品，葡萄糖濃度為橫坐標（x），吸光度為縱坐標（y），測得標準曲線為y=0.0089x-0.0003，R2=0.9961。

1.3.5 除蛋白

1.3.5.1 蛋白質含量測定 以牛血清白蛋白為標準品，牛血清白蛋白濃度為橫坐標（x），吸光度為縱坐標（y），測得標準曲線為y=0.006x+0.0085，R2=0.9979。

1.3.5.2 方法 Sevag 法：將正丁醇與三氯甲烷按照1∶4 的體積比配制Sevag 試劑，將壺瓶碎米薺粗多糖溶液與sevag 試劑以4∶1 的體積比混合后，封口，置于搖床上劇烈振蕩30 min 后，轉置于分液漏斗中靜置30 min。收集上層液，待用。

1.3.6 分級 將DEAE-52 纖維素層析柱用去離子水平衡，將樣品溶液上樣至層析柱中，以0，0.1，0.2，0.4，0.7 mol/L 的NaCl 溶液進行洗脫，流速為1 mL/min，每管收集10 mL，多糖濃度由苯酚-硫酸法在波長490 nm 處測定，以管數(shù)為橫坐標（x），吸光度為縱坐標（y）繪制曲線。

1.3.7 純度鑒定 將Sephadex G-100 層析柱用去離子水平衡，將樣品溶液上樣至層析柱中，用蒸餾水洗脫，流速為0.1 mL/min，每管收集2 mL，多糖濃度由苯酚-硫酸法在波長490 nm 處測定，以管數(shù)為橫坐標（x），吸光度為縱坐標（y）繪制曲線。

1.3.8 體外抗氧化能力測定

1.3.8.1 ABTS 自由基清除能力測定 參考文獻[20]的方法，并對試驗步驟稍作修改。配制0.007 mol/L 的ABTS 溶液和0.14 mol/L 的過硫酸鉀溶液，按1∶1（體積比）混合后在25 ℃下避光反應12 h，為ABTS 自由基儲備液。使用PBS（pH 7.4）將儲備液在波長734 nm 處的吸光值調整為0.70±0.02，備用。取不同濃度的壺瓶碎米薺粗多糖溶液1 mL（空白組取等量的純水），加3 mL 調整吸光值后的儲備液，于暗處反應1 h，在波長734 nm 處測定其吸光度，VC 作為陽性對照，每組重復3 次。

1.3.8.2 羥基自由基清除能力測定 參考文獻[21]的方法，并對試驗步驟稍作修改。量取不同濃度的壺瓶碎米薺粗多糖溶液1 mL 于具塞試管中（空白組取等量的純水），加入2 mL 3 mmol/L 硫酸亞鐵溶液和1.5 mL 1.8 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液，再加入0.1 mL 0.03%H2O2溶液啟動反應，在37 ℃下水浴30 min 后，在波長510 nm 處測定吸光值，VC作為陽性對照，每組重復3 次。

1.3.8.3 總還原能力測定 參考文獻[22]的方法，并對試驗步驟稍作修改。量取不同濃度的壺瓶碎米薺粗多糖溶液1 mL 于具塞試管中（空白組取等量的純水），加入1.0 mL 1.0 mol/L pH 6.6 PBS 和2.5 mL 1%K3[Fe（CN）6]溶液，50 ℃下水浴20 min，冷卻后向其中加入2.0 mL 10%TCA 溶液，5 000 r/min 離心5 min 后，取2.5 mL 上層清液，再加入2.5 mL 超純水和0.5 mL 1%FeCl3溶液，混勻后在波長700 nm 處測定吸光值，VC 作為陽性對照，每組重復3 次。

1.4 統(tǒng)計分析

所有試驗重復3 次，統(tǒng)計結果均為平均值。響應面試驗利用Design-Expert.V8.0.6 軟件進行分析，細胞學試驗利用SPSS 24 軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 液料比對壺瓶碎米薺多糖得率的影響 在植物多糖提取過程中，原料與溶劑的比例是十分關鍵的參數(shù)，本試驗探究了不同液料比對碎米薺多糖得率的影響，所得結果如圖1a 所示。結果表明，當提取溶劑用量達到300 mL，原料為10 g 時，碎米薺多糖的得率達到最大值，若繼續(xù)增加溶劑用量，壺瓶碎米薺多糖的得率反而呈緩慢下降的趨勢。分析其原因可能是當液料比達到30∶1 時，糖類物質已基本溶出，再增加溶劑的用量，使多糖的損失率提高，因此，確定液料比為30∶1 比較合適。

圖1 單因素實驗結果Fig.1 Single factor experiment results

2.1.2 纖維素酶添加量對壺瓶碎米薺多糖得率的影響 植物體內含有大量的纖維素，利用適量的纖維素酶對植物原料進行處理，能提高多糖的得率。本試驗探究了纖維素酶添加量對碎米薺多糖得率的影響規(guī)律，結果如圖1b 所示。結果表明，添加纖維素酶能明顯提高多糖得率，而且隨著添加量的增加，多糖得率也在增加，在2.5%時最大。

2.1.3 提取時間對壺瓶碎米薺多糖得率影響 提取時間作為提取多糖的另一個重要的影響因素，本試驗對不同提取時間下壺瓶碎米薺多糖的得率進行探究，結果如圖1c 所示。結果表明，隨著提取時間的延長，多糖得率在逐漸上升，然而多糖的絕對增長量不高，在考慮到節(jié)約時間成本的情況下，選擇120 min 比較合適。

2.1.4 提取溫度對壺瓶碎米薺多糖得率影響 提取溫度是對多糖得率的一個重要的影響因素，本試驗探究不同提取溫度對壺瓶碎米薺多糖得率的影響，結果如圖1d 所示。結果表明，隨著溫度的升高，多糖得率在逐漸上升，在80～90 ℃之間，多糖量有一個大的提升，故選擇90 ℃比較合適。

2.1.5 超聲波時間對壺瓶碎米薺多糖得率的影響 超聲波通過對細胞膜通透性的改變和破壞，能刺激細胞將細胞液內物質釋放，因此能夠有利于植物細胞中生物活性物質的提取，本試驗探究了不同超聲時間對碎米薺多糖得率的影響規(guī)律，結果如圖1e 所示。結果表明，隨著超聲時間的逐漸延長，碎米薺多糖的得率呈先上升后下降的趨勢，在超聲時間到20 min 時達到最大值，此時繼續(xù)增加超聲時間，碎米薺多糖得率呈下降趨勢。分析其原因可能是超聲時間過長，溶液溫度也變高，導致多糖類物質穩(wěn)定性下降，部分被氧化，得率降低。因此，超聲時間選擇20 min 為宜。

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面分析 根據(jù)Design-Expert 軟件中的Box-Behnken 進行響應面設計，料液比、纖維素酶添加量、超聲時間、提取溫度、提取時間為響應面因變量，碎米薺粗多糖為響應值，進行響應面試驗。所得試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.2.2 回歸模型的方差分析 如表2所示，BBD設計試驗進行了46 次，以優(yōu)化5 個單獨的提取參數(shù)。結果表明，在以下試驗條件下能取得最大收益：料液比1∶30，超聲時間24.80 min，纖維素酶添加量2%，提取溫度90 ℃，提取時間120 min，多糖提取量為44.54 mg/g。通過對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，響應值與變量之間以下列二階多項式方程式關聯(lián)：

Y=5.44+0.25A-0.12B-0.21C-0.024D-0.31E-0.048AB+0.047AC-0.012AD+0.20AE+0.11BC-0.076BD-0.0021BE-0.16CD-0.37CE+0.30DE-0.49A2-0.34B2-0.42C2-0.37D2-0.23E2

式中，Y——多糖的質量（mg）；A，B，C，D，E——液料比、超聲波時間、纖維素酶酶量、提取溫度、提取時間。

把響應面分析所得數(shù)學模型進行方差分析，以檢驗方程的有效性，回歸模型的方差分析如表3所示。通常模型中有較高的F 值和較低的P 值會使模型更加的顯著，在本試驗中二次回歸模型的F=5.013，P＜0.01，表明模型極顯著；失擬項是所得數(shù)學模型中的數(shù)據(jù)變異，本試驗中失擬項F=0.4739，P＞0.05，表示模型無失擬項的存在，已然能充分說明實際情況，回歸模型是合適的。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

為了更直觀的預測自變量與響應值的關系，使用Design-Expert 繪制出如圖2所示的3D 響應圖和輪廓圖，這些圖能明顯的看出各個變量之間兩兩存在的聯(lián)系。由圖可知，兩兩因素交互在可選范圍內均有最大值。從圖2中AB 交互項3D 輪廓圖中分析可知，在其它因素都恒定時，隨著超聲波時間的延長，提取壺瓶碎米薺多糖量先增加后下降，液料比同之，說明在這兩個因素的交互作用下，多糖提取有最大值，同時等高線圖形為橢圓形，曲面陡峭，說明這兩個因素交互時有顯著影響。同理可分析其它因素之間的顯著性。

圖2 各因素交互作用響應面與等高線圖Fig.2 Response surface and contour map of the interaction of various factors

使用此模型方程對各因素選擇最佳條件：液料比30∶1，超聲時間24.80 min，纖維素酶添加量2%，提取溫度90 ℃，提取時間120 min，多糖提取量為44.54 mg/g。為了驗證預測結果不偏離試驗值且能正常實施，將最佳條件修改為：液料比30∶1，超聲時間25 min，纖維素酶添加量2%，提取溫度90 ℃，提取時間120 min，并進行驗證試驗。測得實際值為48.53 mg/g，與預期并無顯著性差異，說明此設計可用于超聲波酶法提取壺瓶碎米薺粗多糖的預測和分析。

2.3 除蛋白結果

通過重復使用Svage 法對壺瓶碎米薺多糖溶液進行除蛋白，在每次步驟完成后對溶液的蛋白質含量以及多糖含量進行測定，根據(jù)標準曲線計算，得到如圖3所示的蛋白去除率和多糖保留率圖。從圖中可知，隨著使用Svage 法次數(shù)的增加，蛋白質含量明顯降低，然而多糖的損耗也隨之增多，到第8 次時蛋白質的去除率趨于平緩，而多糖的損耗量卻沒變化，故選擇使用Svage 法除蛋白7次。

圖3 蛋白去除率和多糖保留率Fig.3 Protein removal rate and polysaccharide retention rate

2.4 碎米薺多糖純化工藝

由圖4可知，在第30～37 管處出現(xiàn)了第1 個峰，第48～58 管處出現(xiàn)了第2 個峰，第70～79 管處出現(xiàn)了第3 個峰，第96～102 管處出現(xiàn)了第4 個峰，且這4 處峰都比較對稱，證明利用NaCl 溶液濃度梯度洗脫能將壺瓶碎米薺多糖較好的分離，將4 種組分分別命名為CHP-1、CHP-2、CHP-3、CHP-4。

圖4 DEAE-52 纖維素層析柱試驗結果Fig.4 Experimental results of DEAE-52 cellulose column

2.5 純度鑒定結果

由圖5可得，4 種組分經(jīng)Sephadex G-100 層析柱洗脫后呈現(xiàn)單一且對稱的峰，說明純化過后的各組分壺瓶碎米薺多糖相對分子質量較均勻且純度較高。

圖5 Sephadex G-100 層析柱洗脫曲線Fig.5 Experimental results of Sephadex G-100 column

2.6 抗氧化試驗結果

2.6.1 ABTS 自由基清除能力測定 ABTS 自由基清除能力通常作為抗氧化物質的總抗氧化能力測定的指標。不同質量濃度的壺瓶碎米薺粗多糖對ABTS 自由基清除率如圖6a 所示。結果顯示，壺瓶碎米薺粗多糖的質量濃度與ABTS 自由基清除率呈正相關，隨著壺瓶碎米薺粗多糖質量濃度的升高，對ABTS 自由基的清除率也隨之升高；在相同質量濃度下，壺瓶碎米薺粗多糖的清除能力遠小于VC。

2.6.2 羥基自由基清除能力測定 羥基自由基在所有自由基中具有最強的氧化能力，人體內產(chǎn)生大量的羥基自由基，會對機體中的生物大分子（蛋白質、脂質、核酸）造成嚴重的破壞，嚴重會導致細胞產(chǎn)生癌變[23]。不同質量濃度的壺瓶碎米薺粗多糖對氧基自由基的清除率如圖6b 所示。結果顯示，壺瓶碎米薺粗多糖的質量濃度與羥基自由基的清除率呈正相關，并且隨著濃度的升高，清除能力也越來越強；而對羥基自由基的清除能力還是遠小于同質量濃度的VC。

2.6.3 總還原能力測定 通過不同質量濃度的壺瓶碎米薺粗多糖對總還原力的測定，結果如圖6c所示。結果顯示，壺瓶碎米薺粗多糖的質量濃度與總還原力呈正相關，并且隨著質量濃度的升高，還原能力也越強；而還原能力還是遠小于同質量濃度的VC。

圖6 抗氧化活性試驗結果Fig.6 Antioxidant capacity test results

3 結論

通過單因素實驗及響應面試驗結果，得到壺瓶碎米薺最佳的提取工藝：液料比30∶1，超聲時間25 min，纖維素酶添加量2%，提取溫度90 ℃，提取時間120 min，并進行驗證試驗，測得實際值為48.53 mg/g，與預期并無顯著性差異。通過對Svage 法除蛋白次數(shù)的簡單探究，得到使用Svage法7 次能使蛋白的去除率達到最大的同時多糖損失率最小。通過DEAE-52 纖維素柱層析柱對多糖溶液濃度梯度洗脫，可得到4 種組分多糖（CHP-1、CHP-2、CHP-3、CHP-4），并通過Sephadex G-100 層析柱驗證其純度，壺瓶碎米薺粗多糖具有較好的體外抗氧化活性。