豆大薊馬鈉離子通道基因克隆及分析

潘雪蓮，楊 磊，袁琳琳，陳龍威，吳少英

（1.海南大學(xué) 三亞南繁研究院，海南 三亞 572024; 2.海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228;3.崖州灣科技城，海南 三亞 572024）

海南島地處熱帶，屬熱帶季風(fēng)氣候，除中部山區(qū)外，年均氣溫為23～26 ℃，是天然溫室。同時，海南大部分地區(qū)年降雨量都超過1 700 mm，良好的水熱條件，非常適合各類農(nóng)作物的種植[1]。海南是我國最早實(shí)現(xiàn)“南菜北運(yùn)”的省份，豇豆(Vigna unguiculata)就是其中尤為重要的一種[2?3]，作為海南農(nóng)民增產(chǎn)提收最重要的蔬菜品種，從2009—2020年，豇豆的種植面積不斷增加，并達(dá)到了2.25萬hm2，總產(chǎn)量為58萬t，約占海南省蔬菜總產(chǎn)量的1/10[4?5]。但隨著豇豆種植面積的逐年增加，病蟲害的發(fā)生也逐年加重。豆大薊馬(Megalurothrips usitatus)是豆科作物的一種毀滅性害蟲，嚴(yán)重危害豇豆品質(zhì)和產(chǎn)量[6?7]。該蟲又名豆花薊馬或普通大薊馬，屬纓翅目薊馬科，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，其寄主植物主要為豆科類作物[6]。豆大薊馬生長周期短、繁殖力強(qiáng)、隱匿性強(qiáng)，世代重疊嚴(yán)重，因此，極易在短時間內(nèi)大面積爆發(fā)[8]。豆大薊馬為銼吸式口器，其在取食過程刺穿植物組織并吸取植物汁液，造成豇豆葉片皺縮和畸形，嚴(yán)重時會造成生長點(diǎn)萎縮，生長緩慢甚至停止，莢果受害果實(shí)表面會變得粗糙或者瘢痕，降低豇豆的果實(shí)質(zhì)量[9?10]。此外，該蟲還可以傳播植物病毒病，從而對豇豆造成間接危害。目前，其防治仍然以化學(xué)防治為主[11]。擬除蟲菊酯為一類作用于昆蟲鈉離子通道（Nav）的廣譜性殺蟲劑，具有易降解等優(yōu)點(diǎn)，因此在田間已經(jīng)大面積應(yīng)用。其通過延長Nav開放時間使動作電位升高，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞重復(fù)放電，從而實(shí)現(xiàn)殺蟲的目的[12]。近年來，隨著田間用藥量的成倍增加，豆大薊馬對擬除蟲菊酯類藥劑的抗藥性不斷增強(qiáng)[12]。其產(chǎn)生抗藥性的主要原因之一是Nav發(fā)生抗性突變，從而影響藥劑與Nav的結(jié)合能力，導(dǎo)致敏感性降低進(jìn)而產(chǎn)生抗藥性[13?14]。昆蟲Nav由α亞基和β亞基組成，α亞基由4個同源結(jié)構(gòu)域組成，每個同源結(jié)構(gòu)域含有6個跨膜片段，其中，S1～S4稱為電壓傳感模塊，而S5和S6區(qū)域稱為P區(qū)，β亞基輔助α亞基調(diào)控 Nav 表達(dá)[14?16]。

本研究組前期的研究表明，海南省豆大薊馬田間種群對擬除蟲菊酯類殺蟲劑已經(jīng)產(chǎn)生了抗性，但對于豆大薊馬鈉離子通道結(jié)構(gòu)與功能仍不清楚。因此，本研究對豆大薊馬鈉離子通道基因（MuNav）進(jìn)行克隆和序列分析，旨在為后續(xù)解析豆大薊馬對擬除蟲菊酯抗性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx豆大薊馬于2018年12月采自海南省海口市美蘭區(qū)海南大學(xué)海甸校區(qū)基地，并在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)長期飼養(yǎng)，期間未施用任何藥劑。飼養(yǎng)方法如下：將豆大薊馬成蟲及若蟲轉(zhuǎn)移至240 mL養(yǎng)蟲罐中，將新鮮豇豆洗凈，切成長度約5 cm的豆莢放入20%蜂蜜水中浸泡1 min，晾干，放入養(yǎng)蟲罐中，置于人工氣候箱（PYX-400Q-A，廣東韶關(guān)科力實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）中飼養(yǎng)。成若蟲的飼養(yǎng)溫度為26 ℃，濕度為60 %～65 %，光周期16 L∶8 D。

1.2 PCR擴(kuò)增取豆大薊馬成蟲30～40頭，通過Trizol法提取RNA，并用1 %的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳。隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，方法參照Prime ScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit（東洋紡生物科技有限公司，上海）說明書。根據(jù)NCBI西花薊馬（Frankliniella occidentalis）（XM_026422864.1）和棕櫚薊馬（Thrips palmi）（XM_034385472.1）Nav序列，使用Primer 5軟件對MuNav進(jìn)行通用引物設(shè)計，正向引物為：ATGCCGAGTGTCCGGGAGTCG，反向引物為：TCAGACATCCGCAAGGGCCGGAG。以上述cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：cDNA 1 μL、dNTP Mix 1 μL、上下游引物各2 μL、ddH2O 18 μL、2×Phanta Max Buffer (Mg2+plus)25 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Ploymerase 1 μL。PCR 反應(yīng)條件如下：95 ℃ 預(yù)變性 3 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 延伸 6.5 min，共 35 個循環(huán)；72 ℃反應(yīng)后延伸8 min。

1.3 PCR產(chǎn)物回收及連接轉(zhuǎn)化用Cycle-Pure Kit（OMEGA, America）將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，用NanoDrop 2000分光光度計（賽默飛世爾科技(中國)有限公司，上海，中國）對回收產(chǎn)物進(jìn)行濃度測定，并置于?20 ℃?zhèn)溆谩７謩e用HindⅢ-HF和X maⅠ對PGH 19進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)時間為2 h，溫度為37 ℃，將純化回收產(chǎn)物和PGH 19鏈接，反應(yīng)條件為：37 ℃、45 min，取出后在冰上冷卻5 min，將連接好的產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞stbl 2中并涂板，方法參照stbl 2感受態(tài)細(xì)胞（吐露港生物科技有限公司，上海）說明書，將平板倒置在22 ℃的保溫箱中培養(yǎng)。在96孔板每孔中加入200 μL LA培養(yǎng)基，并挑取單克隆置于其中，密封后180 r·min?1，30 ℃ 搖菌 12 h。取 50 μL 菌液加入 5 mL LA 培養(yǎng)基中于 30 ℃、180 r·min?12 次搖菌 16 h，使用 Plasmid mini Kit（OMEGA, America）試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，并進(jìn)行測序。

1.4 序列分析及進(jìn)化樹構(gòu)建克隆得到MuNav全長，并上傳至NCBI（GenBank accession number:MZ043856），用Simple Modular Architecture Research Tool預(yù)測其保守性結(jié)構(gòu)域。同時，從NCBI上下載得到其他58種昆蟲的Nav全長（表1）。隨后，用Clustal Omega軟件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進(jìn)行多序列比對，并利用Mega 7(DNASTAR, America)軟件，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉值設(shè)置為1 000。

表1 進(jìn)化樹分析 Nav NCBI 序列號

續(xù)表1

2 結(jié)果與分析

2.1 豆大薊馬電壓門控鈉離子通道基因克隆及序列分析克隆得到MuNav，其全長為6 279 bp，編碼 2 093 aa (GenBank：MZ043856) （圖1），含有4個同源結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域 Ⅰ~Ⅳ，每個同源結(jié)構(gòu)域含有6個跨膜片段，第3和第4結(jié)構(gòu)域之間含有“MFM”疏水性殘基，符合昆蟲Nav的典型特征（圖2）。

將MuNav的氨基酸序列與西花薊馬、棕櫚薊馬、綠盲蝽（Apolygus lucorum）、美洲大蠊（Periplaneta americana）Nav進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)其與棕櫚薊馬Nav序列的相似度高達(dá)94.88%，與西花薊馬Nav序列的相似度同樣高達(dá)94.68%，而與美洲大蠊和綠盲蝽Nav的相似度分別僅為80.74%和80.19%，表明豆大薊馬與薊馬類昆蟲的親緣關(guān)系較近，而與其他目昆蟲則發(fā)生了分化(圖3)。

2.2 豆大薊馬鈉離子通道系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)化樹的結(jié)果表明（圖4），MuNav與其他昆蟲均存在一定的親緣關(guān)系。其中，豆大薊馬與棕櫚薊馬（T.palmi）、煙薊馬（Thrips tabaci） 和西花薊馬聚為一類，顯示薊馬類昆蟲Nav符合進(jìn)化過程，即同一類昆蟲聚類在相近位置。反之，豆大薊馬與其他目的昆蟲，如黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）、德國小蠊（Blattella germanica）、綠盲蝽等則發(fā)生了較大程度的分化，親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

3 討 論

大部分昆蟲僅編碼1條或2條Nav，昆蟲Nav由1個分子量約為260 kD的α亞基和5個輔助小亞基組成，α亞基具有Nav活性，而輔助小亞基則起到調(diào)節(jié)Nav表達(dá)的作用。本研究通過PCR的方法克隆得到了MuNav全長序列，發(fā)現(xiàn)其與其他昆蟲Nav結(jié)構(gòu)類似，有4個同源性極高的跨膜結(jié)構(gòu)域，即結(jié)構(gòu)域I、結(jié)構(gòu)域II、結(jié)構(gòu)域III和結(jié)構(gòu)域IV組成，且每個結(jié)構(gòu)域均包含6個疏水性跨膜螺旋體（S1～S6）。在MuNav的P-LOOP環(huán)上同樣鑒定到與其他昆蟲類似的4個保守性氨基酸殘基D、 E、 K、A和1個關(guān)鍵失活閥門MFM，這些結(jié)果均表明，MuNav具有昆蟲Nav特有的全部結(jié)構(gòu)特征，這為后續(xù)MuNav功能研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究的序列比對結(jié)果表明，豆大薊馬與其他目昆蟲，如蜚蠊目美洲大蠊和半翅目綠盲蝽Nav的序列相似性均高達(dá)80%以上，這為MuNav功能研究提供了重要參考。值得一提的是，豆大薊馬與其他薊馬類昆蟲序列的相似性極高，如西花薊馬和棕櫚薊馬的序列相似性高達(dá)94%以上，表明纓翅目薊馬類昆蟲Nav的結(jié)構(gòu)與功能極為保守。另外，基于NCBI上獲取得到的59種昆蟲Nav序列，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。與上述序列比對結(jié)果類似，進(jìn)化樹結(jié)果表明雖然昆蟲Nav具有一定的保守性，但豆大薊馬與其他薊馬類昆蟲聚為一類，表明且它們在進(jìn)化過程中極為保守，即發(fā)生的變異較小，而與其他昆蟲則形成了不同的分支，表明它們發(fā)生了一定程度的分化。

昆蟲Nav可通過轉(zhuǎn)錄后修飾，即選擇性剪切和RNA編輯實(shí)現(xiàn)其功能的多樣性[17?18]。RNA編輯是mRNA在轉(zhuǎn)錄水平上通過堿基插入、缺失或替換，從而引起氨基酸改變，擴(kuò)大了生物的遺傳信息，增加Nav結(jié)構(gòu)與功能的多樣性，從而幫助其迅速適應(yīng)外界環(huán)境的變化，其研究在過去的幾年里逐漸得到重視[17,19?20]。昆蟲Nav RNA編輯存在2種形式：一種是腺苷A去氨基轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤I，即A至I編輯，另外一種是U至C編輯。其中A至I的RNA編輯在昆蟲中尤為常見，可導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。如在黑腹果蠅、德國小蠊和綠盲蝽中均被鑒定到，并可引起昆蟲神經(jīng)性興奮[21?23]。昆蟲RNA編輯存在組織特異性，A-I RNA編輯主要發(fā)生在編碼離子通道、神經(jīng)遞質(zhì)受體或G蛋白偶聯(lián)受體的神經(jīng)系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)錄本中[24?25]。例如，在黑腹果蠅鈉通道轉(zhuǎn)錄本中發(fā)現(xiàn)了11個A-I編輯[26]，在擬果蠅中發(fā)現(xiàn)了3個A-I的RNA編輯，分別是Q52R、C189Y和N1260D[27]，而在德國小蠊和綠盲蝽Nav中也分別發(fā)現(xiàn)了2個和1個A-I RNA編輯[21,23]。此外，昆蟲Nav還存在U-C編輯，該類型的RNA編輯一般存在卵巢和腸道中，如黑腹果蠅和德國小蠊體內(nèi)F1919S位點(diǎn)的U-C編輯可產(chǎn)生持續(xù)電流[20]。

近年來，隨著田間用藥量的增加，昆蟲對擬除蟲菊酯的抗藥性不斷增加，Nav突變也越來越頻繁，在很多高抗藥性種群中發(fā)現(xiàn)多個突變位點(diǎn)。大部分昆蟲中最常見的突變發(fā)生在 1 014位點(diǎn)，該位點(diǎn)在家蠅中最早被發(fā)現(xiàn)，由L突變?yōu)镕，使家蠅對氯菊酯的敏感性降低了至少10倍，并且增加了擬除蟲菊酯誘導(dǎo)的鈉尾電流的衰減率[28]。除了家蠅外，在岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）、人蚤（Pulex irritans）、中華按蚊（Anopheles sinensis）、致倦庫蚊Culex quinquefasciatus）等昆蟲中也發(fā)現(xiàn)了L1014 突變[29?32]。除了 1 014 位點(diǎn)外，918 位點(diǎn)氨基酸發(fā)生改變也會影響擬除蟲菊酯藥劑的敏感性。1999年，LEE等[33]對家蠅鈉通道918位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)修飾，用蘇氨酸代替甲硫氨酸，通過雙電極電壓鉗進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其對高濃度的氯氰菊酯完全不敏感。在白紋伊蚊體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了I1532T和F1534S/L，當(dāng)這2個突變單獨(dú)出現(xiàn)時顯著降低了對I型擬除蟲菊酯類藥劑氯菊酯和聯(lián)苯菊酯的敏感性，但是對Ⅱ型擬除蟲菊酯類藥劑敏感性沒有顯著影響[34]。本研究未在MuNav中發(fā)現(xiàn)918和1 014位點(diǎn)突變，但在對序列分析時發(fā)現(xiàn)了T929I突變，其在對擬除蟲菊酯殺蟲劑產(chǎn)生抗性過程中的具體作用還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。

在高抗種群中，突變點(diǎn)往往都不是單個出現(xiàn)的，它們會同時出現(xiàn)2個突變點(diǎn)，大部分情況下該類型突往往比單點(diǎn)突變更高的抗藥性。在蚊子中，Nav中單獨(dú)的N1575Y突變不會改變昆蟲對擬除蟲菊的敏感性，但N1575Y和L1014F雙突變的種群對氯氰菊酯的抗性是野生型的80倍，對溴氰菊酯的抗性是野生型的53倍，相較于單突變分別增加了3.4倍和9.8倍[35]。在煙薊馬中，T929I的單突變會導(dǎo)致煙薊馬對氯氰菊酯產(chǎn)生中等水平抗性，當(dāng)T929I和K1774N雙突變共同出現(xiàn)會導(dǎo)致煙薊馬對氯氰菊酯產(chǎn)生高等水平抗性（RR=2 700）[36]。反之，某些Nav雙突變時，并不會降低鈉通道的抗性，例如在埃及伊蚊體內(nèi)，無論是V1023G/S996P還是V1023G/D1794Y對擬除蟲菊酯的抗性都沒有單一突變體高[37]。此外，有些位點(diǎn)單獨(dú)突變不會改變鈉通道的敏感性，但會顯著降低其他位點(diǎn)對擬除蟲菊酯殺蟲劑的敏感性。例如，蟑螂體內(nèi)E434K和C764R單獨(dú)出現(xiàn)不會改變鈉通道對溴氰菊酯的敏感性，但是E434K或C764R與L993F雙突變時鈉通道對溴氰菊酯的敏感性會降低100倍[38]。除單突變，雙突變外，昆蟲鈉通道有時還會出現(xiàn)三突變，例如在蟑螂Nav中引入V409M突變，可使其對溴氰菊酯的敏感性降低了10倍，而當(dāng)V409M、E434K、C764R 3個突變同時出現(xiàn)時，蟑螂對溴氰菊酯的敏感性降低了100倍[39]。除上述突變類型，昆蟲體內(nèi)Nav突變還會出現(xiàn)連鎖反應(yīng)，在致倦庫蚊中，M943V和I973T就存在著明顯的連鎖反應(yīng)，但是其生理意義還需進(jìn)一步探索[40]。雖然在MuNav中未發(fā)現(xiàn)918和1 014位點(diǎn)突變，但豆大薊馬鈉離子通道出現(xiàn)眾多潛在的抗性位點(diǎn)（未發(fā)表），仍需用雙電極電壓鉗技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究克隆了豆大薊馬鈉離子通道全長序列，不僅擴(kuò)展了昆蟲鈉離子通道的遺傳信息，也為后續(xù)豆大薊馬抗性位點(diǎn)的鑒定，kdr抗性突變位點(diǎn)分子診斷技術(shù)的研發(fā)和探明化學(xué)殺蟲劑與MuNav的結(jié)合能力奠定了基礎(chǔ)，同時為延緩豆大薊馬抗藥性的發(fā)展及抗藥性治理指明了方向。