參萸養(yǎng)心膠囊抗心肌纖維化作用機(jī)制

羅 鋼，楊廷富，楊思進(jìn)，2

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院心血管內(nèi)科（瀘州 646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地建設(shè)單位（瀘州 646000）

心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）現(xiàn)已成為全球?qū)е滤劳龅氖孜灰蛩?。WHO 數(shù)據(jù)顯示，心血管疾病死亡人數(shù)占比高達(dá)31%[1]。心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是大多數(shù)心血管疾病共同的病理特征，主要表現(xiàn)為心肌成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積[2]?，F(xiàn)代研究認(rèn)為過(guò)度心肌纖維化會(huì)誘發(fā)心衰和惡性心律失常等，從而加重患者病情[3-4]。怎樣遏制心肌纖維化進(jìn)展是目前亟需解決的醫(yī)學(xué)難題。然而導(dǎo)致心肌纖維化的原因是多方面的，中醫(yī)藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，在治療心肌纖維化上具有優(yōu)勢(shì)[5-6]。

參萸養(yǎng)心膠囊來(lái)源于張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，由山茱萸、丹參、人參組成。人參大補(bǔ)心之陽(yáng)氣，輔以山茱萸益氣固脫，丹參清心之淤血，使之補(bǔ)而不滯，利于心脈舒縮啟閉之運(yùn)動(dòng)而無(wú)所妨礙。綜全方，益氣養(yǎng)陰補(bǔ)心安神，活血通痹，治療心衰氣虛血瘀證。

綜上，過(guò)度心肌纖維化是心力衰竭發(fā)展到失代償期的最主要病理改變[7]。然而，臨床上參萸養(yǎng)心膠囊對(duì)心衰病人治療效果顯著，可提高患者生活質(zhì)量，減少住院次數(shù)。因此推測(cè)參萸養(yǎng)心膠囊對(duì)心肌纖維化可能具有抑制作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有預(yù)測(cè)分析中藥治療疾病作用機(jī)制的特點(diǎn)，故本研究旨在運(yùn)用此方法探討參萸養(yǎng)心膠囊抗心肌纖維化可能的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用及后續(xù)研究提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 參萸養(yǎng)心膠囊有效成分和靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)中藥計(jì)算系統(tǒng)生物實(shí)驗(yàn)分析數(shù)據(jù)庫(kù)（The tra?ditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Data?Base and Analysis Platform，TCMSP）檢索出參萸養(yǎng)心膠囊中人參、丹參、山茱萸的有效成分。設(shè)定藥物口服利用度≥30%，類藥性指數(shù)≥0.18為篩選條件，獲得相應(yīng)靶點(diǎn)。再通過(guò)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org）對(duì)以上靶點(diǎn)名稱標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 疾病靶點(diǎn)的獲取

以“myocardial fibrosis”進(jìn)行檢索，通過(guò)人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)Genecards（https://www.genecards.org）獲得心肌纖維化相關(guān)靶點(diǎn)，篩選相關(guān)性得分（Relevance score）≥10的靶點(diǎn)。

1.3 參萸養(yǎng)心膠囊治療心肌纖維化的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

以1.1 項(xiàng)獲得的藥物靶點(diǎn)與1.2 項(xiàng)獲得的疾病靶點(diǎn)，通過(guò)Venny 圖（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/ven?ny/）取交集靶點(diǎn)，將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org），設(shè)置種類為“homo sapiens”，置信度蛋白參數(shù)評(píng)分（minimum required interaction score）≥0.7，隱藏孤立靶點(diǎn)后，下載TSV 格式蛋白互作關(guān)系文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建蛋白互作關(guān)系網(wǎng)（Protein-Pro?tein Interaction Networks，PPI），并進(jìn)一步篩選核心靶點(diǎn)和關(guān)鍵靶點(diǎn)。再構(gòu)建“藥物-成分-核心靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，從中獲得參萸養(yǎng)心膠囊治療心肌纖維化的重要成分及關(guān)鍵成分。

1.4 核心靶點(diǎn)的基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/），點(diǎn)擊“Functional Annotation”，在Step1 輸入核心靶點(diǎn)，Step2 選 擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，Step3 選 擇“Gene list”，Step3選擇“Submit List”，在List菜單中選擇“Homo saplens”，則得到GO和KEGG分析結(jié)果。

1.5 關(guān)鍵成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接

從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜查關(guān)鍵成分的結(jié)構(gòu)式，運(yùn)用ChemBioDraw Ultra 14.0軟件制作結(jié)構(gòu)式后復(fù)制到ChemBio3D Ultra 14.0軟件中，構(gòu)建三維文件以mol2 格式保存。PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）下載核心靶點(diǎn)蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，以PDB格式保存。利用Pymol 軟件去水，進(jìn)行蛋白與配體的拆分，將蛋白由pdb 格式轉(zhuǎn)為pdbqt 格式，AutoDockTools 軟件尋找活性口袋，通過(guò)Vina軟件得出對(duì)接分?jǐn)?shù)值來(lái)評(píng)價(jià)其結(jié)合活性，再使用Pymol 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 參萸養(yǎng)心膠囊有效成分和預(yù)測(cè)靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選得到參萸養(yǎng)心膠囊有效成分共102 個(gè)，其中人參22 個(gè)，丹參65 個(gè)，山茱萸20個(gè)，通過(guò)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)名稱標(biāo)準(zhǔn)化后共得到161個(gè)靶點(diǎn)，其中人參94個(gè)，丹參123個(gè)，山茱萸60個(gè)。

2.2 心肌纖維化靶點(diǎn)搜集

通過(guò)Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得心肌纖維化相關(guān)疾病靶點(diǎn)3 116個(gè)，其中相關(guān)性評(píng)分≥10的靶點(diǎn)406個(gè)。

2.3 參萸養(yǎng)心膠囊治療心肌纖維化的潛在靶點(diǎn)篩選

將上述2.1 項(xiàng)得到的藥物靶點(diǎn)和2.2 項(xiàng)相關(guān)性評(píng)分≥10 的疾病靶點(diǎn)通過(guò)Venny 圖進(jìn)行映射得到交集靶點(diǎn)共43個(gè)，即為參萸養(yǎng)心膠囊治療心肌纖維化的潛在作用靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 參萸養(yǎng)心膠囊與心肌纖維化交集靶點(diǎn)韋恩圖Figure 1 Wayne diagram of intersection target of Shenyu Yangxin capsule and myocardial fibrosis

2.4 PPI構(gòu)建和核心成分及靶點(diǎn)篩選

將上述43個(gè)潛在作用靶點(diǎn)上傳至String數(shù)據(jù)平臺(tái)行蛋白互作分析，設(shè)置“homo sapiens”“minimum re?quired interaction score ≥0.7”，隱藏6個(gè)孤立蛋白靶點(diǎn)F7、SCN5A、DPP4、TYR、SLC6A4、NR3C2 后，下載TSV格式蛋白互作關(guān)系文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件，構(gòu)建PPI，見圖2。利用該軟件CytoHubb 插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，根?jù)互作網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)度（degree），以其43個(gè)交集靶點(diǎn)的中位數(shù)及以上為核心靶點(diǎn)，共22 個(gè)，見表1。設(shè)排名前五位為TNF、IL6、IL1B、VEGFA、STAT3，設(shè)它們?yōu)橹匾悬c(diǎn)，再利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建參萸養(yǎng)心膠囊治療心肌纖維化“藥物-成分-核心靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。通過(guò)CytoNCA 插件分析圖2，根據(jù)Degree排名前10的活性成分，如表2所示，前五位為木犀草素（luteolin，Degree=14.0）、山奈酚（kaempferol，Degree=9.0）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，Degree=7.0）、丹參酮IIA（tanshinone iia，Degree=6.0）、人參皂甙Rh2（ginsenoside rh2，Degree=6.0），設(shè)它們?yōu)橹匾煞帧?/p>

圖3 “藥物-成分-核心靶點(diǎn)-疾病”圖Figure 3 “drug ingredient core target disease”diagram

表1 依據(jù)“PPI”中Degree參數(shù)排列前22個(gè)靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)Table 1 The top 22 targets are the core targets according to the degree parameter in“PPI”

表2 “藥物-成分-核心靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中中藥成分“Degree”前十位Table 2 The top ten of ingredient""degree""in""drug ingredient core target disease""network relationship diagram

圖2 交集靶點(diǎn)蛋白互作關(guān)系圖（PPI）Figure 2 Diagram of intersection target protein interaction（PPI）

2.5 核心靶點(diǎn)富集分析

使用核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)分析，以P <0.05為準(zhǔn)，確定GO條目174個(gè)，包括239條生物學(xué)過(guò)程（Biological process，BP），主要涉及RNA 聚合酶II 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、基因表達(dá)正調(diào)控、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控等；18條細(xì)胞成分（Cell component，CC），主要涉及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域等；17條分子功能（Molec?ular function，MF），主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合等。均取富集基因數(shù)排名前10條作圖，見圖4。

圖4 核心靶點(diǎn)GO富集分析Figure 4 GO enrichment analysis of core targets

核心靶點(diǎn)通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)分析，共得到74 條（P<0.05）KEGG 富集通路，按富集基因數(shù)目排序取前20 條信號(hào)通路展示，見表3 和圖5。分析可知依次是TNF信號(hào)通路、結(jié)核病、癌癥的途徑、弓形蟲病、乙型肝炎、炎癥性腸病、利什曼病、南美錐蟲?。绹?guó)錐蟲?。?、甲型流感、癌癥中的蛋白聚糖、瘧疾、HIF-1信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、麻疹、單純皰疹感染、MAPK信號(hào)通路、非洲錐蟲病、胰腺癌、百日咳、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。

圖5 點(diǎn)KEGG通路富集分析Figure 5 KEGG pathway enrichment analysis

表3 KEGG通路富集分析前20條參數(shù)Table 3 The top 20 parameters of EKGG Pathway enrichment analysis

2.6 關(guān)鍵藥物成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證分析

參萸養(yǎng)心膠囊中Degree排名前三為關(guān)鍵成分和靶點(diǎn)，關(guān)鍵成分木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇與關(guān)鍵靶點(diǎn)TNF、IL6、IL1B 進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。一般認(rèn)為小于-7.0 kcal/mol-1表示有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[8]。關(guān)鍵成分的分子結(jié)構(gòu)，見圖6。分子對(duì)接結(jié)果參數(shù)見表4?？梢暬Y(jié)果展示，見圖7。

表4 關(guān)鍵藥物成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接參數(shù)Table 4 Key drug components-key target molecular docking parameters

圖6 關(guān)鍵成分的分子結(jié)構(gòu)Figure 6 molecular structures of key components

圖7 關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接模式圖Figure 7 Diagram of molecular docking mode of key components key targets

3 討論

本研究篩選出參萸養(yǎng)心膠囊共102 種成分，其中五種重要成分為木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、丹參酮IIA、人參皂甙Rh2。木犀草素是丹參的主要成分。成纖維化細(xì)胞過(guò)度增殖分化是心肌纖維化的主要病理表現(xiàn)，WANG T 等[9]在大鼠成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，木犀草素可以拮抗血管緊張素II刺激成纖維細(xì)胞增殖和膠原的合成，山奈酚屬于黃酮類化合物，是人參的重要成分。DU Y等[10]實(shí)驗(yàn)證實(shí)山奈酚可以通過(guò)減輕血管緊張素II誘導(dǎo)小鼠心臟的炎癥和氧化應(yīng)激來(lái)減少心肌纖維化和心功能障礙。β-谷甾醇是山茱萸和人參的重要成分，WONG HS等[11]發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇通過(guò)線粒體呼吸產(chǎn)生活性氧增強(qiáng)細(xì)胞谷胱甘肽氧化還原循環(huán)來(lái)保護(hù)H9c2細(xì)胞和大鼠心臟免受氧化應(yīng)激的損傷，從而保護(hù)了心功能。丹參酮IIA是丹參的重要成分，ZHANG Y等[12]在小鼠成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)丹參酮IIA通過(guò)抑制β-微管蛋白表達(dá)來(lái)預(yù)防心臟纖維化。人參皂甙Rh2 是人參所含成分，LO SH等[13]在細(xì)胞及Ⅰ型糖尿病模型大鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2通過(guò)激活PPARδ抑制STAT3信號(hào)，最終使心臟纖維化明顯改善。由上討論可見，篩選的參萸養(yǎng)心膠囊重要成分對(duì)抗心肌纖維化具有重要作用。

參萸養(yǎng)心膠囊治療心肌纖維化的交集靶點(diǎn)43個(gè)，核心靶點(diǎn)22 個(gè)，5 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)為TNF、IL6、IL1B、VEG?FA、STAT3。IL6、TNF 為多效應(yīng)的細(xì)胞因子，與炎癥密切相關(guān)。FANG L 等[14]研究發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比，肥厚性心肌病的患者TNF、IL6 水平顯著升高，IL-6 與區(qū)域纖維化相關(guān)。血管緊張素II 是心臟心肌纖維化和心肌肥大重要的致病因素。DUERRSCHMID C等[15]在細(xì)胞及小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)TNF受體1信號(hào)傳導(dǎo)是血管緊張素II誘導(dǎo)的心臟纖維化的關(guān)鍵因素。IL-1β是心臟病中的關(guān)鍵炎癥誘導(dǎo)劑，BR?NNUM H 等[16]細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-1β的增加抑制了TGF-β1 介導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞分化、增殖，從而減輕了心肌纖維化程度。VEGFA是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等作用，TAO H 等[17]實(shí)驗(yàn)證實(shí)Mi?croRNA-29a 通過(guò)靶向VEGFA/MAPK 信號(hào)通路抑制心臟成纖維細(xì)胞增殖，減輕心肌纖維化。STAT3是信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白家族的一員，可以被不同細(xì)胞因子受體激活的蛋白，近年研究表明STAT3 的激活可以通過(guò)如協(xié)同NF-κB作用[18]，增強(qiáng)Notch-1信號(hào)[19]等多種途徑對(duì)心肌纖維化產(chǎn)生重要影響。由上討論可見，篩選的參萸養(yǎng)心膠囊重要靶點(diǎn)對(duì)抗心肌纖維化具有重要作用。

分子對(duì)接結(jié)果顯示參萸養(yǎng)心膠囊中3個(gè)關(guān)鍵成分木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇與3 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)TNF、IL6、IL1B 結(jié)合能均小于—7.0 kcal·mol-1，表明它們具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性，從而在理論上驗(yàn)證了參萸養(yǎng)心膠囊可能通過(guò)上述成分和靶點(diǎn)抗心肌纖維化。

GO 富集分析顯示參萸養(yǎng)心膠囊治療心肌纖維化主要在RNA 聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、基因表達(dá)正調(diào)控、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控等方面起作用。根據(jù)KEGG富集分析前20 項(xiàng)結(jié)果和近年研究報(bào)道：TNF 通路涉及炎癥及參與導(dǎo)致心肌纖維化的聯(lián)級(jí)反應(yīng)[20-22]；激活HIF-1α信號(hào)通路可增強(qiáng)血管緊張素II誘導(dǎo)心臟纖維化作用[23]；通過(guò)增強(qiáng)MAPK 通路致心肌纖維化報(bào)道亦甚多[24-26]。表明參萸養(yǎng)心膠囊可能作用于上述多通路途徑來(lái)抗心肌纖維化。

4 結(jié)論

篩選參萸養(yǎng)心膠囊所含的五個(gè)重要成分和靶點(diǎn)，且分子對(duì)接理論上驗(yàn)證了木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇和TNF、IL6、IL1B相互具有強(qiáng)烈的結(jié)合力，故參萸養(yǎng)心膠囊治療心衰的良好效果，可能源于以木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、丹參酮IIA、人參皂甙Rh2等為代表的多成分，以TNF、IL6、IL1B、VEGFA、STAT3等為代表的核心靶點(diǎn)，以TNF、HIF-1α、MAPK 通路等為代表的多通路，多方面起到協(xié)同抗心肌纖維化的作用。本研究為后續(xù)的臨床與實(shí)驗(yàn)研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)，具有重要的指導(dǎo)意義。

（利益沖突：無(wú)）