香砂六君子丸治療胃輕癱的活性成分和作用機(jī)制

王巧稚，劉校彤，夏朝霞，王 瓊

1.西南醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（瀘州 646000）；2.江陽城建職業(yè)學(xué)院醫(yī)藥康養(yǎng)學(xué)院（瀘州 646100）；3.瀘州市人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科（瀘州 646000）；4.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中葡中醫(yī)藥國際合作中心（瀘州 646000）

胃輕癱綜合征（gastroparesis syndrome，GS）又稱為胃麻痹或者胃無力，是以早飽、腹脹、惡心、發(fā)作性干嘔體重減輕等為主要癥狀，以胃排空延緩為特征的癥狀群。但這一疾病經(jīng)內(nèi)鏡檢查無上消化道的機(jī)械性梗阻或肝膽器質(zhì)性病變[1]。胃輕癱最常見的病因是糖尿病，糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis，DGP）會(huì)加重糖代謝的異常，影響藥物吸收；胃輕癱還可繼發(fā)于手術(shù)和感染等疾病；此外，仍有部分病因不明的特發(fā)性胃輕癱[2]。

由于對(duì)GS 發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚不明確，西醫(yī)對(duì)于胃輕癱的治療主要有：促胃腸動(dòng)力、控制血糖及維持水電解質(zhì)平衡等，臨床上尚無非常有效的治療手段。香砂六君子丸是中醫(yī)治療DGP 的常用方劑之一。香砂六君子丸，源于《古今名醫(yī)方論》中的方劑香砂六君子湯，其功效為益氣健脾，行氣和胃。臨床上常用于治療脾胃氣虛，痰濁中阻所致的胃痛、腹?jié)M腹脹、不思飲食、惡心嘔吐、消瘦和乏力等。有研究表明，香砂六君子丸可明顯改善DGP 患者的臨床癥狀[3]，通過調(diào)節(jié)激素水平及相關(guān)神經(jīng)促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，減輕胃部不適的癥狀，改善患者胃排空時(shí)間[4-5]。但在治療過程中，香砂六君子丸發(fā)揮其藥效作用的相關(guān)活性物質(zhì)和機(jī)制尚不清楚。

近年來，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，分析中藥復(fù)方所含復(fù)雜化學(xué)成分和藥理作用，從整體性對(duì)藥效進(jìn)行評(píng)價(jià)和分析，并對(duì)方劑相關(guān)潛在成分及機(jī)制進(jìn)行研究，是探究中藥有效成分的一種新思路[6]。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)該方劑的成分和相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行分析，探索可能的作用機(jī)制，使用分子對(duì)接對(duì)其進(jìn)行初步驗(yàn)證，為其臨床應(yīng)用及后期實(shí)驗(yàn)研究提供新的思路和依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)來源和檢索分析方法

1.1 數(shù)據(jù)的獲取

選擇GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲取疾病相關(guān)信息；通過TCMSP和TCMID數(shù)據(jù)庫獲取藥物相關(guān)的信息[7-8]。整個(gè)分析過程中用了Ultra-Edit軟件進(jìn)行腳本編寫和處理，Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化；STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析；采用Bioconductor 數(shù)據(jù)庫和R軟件以及Perl軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行后續(xù)處理和分析。

1.2 分析方法

1.2.1 香砂六君子丸的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的構(gòu)建 以“木香、砂仁、半夏、陳皮、人參、炙甘草、白術(shù)、茯苓、生姜、大棗”為關(guān)鍵詞，基于TCMSP數(shù)據(jù)庫以及用戶指南（口服生物利用度≥30%，藥物相似性≥0.18）、TCMID數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)獲取藥物成分以及靶點(diǎn)信息。

1.2.2 胃輕癱和延遲胃排空相關(guān)靶蛋白的數(shù)據(jù)獲取在GeneCards數(shù)據(jù)庫中輸入“胃輕癱（Gastroparesis）”和“延遲胃排空（delayed gastric emptying）”進(jìn)行檢索，下載數(shù)據(jù)保存為Excel格式。

1.2.3 香砂六君子丸和胃輕癱所致延遲胃排空靶蛋白交集的整理 將藥物（香砂六君子丸）與疾病（胃輕癱和延遲胃排空）相關(guān)的靶蛋白，分別整理，形成drug.txt和disease.txt 兩個(gè)文件，在R 軟件中安裝“Venn-Diagram”數(shù)據(jù)包，用Ultra-Edit軟件編輯求交集的腳本并運(yùn)行，輸出兩者交集靶蛋白為Drug_Disease.txt，并繪成交集圖。

1.2.4 構(gòu)建可視化與蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 基于藥物活性成分和靶點(diǎn)之間的關(guān)系，構(gòu)建靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（Protein-protein interaction network，PPInetwork）。使用Cytoscape 3.8.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，用barplot 函數(shù)在R 軟件中繪制核心蛋白靶點(diǎn)圖。通過上述操作得到的Drug_Disease.txt，進(jìn)入STRING 數(shù)據(jù)庫后輸入所有靶蛋白，選擇“Ho?mo sapiens”進(jìn)行搜索且隱藏孤立靶點(diǎn)，以0.4作為最小相關(guān)系數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，得到靶點(diǎn)之間的互作關(guān)系[9]。并且根據(jù)cytoscape中的系數(shù)對(duì)藥物主要活性成分進(jìn)行篩選。

1.2.5 GO和KEGG富集分析 將得到的Drug_Disease.txt，在R 中安裝“DOSE”、“clusterprofiler”、“pathview”數(shù)據(jù)包，使用Ultra-Edit 編輯GO 和KEGG 富集分析的腳本。通過R運(yùn)行后得到GO和KEGG富集分析的結(jié)果圖和相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2.6 主要成分分子對(duì)接 對(duì)基于香砂六君子丸和胃輕癱所構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)模型中關(guān)鍵的成分與靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，首先在PDB（https://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫中獲取主要靶點(diǎn)（IL6、EGFR）的蛋白晶體復(fù)合物，再使用Py?MOL 軟件將兩者中的水分子、磷酸根及其他非活性相關(guān)配體去除，再把原配體從靶蛋白上分離[10]。之后，于PubChem 中搜索小分子并保存其結(jié)構(gòu)。將小分子和靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Auto Dock vina 軟件中保存為PD?BQT格式，然后將小分子與靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接[11]。

2 結(jié)果

2.1 香砂六君子丸-胃輕癱所致延遲胃排空靶點(diǎn)交集

通過檢索及篩選數(shù)據(jù)庫得到活性成分105 種，且去重后得到121個(gè)藥物相關(guān)靶點(diǎn)。經(jīng)GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索并排除重復(fù)靶點(diǎn)后，得到與胃輕癱和延遲胃排空相關(guān)靶點(diǎn)共2 368個(gè)。通過求交集繪制Venn圖，得到藥物與疾病共同靶點(diǎn)92個(gè)，見圖1。

圖1 藥物與疾病靶點(diǎn)交集Venn圖Figure 1 Venn diagram of intersection of drug and disease targets

2.2 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)與PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

2.2.1 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析 用Cytoscape 3.8.0 將中藥、主要活性成分、靶蛋白與疾病的關(guān)系可視化，如圖2所示，藍(lán)色為中藥名（香砂六君子丸XSLJZW），紅色為疾?。ㄎ篙p癱Gastroparesis），紫色顯示的是靶點(diǎn)，綠色顯示的為活性成分。

圖2 藥物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Drug component-targets network diagram

2.2.2 PPI 結(jié)果 通過STRING 數(shù)據(jù)庫，將交集后的92個(gè)關(guān)鍵蛋白進(jìn)行可視化，見圖3。其中，白蛋白（albu?min，ALB）；白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）；細(xì)胞凋亡相關(guān)半胱氨酸肽酶（apoptosis-related cysteine pep?tidase，caspase 3）；表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）；MYC基因（MYC）；絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）；等靶點(diǎn)與較多其他靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)，為核心靶點(diǎn)，見圖4。

圖3 香砂六君子丸與胃輕癱所致延遲胃排空靶點(diǎn)的PPI結(jié)果圖Figure 3 The diagram of PPI network of Xiangsha Liujunzi Pills and Delayed gastric emptying cased by Gastroparesis

圖4 barplot 函數(shù)核心蛋白圖Figure 4 The core protein plot of the barplot function

2.3 GO與KEGG的富集分析結(jié)果

2.3.1 GO結(jié)果 通過富集分析，得到與關(guān)鍵靶蛋白相關(guān)的功能共109種。根據(jù)相關(guān)性分析，香砂六君子丸對(duì)胃輕癱和延遲胃排空的作用主要是通過影響DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活物活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活物活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等發(fā)揮作用，見圖5。

圖5 GO 分析結(jié)果Figure 5 The result of GO analysis

2.3.2 KEGG 結(jié)果 基于關(guān)鍵蛋白，在Bioconductor 數(shù)據(jù)庫中找到相關(guān)通路共120 條。根據(jù)通路中所含的關(guān)鍵蛋白數(shù)量和相關(guān)性評(píng)分，為香砂六君子丸中排名前20 的作用于胃輕癱和延遲胃排空的關(guān)鍵通路，如圖6所示，涉及途徑和通路有：卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染、晚期糖基化終末產(chǎn)物（ad?vanced glycosylation end products，AGEs）-糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor of AGEs，RAGE）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路等。

圖6 KEGG 分析結(jié)果Figure 6 The result of KEGG analysis

2.4 關(guān)鍵小分子活性物質(zhì)與主要靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

將槲皮素與IL6和EGFR進(jìn)行分子對(duì)接，vina評(píng)分的值顯示了蛋白質(zhì)和化合物之間的結(jié)合活性，較低的值代表更大的親和力，對(duì)接結(jié)果顯示出具有良好的親和力，提示香砂六君子丸治療胃輕癱網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建具有較高的準(zhǔn)確性，見表1。對(duì)接結(jié)果可見，槲皮素與IL-6的ARG-30（精氨酸）和ARG-182 各形成一個(gè)氫鍵；槲皮素與EGFR 的ARG-525、ASN-526（天冬酰胺）、MET-477（甲硫氨酸）各形成一個(gè)氫鍵；黃芩素與IL-6的ARG-179 和ARG-182 各形成2 個(gè)氫鍵；黃芩素與ER的MET-477和LEU-408（亮氨酸）各形成一個(gè)氫鍵；β-谷甾醇與EGFR的CYS-481（半胱氨酸）形成一個(gè)氫鍵，見圖7。

圖7 小分子活性物質(zhì)與靶蛋白對(duì)接結(jié)果圖Figure 7 Diagrams of Molecular docking results

表1 小分子與主要靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果Table 1 Docking results of small molecules with major targets

3 討論

香砂六君丸脫胎于傳統(tǒng)的香砂六君子湯，其中木香可消食、行氣止痛，可用于胸脅脘痛[12]；人參健脾益氣、溫甘養(yǎng)胃；白術(shù)可利水潤燥、益胃健脾，助益氣推送之力[13]；茯苓健脾滲濕；陳皮祛痰降氣；砂仁溫中醒脾；半夏止嘔祛濕；炙甘草能和中溫胃。白術(shù)對(duì)胃腸道具有雙向調(diào)節(jié)作用，機(jī)制可能與腸神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)及分泌，胃腸道的激素分泌或者相互協(xié)同作用相關(guān)[14]。

由胃竇和小腸上皮G 細(xì)胞分泌的胃泌素（gastrin，GAS）也在DGP 中有一席之地，它的主要功能是：刺激胃酸分泌和胃腸運(yùn)動(dòng)，為泌酸區(qū)胃黏膜提供營養(yǎng)支持[15-17]。當(dāng)血糖出現(xiàn)升高時(shí)，生長抑素的分泌水平降低，其對(duì)GAS 分泌的抑制作用減弱，故糖尿病胃輕癱患者常伴GAS水平增高[16]。目前有研究表明，香砂六君子湯治療DGP的機(jī)制與通過抑制胃動(dòng)素和胃泌素的分泌從而加快胃腸運(yùn)動(dòng)有關(guān)[18]。不僅如此，炎癥也是DGP患者中導(dǎo)致胃排出延遲的重要原因之一，其中IL-6、IL-10 和TNF-α起著至關(guān)重要的作用[19-20]。

本次研究獲得香砂六君子丸作用于胃輕癱的對(duì)應(yīng)活性成分共105 種，其中有較多潛在靶點(diǎn)的有：槲皮素、乙酰氧基蒼術(shù)酮、黃芩素等天然黃酮類化合物，以及β-谷甾醇和6-甲基姜辣二醇雙乙酸酯（6-methylgin?gediacetate2）等甾醇類的組分，這些成分具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等作用[21-22]。有研究表明，槲皮素可消除活性氧自由基，降低炎癥因子分泌[23-24]，以及改善胰島素抵抗，增強(qiáng)胰島素的敏感性[25-26]。黃芩素可以下調(diào)炎性因子如IL-6、TNF-α的表達(dá)水平，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，抑制P38的磷酸化及相關(guān)通路發(fā)揮其抗炎作用，此外，黃芩素對(duì)酸化的乙醇誘導(dǎo)的胃損傷顯示出保護(hù)作用，可以增加胃黏液分泌并且降低胃酸分泌[27-29]。同樣的，β-谷甾醇在抑制炎性細(xì)胞和炎性因子上也有突出表現(xiàn)，有研究表明其可通過抑制CAS1的產(chǎn)生及MAPK信號(hào)通路的活化來產(chǎn)生作用[30]；此外，β-谷甾醇還可以增加胰島素的分泌和活性，促進(jìn)脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收，并且還可以促進(jìn)脂肪溶解，還可以降低C 反應(yīng)蛋白含量，下調(diào)血管細(xì)胞黏附因子起到抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[31-32]。

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選出了疾病相關(guān)的靶點(diǎn)，選取了有較高系數(shù)的IL-6 和EGFR 與通過網(wǎng)絡(luò)分析所得的槲皮素、黃芩素以及β-谷甾醇進(jìn)行分子對(duì)接模型驗(yàn)證。分子對(duì)接的結(jié)果顯示：槲皮素和黃芩素與IL-6、EGFR 都具有良好的親和力，β-谷甾醇與EG?FR有較好的親和力。這更加深入地顯示出這三種活性成分與靶蛋白之間的緊密作用關(guān)系，并且表明本文前述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果有一定的可靠性。對(duì)接的結(jié)果提示這些成分可能通過影響EGFR和IL-6的表達(dá)來調(diào)節(jié)胃輕癱和延遲胃排空的炎癥反應(yīng)。上述分析結(jié)果與文獻(xiàn)所述的藥理學(xué)作用及部分通路驗(yàn)證結(jié)果一致，進(jìn)一步的說明了本研究的可靠性。

利用網(wǎng)藥分析中藥復(fù)方治療胃輕癱疾病已有相關(guān)研究。如用加味桃核承氣湯防治[33]，半夏瀉心湯治療糖尿病胃輕癱[34]，分析結(jié)果顯示半夏瀉心湯活性成分中對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)較多的為槲皮素、漢黃芩素、山奈酚，與本文所分析的活性成分類似。今后可考慮在槲皮素、黃芩素等單一成分上進(jìn)行深入實(shí)驗(yàn)研究。

4 結(jié)論

本文通過分析藥物與疾病靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，有效地揭示了香砂六君子丸治療胃輕癱導(dǎo)致延遲胃排空的可能機(jī)制。胃輕癱的主要病因是糖尿病，且與炎癥反應(yīng)相關(guān)，根據(jù)分析結(jié)果，推測(cè)該方劑中槲皮素、黃芩素以及β-谷甾醇等活性成分可能作用于ALB、IL-6、CASP3、EGFR、MYC、MAPK8和VRGFA等靶點(diǎn)，涉及有卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染通路、TNF 及AGE-RAGE 信號(hào)通路，雖然網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析具有一定的局限性，但本文結(jié)果還是為進(jìn)一步探討潛在機(jī)制和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了重要的參考依據(jù)。

（利益沖突：無）